一种重组HEK‑293T细胞及其分泌寨卡病毒非结构蛋白1的制作方法

本发明涉及引入外来遗传物质而修饰的细胞，具体涉及重组的HEK-293T细胞。

背景技术：

寨卡病毒(ZIKA virus)是黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)病毒，主要通过蚊虫叮咬传播、性接触传播，此外病毒可以通过胎盘。1947年病毒学家在乌干达发现ZIKA病毒，患者主要表现为发热、斑丘疹及关节酸痛，之后仅表现为零星发病和小规模流行。直到2007年在南太平洋的Yap岛爆发流行，随后在非洲、东南亚及南美洲相继出现在卡病毒感染病例。中国国家卫生计生委2016年2月9日通报，确诊一例输入性寨卡病毒感染病例，截至目前共有10例输入性寨卡病毒感染病例。临床研究证实ZIKA病毒能够通过胎盘，导致胎儿出现小头症。Guillaume Carteaux报道了1例成年人中ZIKA病毒感染引起的脑膜脑炎。ZIKA病毒感染成为严重的世界性公共卫生问题，同时给爆发疫情的国家和地区造成严重经济损失。世界银行最新公布的数据显示，在寨卡病毒感染发生国，或疫情预计会大面积爆发的国家或地区，当地的国际游客数量料将骤减，其旅游业将因此损失639亿美元。我国地缘辽阔，夏季蚊虫滋生，为该疾病的传播创造了有利条件。

ZIKA病毒核酸为单股正链RNA，长10.8kb，编码一个前体蛋白，经病毒和宿主蛋白酶切割成3个结构蛋白(C、prM/M和E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。ZIKA病毒与登革热病毒同属于黄病毒科病毒，二者的核酸和蛋白同源性较高，目前国内外对登革热病毒研究报道较多，Beth-Ann G.Coller等采用昆虫细胞表达登革热NS1蛋白，接种小鼠和非人灵长类动物均表现出较好的免疫原性，攻毒试验表明该蛋白具有较好保护力，具有成为登革热病毒亚单位疫苗的潜力。此外，ZIKA病毒非结构蛋白，例如NS1、NS3和NS5等在病毒黏附、侵入和复制等过程中发挥重要作用。

Zika病毒感染已经成为影响人们健康的重要公共卫生因素，目前缺乏有效的血清学诊断方法，有学者表达登革热的NS1蛋白并建立登革热抗体ELISA检测方法，该方法能鉴别诊断登革热与黄病毒科其它病毒。此外，NS1蛋白是Zika病毒ORF编码的前体蛋白剪切后最早释放的蛋白。因此建立Zika病毒NS1抗体检测方法能有效缩短检测的窗口期。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种重组HEK-293T细胞，该重组HEK-293T细胞可稳定分泌寨卡病毒非结构蛋白1(NS1)。

本发明解决上述问题的技术方案如下：

一种重组HEK-293T细胞，其特征在于，该重组HEK-293T细胞是以HEK-293T细胞为宿主转染外源基因获得，其中所述的外源基因的核酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

上述重组HEK-293T细胞由如下方法制得：

(1)从GenBank中获取ZIKA病毒NS1基因序列(录入号为KU955594.1)然后进行密码子优化，得到如SEQ.ID.NO.1所示的序列；将所得到的ZIKA病毒NS1基因的起始端和终止端密码子分别进行酶切，然后克隆至载体pMD19-T中，得到重组载体命pMD19-NS1；

(2)先取FUGW质粒用PacⅠ酶切后补平再用BamHⅠ酶切回收载体大片段，再取pCDNA3.0质粒先用BglⅡ酶切后补平再用BamHⅠ酶切后回收CMV启动子，然后用Roche ligation kit将所回收的载体大片段和CMV启动子连接后得到慢病毒表达质粒pLV-CMV-EGFP；

(3)将慢病毒表达质粒pLV-CMV-EGFP双酶切回收大片段，再将pMD19-NS1双酶切回收核酸序列如SEQ.ID.NO.1所示的ZIKA病毒基因NS1，然后将所回收的大片段与NS1序列在T4DNA连接酶作用下连接，转化stab3感受态细胞后涂布含氨苄的LB平板，过夜培养后挑取单菌落扩增培养并提取得到慢病毒重组载体pLV-CMV-EGFP-ZIKA-NS1；

(4)将所述慢病毒重组载体pLV-CMV-EGFP-ZIKA-NS1与慢病毒包装辅助质粒共转染HEK-293T细胞，收集慢病毒感染HEK-293T细胞，即得重组HEK-293T细胞。

所述的重组HEK-293T细胞可稳定分泌表达寨卡病毒非结构蛋白1(NS1)，该寨卡病毒非结构蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述的非结构蛋白NS1的抗原性好，可用于患者是否感染寨卡病毒的检测。

本发明具有以下有益效果：

1、现有技术大多采用原核表达或酵母表达蛋白，上述方法制备的蛋白与天然蛋白在高级结构方法存在较大差异，本发明所选用的表达系统为HEK-293T细胞，得到的重组细胞系HEK-293T-Zika-NS1具有与亲本细胞相似的生物特性，有利于抗原蛋白的规模生产；表达蛋白在表达细胞内能得到接近病毒蛋白的天然构象与修饰加工，抗原性好；重组细胞可以用转瓶高密度发酵培养，易于大量生产；

2、本发明在对Zika病毒基因哺乳动物细胞密码子偏嗜性基础上，首次利用慢病毒表达系统表达NS1蛋白，此外序列中还含有组氨酸标签，有利于后期纯化；

3、本发明抗原表达量高，利用普通细胞培养瓶皿培养，产量可达120mg/L。

附图说明

图1为慢病毒重组载体pLV-CMV-EGFP-Zika-NS1构建示意图。

图2为慢病毒重组载体pLV-CMV-EGFP-Zika-NS1酶切鉴定的电泳图，图中M为marker，1为挑选克隆。

图3为Western blot鉴定不同阳性克隆细胞中Zika病毒NS1蛋表达情况的电泳图；图中，条带1、2、3、4、5为随机挑选的五个重组阳性克隆细胞。

图4为重组细胞系HEK-293T-Zika-NS1不同代次细胞目的蛋白表达Western Blot电泳图；图中，条带1为阴性对照，条带2-9分别为第1、5、10、15、20，25，30，35代细胞培养上清Western Blot电泳结果。

图5为本发明所述寨卡病毒非结构蛋白(NS1)纯化的吸光度图谱。

图6为本发明所述寨卡病毒非结构蛋白(NS1)纯化各步留样的电泳图；图中，条带1为流穿峰样品；条带2为上样前样品；条带3为洗脱峰样品。

具体实施方式

实施例所涉及的材料及其来源如下所示：

HEK-293T细胞由广州伯尼兹生物科技有限公司保存；

stab3感受态细胞购自广州复能基因有限公司；

DL 2000Marker、DL 3000Marker、DL 5000Marker、DL10000Marker、Premix Ex Taq和去磷酸化试剂盒购自Takara公司；限制性内切酶Sal I﹑Xho I﹑BamH I﹑NheI、MluⅠ、T4DNA连接酶均为NEB公司产品；预染蛋白Marker购自SunShineBio公司；牛血清白蛋白和琼脂糖购自Amresco公司；二氨基联苯胺购自上海迈瑞尔化学技术有限公司；DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒为Axygen公司产品；质粒小量提取试剂盒购自OMEGA公司；二甲基亚砜、聚凝胺购自Sigma公司；胰蛋白胨及酵母提取物为Oxiod公司产品；0.25％胰蛋白酶、DMEM培养基及南美胎牛血清为Hyclon公司产品，Zika多克隆抗体购自美国Kerafast公司。

实施例1(重组细胞系的构建及检测)

1、编码Zika病毒NS1基因序列设计及制备

1.1 编码Zika病毒NS1基因序列设计

在Zika病毒Haiti株基因(录入号为KU955594.1)的基础上进行序列优化和表达设计，在起始密码子前加有Kozak序列与Nhe I酶切位点与保护性碱基，在NS1蛋白基因编码末端加有终止子与MluI酶切位点与保护性碱基；得到的NS1蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.2为SEQ ID NO.1翻译后的氨基酸序列。

1.2 编码Zika病毒NS1蛋白基因序列合成

Zika病毒NS1蛋白基因序列由中美太和生物技术有限公司合成，命名为pMD19-Zika-NS1。

Zika病毒NS1基因序列由中美太和生物技术有限公司合成，具体方法如下，从GenBank中获取ZIKA病毒NS1(录入号为KU955594.1)核苷酸序列，采用JCat软件对序列进行哺乳细胞表达进行密码子优化，得到SEQ.ID.NO.1，化学合成方法得到上述序列，在该序列5’端起始密码子前加入Nhe I酶切位点，3’端终止密码子后加入Mlu I酶切位点，将其克隆至商品化载体pMD19-T(Takara，lot No.D104A)中，重组载体命名为pMD19-NS1。

2、慢病毒重组载体的构建及检测

慢病毒表达质粒pLV-CMV-EGFP的获得：将FUGW质粒用Pac Ⅰ酶切后补平再用BamH Ⅰ酶切回收载体大片段；将pCDNA3.0质粒先用Bgl Ⅱ酶切后补平再用BamH Ⅰ酶切后回收CMV启动子，再用Roche ligation kit将上述回收的载体大片段和CMV启动子连接后得到慢病毒表达质粒pLV-CMV-EGFP。

将上述慢病毒表达质粒pLV-CMV-EGFP用Nhe I和Mlu Ⅰ酶切处理回收大片段，然后与经Nhe I和Mlu Ⅰ酶切回收的Zika-NS1基因在T4DNA连接酶作用下连接，转化stab3感受态细胞后涂布含氨苄的LB平板，过夜培养后挑取单菌落扩增培养并提取质粒，用菌落PCR及Nhe I和Mlu Ⅰ酶切对其进行鉴定，鉴定的阳性质粒即为本实施例所需慢病毒重组载体，将其命名为pLV-CMV-EGFP-Zika-NS1。

上述FUGW质粒、pCDNA3.0质粒和Roche ligation kit均为市售。

上述含氨苄的LB平板，其培养基配方为100mL：胰化蛋白胨1g、酵母提取物0.5g、氯化钠1g、琼脂1.5g，加蒸馏水溶解，高压灭菌20min，待液体冷却到55℃加入氨苄，摇匀后立刻倒板；所述氨苄浓度为100mg/mL，加入量为每100mL培养基加入100ul氨苄。

本实施例慢病毒重组载体的构建示意图如图1所示，提取的重组质粒经NheI和Mlu Ⅰ酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分析，发现有两条带，酶切产物电泳带型与预期结果一致(见图2)。

3、慢病毒包装及滴度检测

3.1、细胞铺板

细胞铺板采用本领域技术人员的常规操作，具体步骤如下所示：

倒掉HEK-293T细胞培养瓶中的培养上清，用1-3mlPBS洗涤一遍，吸净；加入1ml 0.25％的胰酶，室温作用1-2min；待细胞都变圆，加入2-3ml DMEM完全培养基把细胞吹打下来，收集到离心管中，1000rpm离心5min，弃上清；用DMEM完全培养基将细胞沉淀充分重悬，使细胞形成单细胞悬液；

向100mm细胞培养皿加入10ml DMEM完全培养基，用细胞计数板进行细胞计数，每个皿约加入6×10⁶细胞，37℃、5％CO₂培养箱内培养过夜。

DMEM完全培养基的配方为：含10％FBS、100U/ml的青霉素和0.1mg/ml链霉素的DMEM完全培养基(Corning cellgro,USA,lot number 10-013-CVR-500ml)。

细胞状态对于病毒包装至关重要，细胞生长良好的状态有利于病毒包装，因此需要保证良好的细胞状态。

3.2 慢病毒包装及感染

所述慢病毒包装就是将之前制备的慢病毒重组载体pLV-CMV-EGFP-Zika-NS1与慢病毒包装辅助质粒共转染人胚胎肾细胞HEK-293T，转染方法采用PEI(聚乙烯亚胺)方法，具体步骤如下所示。

3.2.1 转染体系

所述PEI转染法为本领域技术人员的常规操作，其转染体系分为A液和B液，具体如下所示：

A液

PEI储存液 24μl；

1×HBS 补至1ml；

B液

pLV-CMV-EGFP-Zika-NS13μg；

上述PEI储存液的配方是：称取1.25mgPEI粉末溶解于50ml×HBS(pH7.4)中，0.2μm滤膜过滤，储存于4℃备用。

上述1×HBS的配方为：将8.76gNaCl溶解于900ml超纯水，加入20ml1M的HEPES，调pH值到7.4，定容至1L，0.2μm滤膜过滤后储存于4℃备用。

上述慢病毒包装系统质粒gag/pol、Rev、VSVG购自Invitrogen公司(货号：K4975-00)，这些包装质粒提供了病毒基因组mRNA包装成完整毒粒所必需的结构蛋白、聚合酶和包膜蛋白。

3.2.2 转染

细胞铺板后第二天，待细胞融合度达到70％-90％时，将转染体系的A液加入到B液，充分混匀，室温静置20min后，轻轻滴加到100mm皿的细胞培养上清中，轻晃培养皿混匀，放37℃，5％CO₂孵箱中培养48h后收集上清液，然后再向细胞培养皿中加入10mlDMEM完全培养基，继续培养48h后收集上清液，合并两次上清液，然后3000rpm离心5min后去除细胞碎片，则得到所需病毒液。

将该病毒液取100μl用于检测病毒滴度，其余的分装后放于-80℃冰箱保存或用于后续的细胞感染。

3.3 病毒滴度检测

病毒滴度检测采用RT-QPCR测定病毒滴度，其操作方法采用本领域技术人员的常规操作和所用试剂盒说明步骤即可，检测结果显示病毒滴度为1×10⁸copies/ml，说明病毒包装成功，能感染细胞并将基因插入到细胞基因组中。

3.4、细胞感染

将上述得到的病毒液感染HEK-293T细胞，具体步骤如下所示：

将生长状态良好的HEK-293T细胞消化计数后用DMEM完全培养基稀释至1×10⁵/mL，加入24孔板，500μL/孔，准备2个复孔，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时；

在DMEM完全培养基中加入polybrene(聚凝胺)，制备含polybrene的培养基(培养基中Polybrene的终浓度为6-8μg/mL)；

将上述3.2.2制备的病毒液10μl加入到上述含polybrene的培养基中，使终体积为300μl并轻吹混匀，制备得到含病毒培养基；

将步骤1培养24h后的HEK-293T细胞的旧培养基倒掉，每个孔内加入300μl含病毒培养基，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养；

培养24小时后，将孔里的培养基倒掉，换上500μl DMEM完全培养基，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养；

4、基因稳定分泌表达细胞系的建立

培养到第3-5天后，将长满培养孔的细胞用胰酶消化后，用有限稀释法传代于96孔板中继续培养，15天后在倒置显微镜下观察每孔细胞的克隆数目；挑选含有1个细胞集落(即1个细胞团块)的孔，将克隆细胞在24孔板中培养3d后，收集上清液，10倍浓缩后加入电泳上样缓冲液制离心后吸取上清进行SDS-PAGE电泳，转膜后采用5％脱脂奶(BioRad公司)封闭2h，采用抗Zika病毒多克隆抗体孵育过夜(美国Kerafast公司，1：10000稀释)，TBST洗涤3次，每次10min，孵育HRP标记的兔抗人二抗(天根生化科技(北京)有限公司，1：10000稀释)，37℃1h，之后曝光。

Western blotting结果如图3所示。

结果表明我们筛选得到的5个克隆都能表达Zika病毒NS1蛋白，但表达量有差异，我们选取表达量最高的1号细胞克隆继续扩大培养后保存，并将其命名为HEK-293T-Zika-NS1，并且对其进行稳定性检测。

5、本发明重组细胞系的稳定性检测

5.1 克隆细胞不同代次细胞的Western blotting鉴定

将上述筛选得到的重组细胞系HEK-293T-Zika-NS1正常传代并收集不同代次(第1、5、10、15、20，25，30，35代)细胞培养上清进行Western blotting鉴定，鉴定结果如图4所示，结果表明不同代次的细胞均能稳定表达目的蛋白。

从上述检测结果可以看出，本实施例确实获得能够稳定表达Zika NS1蛋白的重组细胞系HEK-293T-Zika-NS1。

实施例2.(重组蛋白的纯化)

1、Zika病毒NS1蛋白纯化

细胞培养上清经0.45μm滤膜过滤，HisTrap^TM HP柱与BioLogic LP蛋白纯化仪正确连接后，用3倍柱床体积的上样缓冲液(20mM pH7.4磷酸盐缓冲液，0.5M NaCl)，1ml/min平衡柱子，将预处理的样品以1ml/min的速度上样，结束后用上样缓冲液进行流洗，1ml/min，5倍柱床体积，随后用20mM pH7.4磷酸盐缓冲液(含200mM咪唑)洗脱重组蛋白，同时用BioLogic LP进行监测，当观察到基线上升，即出现洗脱峰时开始收集。收集洗脱液至洗脱峰回到基线后，继续用上样缓冲液平衡3-5倍柱床体积，流速调至1ml/min。再用20％乙醇平衡5倍柱床体积。

2、蛋白纯化分析

收集蛋白纯化各步留样进行SDS-PAGE和Western blotting分析，方法同实施例1中方法。

由图5可知，上样时所监测到峰为非结合峰(杂蛋白峰)，随着磷酸盐缓冲液被分离出来，此峰280nm波长OD值为0.5-0.6AU；第二个峰为所需的目的峰，采用200mM咪唑洗脱液洗脱时下从柱子上解离下来，此峰最大的280nm波长OD值为0.75AU，此值高于穿透峰值，两峰间分离良好。Western blotting和SDS-PAGE结果表明Zika病毒NS1蛋白纯化条件成熟，纯化效率较高(见图6)。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学

<120> 一种重组HEK-293T细胞及其分泌寨卡病毒非结构蛋白1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1182

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gctagcatgg agacagacac actcctgcta tgggtgctgc tgctctgggt tccaggttcc 60

actggtgacg tggggtgctc ggtggacttc tcaaagaagg agacgagatg cggtacaggg 120

gtgttcgtct ataacgacgt tgaagcctgg agggacaggt acaagtacca tcctgactcc 180

ccccgtagat tggcagcagc agtcaagcaa gcctgggaag atggtatctg cgggatctcc 240

tctgtttcaa gaatggaaaa catcatgtgg agatcagtag aaggggagct caacgcaatc 300

ctggaagaga atggagttca actgacggtc gttgtgggat ctgtaaaaaa ccccatgtgg 360

agaggtccac agagattgcc cgtgcctgtg aacgagctgc cccacggctg gaaggcttgg 420

gggaaatcgc acttcgtcag agcagcaaag acaaataaca gctttgtcgt ggatggtgac 480

acactgaagg aatgcccact caaacataga gcatggaaca gctttcttgt ggaggatcat 540

gggttcgggg tatttcacac tagtgtctgg ctcaaggtta gagaagatta ttcattagag 600

tgtgatccag ccgttattgg aacagctgtt aagggaaagg aggctgtaca cagtgatcta 660

ggctactgga ttgagagtga gaagaatgac acatggaggc tgaagagggc ccatctgatc 720

gagatgaaaa catgtgaatg gccaaagtcc cacacattgt ggacagatgg aatagaagag 780

agtgatctga tcatacccaa gtctttagct gggccactca gccatcacaa taccagagag 840

ggctacagga cccaaatgaa agggccatgg cacagtgaag agcttgaaat tcggtttgag 900

gaatgcccag gcactaaggt ccacgtggag gaaacatgtg gaacaagagg accatctctg 960

agatcaacca ctgcaagcgg aagggtgatc gaggaatggt gctgcaggga gtgcacaatg 1020

cccccactgt cgttccgggc taaagatggc tgttggtatg gaatggagat aaggcccagg 1080

aaagaaccag aaagcaactt agtaaggtca atggtgactg caggatcaac tgatcacatg 1140

gatcacttct cccttcatca tcaccatcac cattagacgc gt 1182

<210> 2

<211> 389

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Val Gly Cys Ser Val Asp Phe Ser Lys Lys Glu

20 25 30

Thr Arg Cys Gly Thr Gly Val Phe Val Tyr Asn Asp Val Glu Ala Trp

35 40 45

Arg Asp Arg Tyr Lys Tyr His Pro Asp Ser Pro Arg Arg Leu Ala Ala

50 55 60

Ala Val Lys Gln Ala Trp Glu Asp Gly Ile Cys Gly Ile Ser Ser Val

65 70 75 80

Ser Arg Met Glu Asn Ile Met Trp Arg Ser Val Glu Gly Glu Leu Asn

85 90 95

Ala Ile Leu Glu Glu Asn Gly Val Gln Leu Thr Val Val Val Gly Ser

100 105 110

Val Lys Asn Pro Met Trp Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Val Pro Val

115 120 125

Asn Glu Leu Pro His Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys Ser His Phe Val

130 135 140

Arg Ala Ala Lys Thr Asn Asn Ser Phe Val Val Asp Gly Asp Thr Leu

145 150 155 160

Lys Glu Cys Pro Leu Lys His Arg Ala Trp Asn Ser Phe Leu Val Glu

165 170 175

Asp His Gly Phe Gly Val Phe His Thr Ser Val Trp Leu Lys Val Arg

180 185 190

Glu Asp Tyr Ser Leu Glu Cys Asp Pro Ala Val Ile Gly Thr Ala Val

195 200 205

Lys Gly Lys Glu Ala Val His Ser Asp Leu Gly Tyr Trp Ile Glu Ser

210 215 220

Glu Lys Asn Asp Thr Trp Arg Leu Lys Arg Ala His Leu Ile Glu Met

225 230 235 240

Lys Thr Cys Glu Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Thr Asp Gly Ile

245 250 255

Glu Glu Ser Asp Leu Ile Ile Pro Lys Ser Leu Ala Gly Pro Leu Ser

260 265 270

His His Asn Thr Arg Glu Gly Tyr Arg Thr Gln Met Lys Gly Pro Trp

275 280 285

His Ser Glu Glu Leu Glu Ile Arg Phe Glu Glu Cys Pro Gly Thr Lys

290 295 300

Val His Val Glu Glu Thr Cys Gly Thr Arg Gly Pro Ser Leu Arg Ser

305 310 315 320

Thr Thr Ala Ser Gly Arg Val Ile Glu Glu Trp Cys Cys Arg Glu Cys

325 330 335

Thr Met Pro Pro Leu Ser Phe Arg Ala Lys Asp Gly Cys Trp Tyr Gly

340 345 350

Met Glu Ile Arg Pro Arg Lys Glu Pro Glu Ser Asn Leu Val Arg Ser

355 360 365

Met Val Thr Ala Gly Ser Thr Asp His Met Asp His Phe Ser Leu His

370 375 380

His His His His His

385