本发明涉及一种新型慢病毒包装方法，属于生物技术领域。
背景技术：
慢病毒属是反转录病毒科下的一个属，包括8种能够感染人和脊椎动物的病毒，原发感染的细胞以淋巴细胞和巨噬细胞为主，感染个体最终发病。慢病毒感染的显著特点是感染个体在出现典型的临床症状之前，大多经历长达数年的潜伏期，之后缓慢发病，因此这些病原体被称为慢病毒。例如人类免疫缺陷病毒(HⅣ)、猴免疫缺陷病毒(SⅣ)、马传染性贫血(EIA)、猫免疫缺陷病毒(FⅣ)都是慢病毒属，慢病毒属的原文是Lentivirus，其中Lenti-在拉丁文中有慢的意思。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
现有技术中，常规的慢病毒包装方法如下：
第一天
A、10cm的组织培养板上，12ml培养基，接种2×106个293T细胞。37度，5％二氧化碳条件下过夜培养，准备用质粒转染细胞。
第二天
B、因为转染的混合物应该培养12-15小时，所以下午晚一点完成转染。
C、在聚丙烯离心管(不使用聚苯乙烯管)中，加入以下质粒，混合每个转染离心管，
10ug小片段RNA质粒
20ug包装质粒
20ug包膜蛋白质粒
20ul无血清培养基补足体积。
D、用无血清的培养基混合好FuGENE转染试剂。
E、加80ul的FuGENE混合物到转染离心管中，总体积100ul，直接吸的混合液加到液体中，不要加到壁上，轻轻旋转离心管。
F、室温放置20-30分钟。
G、温育器中得到293FT细胞，这些细胞在不含有抗生素的DMEM中的融合度是50-80％。
H、不要碰盘的两边，温和地加DNA，FuGENE一滴一滴的混合到细胞中，因为不能将细胞从板上驱走，所以涡旋混合，不要剧烈混合。
I.、37度，5％二氧化碳培养12-15小时。
第三天
J、早上，换培养基，移走转染试剂，加进去5ml新鲜的DMEM，10％FBS，青霉素，链霉素混合液，在从平板的边上吸培养基，不要碰到转染的细胞。
K、37度，5％二氧化碳培养24小时。
第四天
L、从细胞中收获的培养液，转移到聚丙烯管中保存，培养液中含有慢病毒，4度保存。
M、加5ml含有抗生素的新鲜培养基到细胞中，37度，5％二氧化碳条件下保存。
第五天
N、从细胞中收获培养液和第四天收获的培养液，1250转离心5分钟，收集293T细胞，可以通过0.45um过滤器过滤细胞，代替离心，不要用0.2um过滤，因为病毒可能被切断。
O、病毒可以保存在4度，长期保存可以在-20度或者-80度。
这种现有的病毒包装方法，传代不确定，转染融合度不是很高，完成包装的时间比较长，纯化到的病毒的滴度比较低等问题，可能会导致不能满足客户下游实验的要求。新方法可以在这些方面得到改进，提高转染融合度，缩短包装时间，以及提高了病毒的滴度等，解决了常规方法的弊端。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，而提供一种转染融合度高，缩短包装时间，病毒滴度提高的新型慢病毒包装方法。
本发明解决上述问题所采用的技术方案是：该新型慢病毒包装方法，其特征在于，由下述步骤组成：
第一天
(1)10cm的组织培养板上，12ml培养基，接种2×106个293T细胞，37度，5％二氧化碳条件下培养，准备用质粒转染细胞，尽管细胞应该在加有青霉素和链霉素，DMEM(改良杜氏伊格尔培养基)和10％FBS培养基中培养，但是这一步是不加抗生素的DMEM和10％的FBS的培养基；
第二天
(2)转染的混合物培养12-15小时，下午晚一点完成转染；
(3)在聚丙烯离心管中，加入以下质粒，然后混匀，
10ug小片段RNA质粒，
40ug包装质粒，
20ug包膜蛋白质粒，
用100mM氯化钠补足体积100μL，确定小片段RNA质粒、包装质粒、包膜蛋白质粒的比例对最佳的病毒生产是至关重要的，该比例配比下，病毒的生产量大，用时少；
(4)用氯化钠混合好Biomiga GenetranⅢ转染试剂，配置Biomiga GenetranⅢ和氯化钠的混合液；
(5)加80μL的Biomiga GenetranⅢ和氯化钠混合物到转染离心管中，总体积180μL，轻轻旋转离心管；
(6)室温放置20-30分钟；
(7)从培养板中吸走培养基，然后加8ml的新鲜培养基，半个小时内加50μL仲丁巴比安，混匀；
(8)37度，5％二氧化碳培养48-60小时；
第三天
(9)72小时后，收集病毒，3000转，4度离心10分钟，将上清转移到15ml的离心管中。
本发明所述每个转染离心管反应需要6μL的Biomiga GenetranⅢ和74μL的氯化钠。
本发明所述Biomiga GenetranⅢ和氯化钠的混合方法为，在一个聚丙烯管中，先加氯化钠，直接吸氯化钠，被稀释之前的Biomiga GenetranⅢ不能接触到管壁，然后轻轻旋转移动离心管，室温放5分钟。
本发明的优点为：转染融合度高，缩短包装时间，病毒滴度提高。具体为：
1、本发明的小片段RNA质粒，40ug包装质粒，20ug包膜蛋白质粒配比合理，对病毒生产至关重要，转染融合度高；
2、本发明的慢病毒包装方法的步骤减少，缩短包装时间，可提高效率，现有技术中的慢病毒包装方法需要5天，而本发明缩短至3天；
3、本发明的慢病毒包装方法，病毒滴度提高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是采用本实施例中的慢病毒包装方法的病毒观测。
图2是现有技术中的慢病毒包装方法的病毒观测。
具体实施方式
下面结合附图并通过实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
实施例1。
本实施例的新型慢病毒包装方法由下述步骤组成：
(1)10cm的组织培养板上，12ml培养基，接种2×106个293T细胞，37度，5％二氧化碳条件下培养，准备用质粒转染细胞；
(2)转染的混合物培养12-15小时；
(3)在聚丙烯离心管中，加入以下质粒，然后混匀，
10ug小片段RNA质粒，
40ug包装质粒，
20ug包膜蛋白质粒，
用100mM氯化钠补足体积100μL；
(4)用氯化钠混合好Biomiga GenetranⅢ转染试剂，配置Biomiga GenetranⅢ和氯化钠的混合液；
(5)加80μL的Biomiga GenetranⅢ和氯化钠混合物到转染离心管中，总体积180μL，轻轻旋转离心管；
(6)室温放置20-30分钟；
(7)从培养板中吸走培养基，然后加8ml的新鲜培养基，半个小时内加50μL仲丁巴比安，混匀；
(8)37度，5％二氧化碳培养48-60小时；
(9)72小时后，收集病毒，3000转，4度离心10分钟，将上清转移到15ml的离心管中。
(10)病毒可以保存在4度，长期保存可以保存在-20度或者-80度。
本实施例中的每个转染离心管反应需要6μL的Biomiga GenetranⅢ和74μL的氯化钠。
本实施例中的Biomiga GenetranⅢ和氯化钠的混合方法为，在一个聚丙烯管中，先加氯化钠，直接吸氯化钠，被稀释之前的Biomiga GenetranⅢ不能接触到管壁，然后轻轻旋转移动离心管，室温放5分钟。
本实施例中所用的转染试剂Biomiga GenetranⅢ，是阳离子脂质体复合物，使用绿色荧光蛋白作为标记，用标准病毒滴定法滴定病毒的上清，如图1和图2所示
图1采用本实施例中的慢病毒包装方法1.5*107转导单位/毫升，总的病毒颗粒是1.2*108；
图2是现有技术中的标准方法8*105转导单位/毫升，总的病毒颗粒是1.6*107。
通过上述对比，采用本实施例中的慢病毒包装方法，病毒的滴定大大提高。
本实施例中所指的阳离子脂质体，由一个单一阳离子两亲化合物和一个中性脂质组成，此为现有技术，此处不再赘述。
本说明书中所描述的以上内容仅仅是对本发明所作的举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明说明书的内容或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。