一种毛发再生诱导液及其制备方法和应用与流程

本发明涉及干细胞及脱发治疗技术领域，具体涉及一种间充质干细胞条件培养基的毛发再生诱导液，及其制备方法和应用。

背景技术：

脱发是一个常见的令人困扰的问题，它是由包括基因、激素、外伤和医源性的事件等一系列复杂的原因造成的。在所有的脱发案例中，雄性秃头的比例上升到了71％。当前针对脱发患者有几种治疗选择，如使用口服或者外用药物，或者进行手术治疗。然而，药物治疗只能短暂的缓解症状，当病人停止用药后头发又会开始脱落。采用自体的单个毛囊和毛囊单位移植是一种可靠的手术治疗方法，但是毛囊供体的数量是有限的，并且毛囊移植存活率低。因此，脱发治疗急需一些新的治疗手段。

毛囊是一种会经历生长、衰退、休眠的循环过程的再生系统，它是由真皮和表皮两部分组成。真皮乳突(DP)细胞是真皮部分的主要构成部件，被视为负责维持头发生长和控制毛囊周期的主要信号中心。微环境能够影响DP细胞促进毛发生长，恶劣的微环境会导致毛发的脱落。人类男性的雄激素源性脱发大多有完整的毛囊干细胞，主要是由于DP信号通路缺失导致毛囊生长期不能开始。因此，恢复DP细胞诱导毛发生长的能力对于治疗脱发至关重要。

毛发周期和再生是周期性组织重构的复杂过程，它涉及到生长因子、细胞因子、激素、黏附分子和相关的酶。MSC是间充质干细胞，已被广泛应用于再生医学。越来越多的体外和体内研究显示MSC的分泌物有着广泛的生物功能，MSC在再生和修复过程中分泌许多有用的生长因子，它们能够辅助激活DP细胞的毛发诱导能力。前人的研究中，已成功的制备条件培养基MSC-CM。使用MSC-CM加快了毛发周期，增加了体内毛发诱导相关基因的表达，并且恢复DP细胞被破坏的毛发诱导能力。

日本毛囊单位体外培养技术。他们采用病毒感染方法，用转录因子将自体成纤维细胞诱导成IPS，再诱导成毛囊干细胞或者DP细胞。这样可以批量生产毛囊单位。但这种技术存在一定的不足，首先它需要经过IPS阶段，这需要运用转录因子及基因的方法，存在癌变的可能性，并且这种技术诱导效率低，达不到临床治疗的目的。

此外，通过毛囊生发中心毛囊细胞在体外构建毛囊，在动物和人体身上均取得了成功，但DP细胞在体外大量培养技术还未得到实现。

基于上述缺点，本发明提供了一种毛发再生诱导液，用于治疗脱发和斑秃。

技术实现要素：

基于现有技术中药物治疗，只能短暂的缓解脱发症状；和自体毛囊和毛囊单位移植的数量有限，并且存活率低不能治疗脱发的问题，本发明提供了一种毛发再生诱导液及其制备方法。

本发明采用下述技术方案：

一种毛发再生诱导液，其为过表达人的无翅型小鼠乳房肿瘤病毒整合位点7a(Wnt7a)基因的脐带间充质干细胞的条件培养基，其特征为包含毛囊再生需要的起始信号Wnt7a蛋白、再生因子和毛囊再生蛋白。所述Wnt7a基因的核苷酸序列包括(i)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1相比具有至少85％序列一致性；(ii)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：2相比具有至少85％序列一致性；(iii)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3相比具有90％的序列一致性。所述Wnt7a基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；所述Wnt7a基因的核苷酸序列编码的多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO：3。

一种毛发再生诱导液的制备方法，所述制备方法包括：(a)构建含有Wnt7a基因的逆转录病毒载体，其中所述Wnt7a基因的核苷酸序列包括(i)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1相比具有至少85％序列一致性；(ii)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：2相比具有至少85％序列一致性；(iii)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3相比具有90％的序列一致性；(b)所述构建的逆转录病毒载体侵入HEK293FT细胞并扩增，收集富含所述Wnt7a基因病毒颗粒的细胞上清液，获得浓缩的含有Wnt7a基因的病毒；(c)用步骤(b)中所述含有Wnt7a基因的病毒的培养基和8mg/mL混合聚凝胺处理50-60％融合的脐带间充质干细胞，补充无血清DMEM培养基，24h后收集被所述含有Wnt7a基因病毒转染的脐带间充质干细胞的条件培养基；和(d)将步骤(c)中所述条件培养基在3000rpm下离心10min，移除细胞碎片，然后用一个7-kDa分子量截止袋式过滤器在PEG 20000，4℃下透析，把所述条件培养基浓缩20倍，制成毛发诱导再生液。所述Wnt7a基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；所述Wnt7a基因的核苷酸序列编码的多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO：3。

所述毛发再生诱导液可以制成冻干粉末，置于4℃保存。

上述的毛发再生诱导液的应用，所述毛发再生诱导液可用于治疗脱发、斑秃。

本发明的有益效果：

本发明提供的毛发再生诱导液是通过收集过表达WNT7a基因的脐带间充质干细胞的条件培养基，经过浓缩纯化而成的，其特征是不但富含毛囊再生需要的起始信号Wnt7a蛋白，而且还富含多种再生因子以及参与毛囊再生的蛋白。所述毛发再生诱导液可以诱导DP细胞体外生长，可以促进毛发的再生和增加毛发的数量。可将所述毛发再生诱导液制成干粉，易于维持培养液的活性，并且易于保存。

附图说明：

图1.Wnt7a在MSC和Wnt7a处理的MSC中mRNA和蛋白质表达量的变化。A.和C.RT-PCR分析Wnt7a的表达和相应的半定量分析数据，B.和D.免疫印迹来测定Wnt7a蛋白的表达和相应的半定量分析数据，E.MSC和Wnt-CM条件培养基中Wnt7a蛋白的水平。

图2.不同处理中，小鼠背部色素沉积和毛囊结构变化图。A.处理7天时，小鼠背部色素沉积图片，B.处理14天时，小鼠背部色素沉积图片，C.处理3天时，HE染色的小鼠背部毛囊结构，D.处理7天时，HE染色的小鼠背部毛囊结构，E.处理14天时，DEME处理组小鼠背部毛囊结构，F.处理14天时，MSC-CM处理组小鼠背部毛囊结构，G.处理14天时，Wnt-CM处理组小鼠背部毛囊结构，H、I和J.分别为E、F和G的局部结构图。

图3.不同处理中HE染色的小鼠毛囊和毛干数量变化图。A.小鼠毛囊的数量，B.小鼠毛干的数量，C.定量分析毛囊数量D.定量分析毛干数量

图4.免疫组织化学分析法解析的ALP、Ki67和K15在小鼠背部皮肤的表达状况。A.ALP在第3天和第5天时在小鼠背部皮肤的皮脂腺(SG)和DP区域的表达表达状况，B.Ki67在小鼠背部皮肤的表达状况，C K15在小鼠背部皮肤的表达状况，SG指皮脂腺，DP指真皮乳突，Bulk指毛囊球部。

图5.Wnt-CM诱导DP细胞体外生长状况。A.从C57BL/6小鼠的触须中分离出来的DP细胞在含有10％的FBS的DMEM中培养；B.DP细胞在P1代和P3代分别和DMEM，MSC-CM和Wnt-CM一起培养时，ALP的染色活性。

详细说明

条件培养基：在细胞培养过程中，该细胞可能会分泌活性物质到培养液中，其中细胞因子是主要的活性物质之一，这种培养过某种细胞或组织以后，含有细胞分泌物的培养液就叫做条件培养液。利用条件培养液可有效提高细胞或组织体外培养的成功率，而且不同来源的条件培养液对不同细胞、组织有不同的促进或抑制作用。

碱性磷酸酶(ALP)，是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。Ki-67是一种由MKI-67基因编码的核蛋白质，提示细胞的增殖活跃程度。ALP、Ki67和K15分别是在此作为生长期DP细胞、细胞增值和毛囊干细胞的典型标志，它们在毛发再生的不同阶段被表达。OCT包埋剂英文全称：optimal cutting temperature compound，是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物。

本发明中用到的实验方法包括：定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)、免疫蛋白印迹分析(Western blot analysis)和酶联免疫吸附测定(ELISA)确定Wnt7a基因的表达量和Wnt7a蛋白的表达量；采用碱性磷酸酶(ALP)活性、组织学分析、免疫组织化学和组织形态测量学确定小鼠背部毛囊和毛干的生长状况。

qRT-PCR，取处理过的皮肤组织和DP细胞，用RNeasy Mini Kit将RNA分离出来，使用qRT-PCR确定转录表达，并用Gapdh归一化。

免疫蛋白印迹分析(Western blot)，得到未处理的MSC和逆转录病毒感染的MSC，主抗体使用兔多克隆抗体Wnt-1和鼠单克隆抗体Gapdh，次抗体使用山羊抗兔和山羊抗鼠IgG。用ImageJ软件对印迹进行分析。

酶联免疫吸附测定(ELISA)，使用Wnt7a免疫试剂盒测定细胞培养上清液中Wnt7a蛋白质的水平。在转染后，条件培养基被收集。MSC-CM和Wnt-CM被加入，室温下培养2h。Wnt7a表达水平根据厂商协议来确定，吸收率在450nm下使用ELISA仪器测定。

碱性磷酸酶(ALP)活性，使用ALP检测工具箱检测冰冻切片(8um厚)的ALP活性。简述步骤如下：用4％多聚甲醛固定冰冻切片，用PBS缓冲剂冲洗，室温黑暗条件下在包含Fast Red Violet和萘酚AS-BI磷酸盐的溶液中孵育15min；再次用PBS缓冲剂冲洗使反应终止。

组织学分析，将处理过的小鼠背部皮肤被固定在4％甲醛中，用石蜡块制成石蜡切片(8um厚)；苏木精-伊红(HE)染色后可以在显微镜下观察。

免疫组织化学，将小鼠背部皮肤固定在4％多聚甲醛中，用蔗糖脱水，嵌入OCT包埋剂中；冰冻切片(8um厚)在4℃条件下用K15和Ki67孵育一个晚上；PBS缓冲剂冲洗切片，然后分别用共轭山羊抗兔IgG(Alexa488-和Alexa594)孵育1h；接下来，用Hoechst(hoechst是德国Hoechst AG公司合成的化合物)以1：2000给切片染色，通过荧光显微镜观察切片。

组织形态测量学。使用组织形态测量学方法评估和划分毛发生长周期的阶段，采用背部皮肤的HE染色的评估方法，对每个组每只小鼠至少50个毛囊进行评估。

具体实施方式

下面以具体实施方式对发明作进一步详细说明

本发明参照特定的实施例进行了描述，但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不违背本发明的精神和范围。因此，本发明的说明书和附图应该认为是说明性的而非限制性的。

实施例1.逆转录病毒载体的扩增和提纯

Wnt7a基因指cDNA序列为SEQ ID NO：1，CDS核苷酸序列为SEQ ID NO：2的核酸片段；Wnt7a蛋白为Wnt7a基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：3的多肽。

从基因公司购买人的Wnt7a基因的cDNA(SEQ ID NO:1)，将该Wnt7a cDNA插入逆转录病毒载体PWPT的Mlu I和Sal I位点。重组逆转录病毒载体外壳为蛋白质外壳，其表面抗体与HEK293FT细胞膜表面的受体特异性结合，侵入细胞，重组载体在细胞中扩增以产生高滴度慢病毒，然后用聚乙二醇6000(PEG)通过沉淀法进行提纯，收集富含Wnt7a病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。Wnt7a病毒溶解在PBS缓冲剂中，在-80℃环境下储存。

实施例2.脐带间充质干细胞的制备

在超净工作台中进行操作，取新鲜足月健康胎儿脐带，用含2倍100U/mL青霉素和链霉素的生理盐水冲洗去除血渍，将华尔通氏胶剥离，剪成1立方毫米以下块状，均匀涂布，缓慢加入10mL无血清培养基，置37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养。将原代细胞培养7天后，更换无血清培养液，培养至细胞达到70％的融合，移去无血清培养液，添加浓度分别为0.25％和0.1％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸钠(EDTA)消化1min，脐带MSC收缩脱离瓶壁，此时加入先前移去的培养上清液，中和胰蛋白酶-EDTA溶液，并使用移液管轻轻吹打，将脐带MSC悬液移入50mL离心管。1000rpm离心8min，去除上清液；重新加入无血清完全培养基将MSC重悬，并计数。按照1传1.5接种10cm培养皿。MSC培养融合70％左右时参照上述方法传代培养。

选择第四代培养的MSC，在对数生长期，且细胞融合程度不超过80％时按照传代的要求消化、中和、洗涤、收集细胞，采用细胞冻存液(90％胎牛血清和10％二甲亚砜(DMSO))重悬MSC，充分混匀，每管1mL分装于冻存管密封。将冻存管置于装有异丙醇的冻存盒中，于-80℃冰箱过夜，次日移入液氮罐保存。

MSC复苏的步骤为：取出MSC冻存管，立即浸入37℃温水中溶解；取适量无血清培养基混悬细胞并离心，弃去上清液；细胞重悬于无血清培养基中，并接种于培养皿中，于37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养。

实施例3.毛发再生诱导液Wnt-CM的制备

毛发再生诱导液即过表达Wnt7a的间充质干细胞条件培养基的制备

实施例2中第4代MSCs按照实施例2中方法在T75培养瓶中培养到50-60％融合，用8mg/mL混合聚凝胺(Polybrene)和Wnt7a病毒的培养基处理，补充12mL无血清DMEM培养基，24h后收集被Wnt7a病毒转染的脐带间充质干细胞的条件培养基，将条件培养基在3000rpm下离心10min，移除细胞碎片，用一个7-kDa分子量截止袋式过滤器在PEG 20000，4℃下透析，把培养基浓缩20倍，制成Wnt7a过表达的间充质干细胞条件培养基(Wnt-CM)，即毛发再生诱导液。

间充质干细胞条件培养基的制备

收集实施例2中第四代MSCs的上清，将上清在3000rpm下离心10min，移除细胞碎片，用一个7-kDa分子量截止袋式过滤器在PEG 20000，4℃下透析，把培养基浓缩20倍，制成间充质干细胞条件培养基(MSC-CM)。

构建逆转录病毒载体以表达Wnt7a,并在HEK293细胞中繁殖。用含逆转录病毒的培养基和Polybrene处理间充质干细胞。使用qRT-PCR和免疫蛋白印迹及免疫染色法确认逆转录病毒介导的Wnt7a在脐带间充质干细胞中的表达。从图1A-D可以看出，经过Wnt7a处理的MSC中Wnt7a的mRNA和蛋白质水平更高，而未经处理的MSC中Wnt7a表达较弱。用ELISA检测培养上清液中的Wnt7a，在逆转录病毒Wnt7a感染的MSC中，分泌的Wnt7a蛋白质水平显著高于未经处理的MSC(图1E)。这些数据证明Wnt7a在MSC中成功表达，并且分泌到MSC培养基中。

将毛发再生诱导液Wnt-CM进行冻干制得干粉

在超净工作台中收集过表达Wnt7a的脐带间充质干细胞的条件培养基(毛发再生诱导液)离心；在超净工作台中打开离心管，用无菌枪头吸出离心管中的上清液至一无菌的收集管中，弃沉淀，记录标志，-80℃冻存凝固备用；将-80℃冻存凝固的上清液抽真空，升华干燥，除去冰晶。最后制得冻干粉，4℃保存。

实施例4.毛发再生模型的建立

获取6周龄雄性生长良好的C57BL/6小鼠，此时小鼠所有毛囊均由生长期进入静止期，且生理状态下不再自发进入生长期，经人工脱毛或拔毛等创伤刺激后再诱导其毛发进入生长期。将1:1混合的松香/蜡加热溶化后涂于小鼠背部，凝固变硬后揭去，从而达到脱毛的效果，每只小鼠脱毛区域约为2cm×2cm(该小鼠躯干皮肤的黑素细胞只存在于毛囊中，而且尽在生长期时合成黑色素并传递给角质形成细胞，使皮肤变成黑色，而退行期皮肤变成灰色，休止期皮肤变成粉红色，因此可根据皮肤颜色大致判断毛发周期情况。)

实施例5.毛发再生诱导液Wnt-CM的功能验证

将实施例3获得的Wnt-CM和MSC-CM治疗实施例4构建的毛发再生模型小鼠，毛发去除后一天后，将100ul的Wnt-CM通过皮内注射到事先去除毛发的小鼠背部多个点，以同样剂量的MSC-CM和DMEM注射的小鼠用作对照组。

实验结果：

(1)Wnt-CM能够加快毛囊周期

通过组织形态学测量方法测量皮肤色素沉着量确定毛发生长周期的阶段。如图2结果显示，Wnt-CM治疗组的小鼠在治疗后7天时背部皮肤变暗，而MSC-CM和DMEM注射得对照组没有显著改变(图2A)。在14天时，Wnt-CM治疗的小鼠的毛发已经完全重新长好，并且毛干的顶端穿过表皮显现；然而，MSC-CM治疗组的小鼠中，背部的色素沉淀不均匀并且只有少许毛干；DMEM治疗组的小鼠中，仍然有大面积没有色素沉淀的区域(图2B)。通过对小鼠背部皮肤的组织形态测量学分析显示Wnt-CM能够促进毛发从静止期向生长期的转变，Wnt-CM治疗组小鼠可以较早地重新进入生长期，而DMEM治疗组小鼠平均需要2-3天的时间才能重新进入生长期；但是，毛发生长的进程在进入生长中期后并没有显著地变化。

HE染色揭示了小鼠背部毛囊在不同阶段的结构变化(图2C-J)。Wnt-CM治疗组小鼠的一些毛囊第3天进入生长期IV，第7天进入生长期V并且毛干完全成熟，第14天再生的毛发从上皮长出，并且一部分毛囊进入生长期VI；而MSC-CM治疗组的小鼠背部毛囊第3天进入生长期III，第7天进入生长期IV，一部分毛囊在第14天进入生长期VI；DMEM治疗组的小鼠毛囊分别在第3天、7天和14天进入生长期II，III和V。这些结果表明过表达Wnt7a的MSCs能够诱导小鼠毛发快速进入生长期。

(2)Wnt-CM增加毛发再生的数量。

毛发的数量是通过典型的小鼠背部照片和HE染色的皮肤组织切片来评估的。HE染色和照片分别显示了小鼠毛囊和毛干的数量(图3A-B)。Wnt-CM治疗组小鼠毛囊和毛干的数量分别是DMEM对照组的1.5倍(p<0.05n＝3)和1.6倍(p<0.05n＝3)，MSC-CM治疗组小鼠毛囊和毛干的数量分别是DMEM对照组的1.2和1.3倍(图3C-D)。与MSC-CM治疗组和DMEM对照组相比，Wnt-CM治疗组的毛囊周期被扩大了。这些结果表明，Wnt-CM通过扩大毛囊周期来增加小鼠背部皮肤的毛囊数量。

(3)Wnt-CM引发毛囊再生。

在第一个静止期阶段，我们去除了小鼠的背部毛发来追踪DP细胞引发的毛囊干细胞增殖和随后的毛发再生。ALP，Ki67和K15分别是是生长期DP细胞、细胞增值和毛囊干细胞的典型标志，并且它们在毛发再生的不同阶段表达。用免疫组织化学分析法对它们的表达进行分析。Wnt-CM在第3天和第5天快速诱导ALP在SG(皮脂腺)和DP区域的表达(图4A)。伴随着ALP的增强表达，第3天的时候我们在Wnt-CM组的毛囊球部观察到了增强的Ki67表达，并且在第5天出现了强烈表达。在第3天，我们在MSC-CM治疗组中也观察到了增强的ALP表达，但是和Wnt-CM治疗组相比，Ki67阳性细胞较少(图4B)。第3天不同组的K15表达显示了毛发再生和毛囊干细胞的迁移和分化(图4C)。除了ALP、Ki67和K15的表达改变，我们没有在上皮细胞、毛囊或者其他皮肤组织中观察到任何显著异常。这些结果表明过表达Wnt7a的MSCs可以激活DP细胞来加速毛囊进入生长期，引起毛发再生。

实施例6.毛发再生诱导液Wnt-CM诱导DP细胞体外生长

DP细胞的分离和培养：

将4周大新生的C57BL/6大鼠麻醉后修剪颊侧被毛，常规消毒后减去全层皮肤，暴露其下方的毛囊；然后用镊子将其完整拔出，置离心管中，在37℃缓慢搅拌的条件下加入0.2％胶原酶I消化3h；剪短吹打使DP细胞游离，静置使毛干沉入管底；吸出上清，经400目筛网过滤后收集截留的DP细胞。将细胞保存在补充有10％的胎牛血清(FBS)的10mL DMEM里培养3天。在DP细胞第一次扩增培养后，把20倍浓缩的毛发再生诱导液Wnt-CM加入到DMEM里(毛发再生诱导液Wnt-CM和DMEM以1:1的比例混合)，收集DP细胞，进行ALP染色。

结果：

DP细胞从C57BL/6小鼠的胡须分离出来并且在含有10％FBS的DMEM里培养3天。如图5A所示，DP细胞在之后的三天快速增长。DP细胞活性随着代数的增长而降低，Wnt7a可以相对维持DP细胞的活性。图5B显示碱性磷酸酶染色(ALP staining)显示阳性DP细胞在p3代时在含DMEM的培养基中难以检测。然而，ALP染色在含有Wnt-CM和MSC-CM的培养基中检测到DP细胞，并且Wnt-CM处理比MSC-CM处理导致了明显更多的ALP染色。此结果表示Wnt-CM可以诱导DP细胞体外生长。

序列表

<110> 北京恒峰铭成生物科技有限公司

<120> 一种毛发再生诱导液及其制备方法和应用

<130> R

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1732

<212> DNA

<213> 人

<400> 1

gaggggcggg ggctggaggc agcagcgccc ccgcactccc cgcgtctcgc acacttgcac 60

cggtcgctcg cgcgcagccc ggcgtcgccc cacgccgcgc tcgctcctcc ctccctcctc 120

ccgctccgtg gctcccgtgc tcctggcgag gctcaggcgc ggagcgcgcg gacgggcgca 180

ccgacagacg gccccgggga cgcctcggct cgcgcctccc gggcgggcta tgttgattgc 240

cccgccgggg ccggcccgcg ggatcagcac agcccggccc gcggccccgg cggccaatcg 300

ggactatgaa ccggaaagcg cggcgctgcc tgggccacct ctttctcagc ctgggcatgg 360

tctacctccg gatcggtggc ttctcctcag tggtagctct gggcgcaagc atcatctgta 420

acaagatccc aggcctggct cccagacagc gggcgatctg ccagagccgg cccgacgcca 480

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atggccgctg gaactgctct gcactgggag agcgcaccgt cttcgggaag gagctcaaag 600

tggggagccg ggaggctgcg ttcacctacg ccatcattgc cgccggcgtg gcccacgcca 660

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gccagtacca ccgggacgag ggctggaagt ggggtggctg ctctgccgac atccgctacg 780

gcatcggctt cgccaaggtc tttgtggatg cccgggagat caagcagaat gcccggactc 840

tcatgaactt gcacaacaac gaggcaggcc gaaagatcct ggaggagaac atgaagctgg 900

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agcctgtgcg tgccagccgc aacaagcggc ccaccttcct gaagatcaag aagccactgt 1080

cgtaccgcaa gcccatggac acggacctgg tgtacatcga gaagtcgccc aactactgcg 1140

aggaggaccc ggtgaccggc agtgtgggca cccagggccg cgcctgcaac aagacggctc 1200

cccaggccag cggctgtgac ctcatgtgct gtgggcgtgg ctacaacacc caccagtacg 1260

cccgcgtgtg gcagtgcaac tgtaagttcc actggtgctg ctatgtcaag tgcaacacgt 1320

gcagcgagcg cacggagatg tacacgtgca agtgagcccc gtgtgcacac caccctcccg 1380

ctgcaagtca gattgctggg aggactggac cgtttccaag ctgcgggctc cctggcagga 1440

tgctgagctt gtcttttctg ctgaggaggg tacttttcct gggtttcctg caggcatccg 1500

tgggggaaaa aaaatctctc agagccctca actattctgt tccacaccca atgctgctcc 1560

accctccccc agacacagcc caggtccctc cgcggctgga gcgaagcctt ctgcagcagg 1620

aactctggac ccctgggcct catcacagca atatttaaca atttattctg ataaaaataa 1680

tattaattta tttaattaaa aagaattctt ccacaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1732

<210> 2

<211> 1050

<212> DNA

<213> 人

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gtcataggag aaggctcaca aatgggcctg gacgagtgtc agtttcagtt ccgcaatggc 240

cgctggaact gctctgcact gggagagcgc accgtcttcg ggaaggagct caaagtgggg 300

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ggcttcgcca aggtctttgt ggatgcccgg gagatcaagc agaatgcccg gactctcatg 540

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gtgtggcagt gcaactgtaa gttccactgg tgctgctatg tcaagtgcaa cacgtgcagc 1020

gagcgcacgg agatgtacac gtgcaagtga 1050

<210> 3

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<212> PRT

<213> 人

<400> 3

Met Asn Arg Lys Ala Arg Arg Cys Leu Gly His Leu Phe Leu Ser Leu

1 5 10 15

Gly Met Val Tyr Leu Arg Ile Gly Gly Phe Ser Ser Val Val Ala Leu

20 25 30

Gly Ala Ser Ile Ile Cys Asn Lys Ile Pro Gly Leu Ala Pro Arg Gln

35 40 45

Arg Ala Ile Cys Gln Ser Arg Pro Asp Ala Ile Ile Val Ile Gly Glu

50 55 60

Gly Ser Gln Met Gly Leu Asp Glu Cys Gln Phe Gln Phe Arg Asn Gly

65 70 75 80

Arg Trp Asn Cys Ser Ala Leu Gly Glu Arg Thr Val Phe Gly Lys Glu

85 90 95

Leu Lys Val Gly Ser Arg Glu Ala Ala Phe Thr Tyr Ala Ile Ile Ala

100 105 110

Ala Gly Val Ala His Ala Ile Thr Ala Ala Cys Thr Gln Gly Asn Leu

115 120 125

Ser Asp Cys Gly Cys Asp Lys Glu Lys Gln Gly Gln Tyr His Arg Asp

130 135 140

Glu Gly Trp Lys Trp Gly Gly Cys Ser Ala Asp Ile Arg Tyr Gly Ile

145 150 155 160

Gly Phe Ala Lys Val Phe Val Asp Ala Arg Glu Ile Lys Gln Asn Ala

165 170 175

Arg Thr Leu Met Asn Leu His Asn Asn Glu Ala Gly Arg Lys Ile Leu

180 185 190

Glu Glu Asn Met Lys Leu Glu Cys Lys Cys His Gly Val Ser Gly Ser

195 200 205

Cys Thr Thr Lys Thr Cys Trp Thr Thr Leu Pro Gln Phe Arg Glu Leu

210 215 220

Gly Tyr Val Leu Lys Asp Lys Tyr Asn Glu Ala Val His Val Glu Pro

225 230 235 240

Val Arg Ala Ser Arg Asn Lys Arg Pro Thr Phe Leu Lys Ile Lys Lys

245 250 255

Pro Leu Ser Tyr Arg Lys Pro Met Asp Thr Asp Leu Val Tyr Ile Glu

260 265 270

Lys Ser Pro Asn Tyr Cys Glu Glu Asp Pro Val Thr Gly Ser Val Gly

275 280 285

Thr Gln Gly Arg Ala Cys Asn Lys Thr Ala Pro Gln Ala Ser Gly Cys

290 295 300

Asp Leu Met Cys Cys Gly Arg Gly Tyr Asn Thr His Gln Tyr Ala Arg

305 310 315 320

Val Trp Gln Cys Asn Cys Lys Phe His Trp Cys Cys Tyr Val Lys Cys

325 330 335

Asn Thr Cys Ser Glu Arg Thr Glu Met Tyr Thr Cys Lys

340 345