一种胃癌新型分子标记物hsa_circ_0074362的检测及应用的制作方法

本发明涉及一种胃癌组织中环状RNA检测方法，尤其涉及一种荧光染料法实时定量RT-PCR检测胃癌组织中环状RNA的方法及其应用。

背景技术：

胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，每年约有100万个新发病例，男性胃癌的死亡率为各种肿瘤的第二位，女性则为第四位【Chen W,Zheng R,Zeng H,Zhang S,He J.Annual report on status of cancer in China,2011.Chin J Cancer Res,2015,27(1):2-12.】。而我国是胃癌的高发区，每年我国新发现40万胃癌患者，约占世界胃癌发病人数的42％左右。由于胃癌早期症状不明显，又缺乏特异的早期诊断方法【di Mario F et al.Non-invasive tests in gastric diseases.Dig Liver Dis 40：523-530(2008)】，现有的肿瘤标志物CEA、CA19-9、CA50、CA125在胃癌中的敏感度与特异性不高，对胃癌具较高特异性的CA72-4也通常在胃癌的III-IV期增高。胃癌的明确诊断通常在疾病的进展期才能做出，而此时病人的平均生存期只有7～9个月【Wagner AD et al.Chemotherapy in advanced gastric cancer：a systematic review and meta-analysis based on aggregate data.J Clin Oncol.24：2903-2909(2006)】。因而寻找利于早期诊断和早期治疗的生物标志物一直是胃癌研究的热点，如lncRNAs。但随着肿瘤分子生物学研究的深入，科学家逐渐将目光转向环状RNA(circular RNA，circRNA)，因其在致癌与肿瘤抑制途径中显露出的潜在作用而成为肿瘤研究的新热点，circRNA是区别于传统线性RNA的RNA家族新成员，不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。最新研究表明，circRNA具有闭合环状结构，主要通过非典型可变剪切加工产生，广泛存在于各种生物细胞中，具有结构稳定，难以被RNA酶降解、表达丰度高、物种间保守性好，表达具有组织及时空特异性等特征，这些特点使得circRNA在疾病诊断与治疗新型方法的开发应用上具有广阔的前景。

技术实现要素：

本发明所要解决的一个技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种hsa_circ_0074362作为胃癌检测中的分子标记物，利用该分子标记物可以简单、快捷地进行胃癌诊断。

本发明所要解决的另一个技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种在胃癌组织中检测hsa_circ_0074362的方法。

本发明所要解决的又一个技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种hsa_circ_0074362在胃癌诊断中的应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：用于胃癌检测的环状RNA分子标记物，其特征在于：该环状RNA为hsa_circ_0074362，其在基因组上的定位为：chr5:142264862-142311690，相应的线性基因为ARHGAP26(NM_015071)，该环状RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步地，所述hsa_circ_0074362在胃癌患者癌组织中的特异性表达水平下调。

本发明还提供一种检测环状RNA分子标记物的方法，其特征在于所述的方法包括如下步骤：

(1)采集胃癌组织，称取组织，提取组织中的总RNA；

(2)将总RNA逆转录成cDNA；

(3)将cDNA进行荧光染料法实时定量PCR检测，反应结束后检测样品中环状RNA hsa_circ_0074362和看家基因GAPDH的Ct值；

(4)根据Ct值，通过看家基因GAPDH的表达水平来均一化circRNA的水平，计算得到组织中hsa_circ_0074362的相对表达水平，并使用2^ΔCt公式来计算hsa_circ_0074362的PCR相对定量值，式中ΔCt＝Ct_{hsa_circ_0074362}-Ct_GAPDH；

(5)当样本中的hsa_circ_0074362生物标志物的PCR相对定量值ΔCt小于或等于12.17时，则认为是非胃癌样本；大于12.17时，则认为是胃癌样本。

进一步地，所述步骤(3)中的hsa_circ_0074362的特异性背对背引物为：

P1：5’-AGCTTTGTCGGAAGAGGACC-3’；

P2：5’-TCCTTGGCCAGTTCGTAACC-3’。

进一步地，所述步骤(3)中的看家基因GAPDH的特异性扩增上下游引物为：

P3：5’-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3’；

P4：5’-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3’。

其中，所述步骤(1)中提取胃癌组织中总RNA的过程如下：

a.收集组织：胃癌组织收集在加入了RNA保存液的无菌离心管中，若不即时使用则存放在-80℃超低温冰箱中；

b.释放RNA：称取约20mg组织放置于2mL离心管中，置于冰上加入1mL TRIzol，将组织充分匀浆至无固体，室温静置10分钟，使组织中的RNA充分释放至溶液中；

c.氯仿提取：加入0.2mL三氯甲烷，涡旋震荡混匀，室温静置10分钟；4℃下，13000rpm离心10分钟，此时液体分层，其中上层水相中富集了RNA，小心吸取上层水相至1.5mL RNase-free离心管中；

d.异丙醇沉淀：加入等体积异丙醇，涡旋震荡混匀，4℃下静置30分钟，12000rpm在4℃下离心10分钟，弃上清；

e，乙醇洗涤：加入1mL75％的乙醇，混匀，12000rpm在4℃下离心5分钟，弃上清，最后加入适量RNase-free水溶解沉淀，即为组织中总RNA提取液，-80℃保存备用。弃上清留取沉淀这一步很重要，因为此时的沉淀溶解之后就是所需要的RNA，而上清中含有许多被乙醇溶解的杂质，若有残余则影响了纯度，过分吸吸取影响了浓度。本发明采用倾倒，移液枪吸取，室温放置干燥5分钟相结合的方式确保上清被完全去除，保证了所提总RNA的浓度和纯度。

进一步地，所述步骤(3)中荧光定量PCR反应条件如下：先95℃预变性5分钟；然后95℃变性15秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，40个循环；最后95℃变性1分钟，55℃退火30秒，95℃酶变性30秒，4℃保温。

本发明还提供一种环状RNA分子标记物在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。该试剂盒可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如Taq酶、dNTP混合液、荧光试剂、PCR缓冲液、DEPC处理水。

与现有技术相比，本发明的优点在于在胃癌患者组织中的特异性表达下调的hsa_circ_0074362可作为胃癌诊断的新型分子标记物，利用该分子标记物可以简单、快捷地进行胃癌诊断，通过使用市售TRIzol、氯仿等试剂，采用多种方法相结合干燥沉淀，就能提取出浓度、纯度较高的RNA，仅需收集20mg胃癌组织即可检测环状RNA，成为胃癌检测诊断、病理分级、临床分期、治疗疗效判断的有效工具，具有良好的临床应用前景，而采取的实时定量PCR仪器是一种常见仪器，荧光染料法不需要另行设计探针即可同时检测目的环状RNA和看家基因，经济、方便，本发明提供的方法，对进一步研究胃癌相关环状RNA的生物学机制具有重要意义。

附图说明

图1为本发明胃癌组织circRNA检测结果图；

图2为本发明实施例二中正常组织和胃癌组织中hsa_circ_007436和GAPDH的荧光信号曲线图；

图3为荧光定量RT-PCR验证胃癌组织异常表达的circRNA，其中circRNA hsa_circ-_0074362的表达在扩大标本验证实验中显著下调(P＝0.0024)；

图4为检测127例胃癌患者胃癌组织及其癌旁组织hsa_circ_00074362水平，而制作的ROC曲线。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例一：检测hsa_circ_0074362在胃癌组织和正常胃组织中的表达情况：

1、芯片分析：采用美国Arraystar公司的Human circRNA Array(6×7K)芯片检测胃癌组织和正常组织中circRNA的水平。

2、芯片结果：结果如图1及表格1所示。

表1胃癌组织中差异表达的典型circRNA(P<0.05)

3、结果分析：hsa_circ_0074362在胃癌组织和正常组织中二者差异达7.75倍，提示hsa_circ_0074362在胃癌中可能作为一个抑癌基因发挥作用。

实施例二：采集正常胃组织作为正常对照组，按照如下步骤进行环状RNA的检测，包括以下步骤：

a.收集组织：胃癌组织收集在加入了RNA保存液的无菌离心管中，不及时使用时存放在-80℃超低温冰箱中；

b.释放RNA：称取约20mg组织放置于2mL离心管中，置于冰上加入1mL TRIzol。使用手持式自动匀浆机将组织充分匀浆至无固体，室温静置10分钟，使组织中的RNA充分释放至溶液中；

c.氯仿提取：加入0.2mL三氯甲烷，涡旋震荡混匀，室温静置10分钟；4℃下，13000rpm离心10分钟，此时液体分层，其中上层水相中富集了RNA,小心吸取上层水相至1.5mL RNase-free离心管中；

d.异丙醇沉淀：加入等体积异丙醇，涡旋震荡混匀，4℃下静置30分钟，12000rpm在4℃下离心10分钟，弃上清；

e.乙醇洗涤：加入1mL75％的乙醇，混匀，12000rpm在4℃下离心5分钟，弃上清，弃尽上清，采取先倾倒，再用移液枪吸取，最后放置干燥的方法，最后加入适量RNase-free水溶解沉淀，即为组织中总RNA提取液，-80℃保存备用；

f.RNA逆转录：使用逆转录试剂盒对上述步骤e提取出的RNA进行逆转录，得到cDNA，保存于-20℃备用；

g.荧光染料法实时定量PCR检测：将上述步骤f获得的cDNA按照表2的配比加入反应体系中，并按照表3的程序设定进行PCR参数。

表2.PCR体系

表3.PCR参数

如图2所示，正常组织和胃癌组织中hsa_circ_007436和GAPDH均得到有效扩增。由计算公式ΔCt＝Ct_{hsa_circ_0074362}-Ct_GAPDH可得出正常组织的ΔCt＝11.43；胃癌组织的ΔCt＝12.45，明显大于正常组织的ΔCt值，说明胃癌组织中hsa_circ_007436表达量低于正常胃组织中的表达量，这里可以得出正常组织与胃癌组织中hsa_circ_007436表达量的对比，与基因芯片的结果应该是一致的。

实施例三应用hsa_circ_0074362生物标志物进行胃癌检测的方法

步骤包括：

1、收集组织样本；

2、胃癌组织中环状RNA的提取(提取方法如同实施例二)；

3、反转录和荧光定量PCR反应如同按照实施例2中的“反转录和荧光定量反应”进行操作；

4、以hsa_circ_0074362作为胃癌检测的生物标志物，分析127例胃癌患者癌组织与其癌旁组织中hsa_circ_00074362的表达水平。胃癌患者组hsa_circ_00074362的ΔCt明显高于正常组，P<0.0001，证明其hsa_circ_00074362的表达水平明显低于正常组，如图3所示。hsa_circ_00074362作为胃癌标志物的截断值为12.17，当样本中的hsa_circ_0074362生物标志物的PCR相对定量值ΔCt小于或等于12.17时，则认为是非胃癌样本；大于12.17时，则认为是胃癌样本。

检测127例胃癌患者胃癌组织及其癌旁组织hsa_circ_00074362水平，制作ROC曲线，如图4所示，AUC值为0.630，P<0.001。表4为hsa_circ_00074362为生物标志物进行胃癌诊断的结果，可得出hsa_circ_00074362作为胃癌标记物的灵敏度为36.2％，特异度为84.3％。

表4.hsa_circ_00074362为生物标志物进行胃癌诊断的结果

实施例四检测试剂盒及应用

本实施例中的用于胃癌检测的hsa_circ_0074362生物标志物检测试剂盒，除含有常规实时定量PCR试剂之外，还包括外参的检测引物和hsa_circ_0074362的检测引物。其中，常规实时定量PCR试剂包括Taq酶、dNTP试剂、荧光试剂、PCR缓冲液、DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水(RNase free water)。

利用上述检测试剂盒进行检测时，其具体的操作方法可参照实施例2的操作方法进行样本的检测和胃癌的判断，其中，“收集血清样本”步骤中的离心条件还可以为：4℃下900g离心5分钟；再次吸取上清转至洁净的1.5mL离心管中，4℃下16000g离心5分钟。

应用本实施例中的检测试剂盒可以简单、快速、便利地进行hsa_circ_0074362生物标志物的检测，以判断胃癌情况，便于治疗。

序列表

<110> 宁波大学

<120>一种胃癌新型分子标记物hsa_circ_0074362的检测及应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 723

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<220> 人工序列

<400> 1

GAAGCCAAAA AGAAGTATGA CAAAGAGACA GAAAAGTATT GTGGCATCTT AGAAAAACAC 60

TTGAATTTGT CTTCCAAAAA GAAAGAATCT CAGCTTCAGG AGGCAGACAG CCAAGTGGAC 120

CTGGTCCGGC AGCATTTCTA TGAAGTATCC CTGGAATATG TCTTCAAGGT GCAGGAAGTC 180

CAAGAGAGAA AGATGTTTGA GTTTGTGGAG CCTCTGCTGG CCTTCCTGCA AGGACTCTTC 240

ACTTTCTATC ACCATGGTTA CGAACTGGCC AAGGATTTCG GGGACTTCAA GACACAGTTA 300

ACCATTAGCA TACAGAACAC AAGAAATCGC TTTGAAGGCA CTAGATCAGA AGTGGAATCA 360

CTGATGAAAA AGATGAAGGA GAATCCCCTT GAGCACAAGA CCATCAGTCC CTACACCATG 420

GAGGGATACC TCTACGTGCA GGAGAAACGT CACTTTGGAA CTTCTTGGGT GAAGCACTAC 480

TGTACATATC AACGGGATTC CAAACAAATC ACCATGGTAC CATTTGACCA AAAGTCAGGA 540

GGAAAAGGGG GAGAAGATGA ATCAGTTATC CTCAAATCCT GCACACGGCG GAAAACAGAC 600

TCCATTGAGA AGAGGTTTTG CTTTGATGTG GAAGCAGTAG ACAGGCCAGG GGTTATCACC 660

ATGCAAGCTT TGTCGGAAGA GGACCGGAGG CTCTGGATGG AAGCCATGGA TGGCCGGGAA 720

CCT 723