一种香椿内生真菌TS8及其次级代谢产物、制备方法和应用与流程

本发明属于微生物
技术领域：
，具体涉及一种香椿内生真菌TS8及其次级代谢产物、制备方法和应用。
背景技术：
：2014年我国果蔬年产量超过9.4亿吨。果蔬已成为继粮食之后的第二和第三大产业，且占全球市场的比重均在50%以上，并呈逐渐升高趋势。软腐病是果蔬类农业生产上最常见的一种细菌性病害，有关资料显示我国果蔬流通腐损率高达20-30%，每年造成经济损失高达1000多亿元，严重影响果蔬的产量和质量，给广大生产者和经营者造成巨大的经济损失。一直以来，化学农药是植物病虫害防治的主要手段，但目前能够有效防治果蔬软腐病害的药剂仍然较少，国内外对该病害的防治主要采用链霉素、春雷霉素等农用抗生素类制剂以及噻菌铜、噻枯唑等铜化学制剂两大类。但此类化学药剂往往存在高残留、高毒性以及环境污染等问题，对人类安全也存在隐患，许多品种已被禁用。另外化学药剂还容易产生病原菌的抗药性，影响防治效果。相对而言，植物及微生物源类似“农药”的活性物质具有选择性高、低毒、易降解、不易产生抗性等优点，尤其是在人们保护环境、崇尚自然以及关注食品安全等的新常态下，加强针对果蔬病虫害防治的新型植物及微生物源活性物质的研究和开发，对果蔬产业健康持续发展和人类健康均具有重要意义。然而由于植物体内天然活性物质含量较低，提取工艺复杂，以及植物资源往往受地理环境和生态条件等因素的影响，所以从植物中开发天然活性物质也具有一定的局限性。根据共生理论，植物内生真菌可以产生与宿主植物相同或相似的生物活性物质，同时植物内生真菌作为微生物，具有生长速度快、发酵生产周期短、易于工业化发酵等特点，从而使植物内生真菌成为寻找和发现各种天然生物活性物质的新资源。许多源于植物内生真菌的次生代谢产物被鉴定出具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、杀虫以及酶抑制剂等多种生物学活性。植物内生真菌所产生的结构新颖、活性多样的化合物为新型抗真菌药物的发现提供了重要的先导化合物和新的药物作用靶点，成为天然活性产物和新药开发的重要来源。技术实现要素：为克服现有果蔬软腐病治疗难题，本发明的目的旨在提供一种香椿内生真菌TS8及其次级代谢产物、制备方法和应用。为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：一种香椿内生真菌TS8，该真菌为子囊菌门Ascomycota、子囊菌纲Ascomycetes、粪壳亚纲Sordariomycetidae、粪壳目Sordariales、毛壳科Chaetomiaceae、毛壳属Chaetomium、球毛壳菌Chaetomiumglobosum；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2016年9月30日，保藏号：CGMCCNo.12979，分类命名：球毛壳菌Chaetomiumglobosum。本发明提供了两种制备香椿内生真菌56-50的次级代谢产物的方法，具体如下：方法一，步骤如下：（1）菌株发酵：将保藏号为CGMCCNo.12979的香椿内生真菌TS8接种到PDA平板培养基上，25-28℃活化培养3-5d，然后接种到盛有PDA液体发酵培养基的锥形三角瓶中，25-28℃、150-180rpm摇床发酵培养6-8d；（2）菌株次级代谢产物的制备：将步骤（1）所得菌株TS8的发酵培养液先搅碎，再过滤，得到发酵液和菌丝体；然后采用乙酸乙酯分别对发酵液和菌丝体进行萃取，重复萃取数次，合并萃取液，浓缩制备得到香椿内生真菌TS8的次级代谢产物；其中，对发酵液进行萃取时，乙酸乙酯的用量与发酵液等体积；对菌丝体进行萃取时，乙酸乙酯的用量以浸泡住菌丝体为准。方法二，步骤如下：（1）菌株发酵：将保藏号为CGMCCNo.12979的香椿内生真菌TS8接种到PDA平板培养基上，25-28℃活化培养3-5d，然后接种到盛有PDA液体发酵培养基的锥形三角瓶中，室温静置发酵培养25-30d；（2）菌株次级代谢产物的制备：将步骤（1）所得菌株TS8的发酵培养液先搅碎，再过滤，得到发酵液和菌丝体；发酵液用等体积乙酸乙酯萃取，重复萃取数次，合并萃取液，真空浓缩至干，得到发酵液的乙酸乙酯层萃取物；菌丝体用80v%的丙酮水溶液浸泡提取，反复提取数次，合并提取液，真空浓缩至不含丙酮后，再用等体积的乙酸乙酯萃取，重复萃取数次，然后合并萃取液并且真空浓缩至干，得到菌丝体的乙酸乙酯层萃取物；最后合并发酵液与菌丝体的乙酸乙酯层萃取物，即得香椿内生真菌TS8的次级代谢产物。利用上述两种制备方法制备的香椿内生真菌TS8的次级代谢产物。所述香椿内生真菌TS8的次级代谢产物在降解软腐病欧文氏菌和/或青枯病茄科雷尔氏菌中的应用。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：（1）本发明首次从香椿植物茎中分离得到一株内生真菌TS8(Chaetomiumglobosum)，该菌次级代谢产物对软腐病欧文氏菌和青枯病茄科雷尔氏菌具有较好的抑制作用；（2）所述的制备香椿内生真菌TS8(Chaetomiumglobosum)次级代谢产物的方法简单易行，成本低。附图说明图1为实施例1香椿内生真菌TS8菌株形态特征，其中a为菌落正面形态，b为菌落反面形态，c、d分别为菌丝（×20）及（×100）形态。图2为实施例1香椿内生真菌TS8的18SrDNA基因片段扩增图谱，其中1--18SrDNA基因片段扩增产物，2为DNALadderMixMarker。图3为实施例1香椿内生真菌TS8的ITSrDNA基因片段扩增图谱，1--ITSrDNA基因片段扩增产物，2为DNALadderMixMarker。图4为实施例1香椿内生真菌TS8菌株基于18S基因序列构建的系统进化树。图5为实施例1香椿内生真菌TS8菌株基于ITS基因序列构建的系统进化树。具体实施方式下面结合具体实施例进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施例的限制。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中：供试香椿材料：采自河南省郑州市中牟县田庄村河南省农业科学院香椿示范基地。供试菌株：购自中国农业微生物菌种保藏管理中心的欧文氏菌(Erwiniasp)ACCC02203和茄科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)ACCC01474。PDA平板培养基和/或PDA斜面培养基的重量百分比组成为：土豆20%、葡萄糖2%、琼脂2%，余量为水，pH6.0；PDA液体发酵培养基的重量百分比组成为：土豆20%、葡萄糖1%、麦芽糖2%、甘露醇2%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.3%、味精0.5%，余量为水，pH6.0；营养肉汁培养基的重量百分比组成为：蛋白胨1%，牛肉提取物0.3%，NaCl0.5%，余量为水，pH7.0。营养肉汁琼脂培养基的重量百分比组成为：蛋白胨1%，牛肉提取物0.3%，NaCl0.5%，琼脂2%，余量为水，pH7.0。实施例11.香椿内生真菌的分离与筛选在无菌操作条件下，将香椿茎在75v%乙醇中浸泡1min，取出后在有效氯3wt%次氯酸钠溶液中浸泡1min，再在75v%乙醇中浸泡30s，然后用无菌水漂洗3次，无菌吸水纸干燥；用灭菌后的剪刀将其剪成0.5cm左右的小块，放在PDA平板培养基上，每板4根，于28℃恒温培养箱培养5d，当植物组织内部向培养基周围长出菌丝时，将菌丝转移到新的PDA平板培养基上划线培养，5d后分离纯化得到单个菌落，然后转移到PDA斜面培养基试管中，28℃恒温培养5d后，即获得香椿内生真菌TS8，4℃冰箱保存，备用，并于2016年9月30日，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CGMCCNo.12979。2.香椿内生真菌的鉴定2.1菌株形态特征观察（1）菌落形态学特征：将4℃冰箱保存的香椿内生真菌TS8接种在PDA平板培养基上，28℃连续培养4-5d，观察菌落的颜色、大小、质地等形态特征。（2）显微镜形态学特征：制作水浸片，在光学显微镜下观察菌株的菌丝体。2.2菌株18S、ITSrDNA序列及其系统发育学分析2.2.1基因组DNA的提取将4℃冰箱保存的香椿内生真菌TS8转接到PDA平板培养基上，28℃培养5天。基因组DNA的提取采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(SK8259)，严格按照说明书操作。提取的基因组DNA在1％琼脂糖凝胶中电泳检测(150V，100mA20min)，4℃保存备用，或于-20℃中长期保存。2.2.218SrDNA和ITS基因片段的PCR扩增18SrDNA扩增引物：NS1(5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’)，NS6(5’-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3’)。ITSrDNA扩增引物：ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)，ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。PCR反应条件如表1所示：PCR扩增反应所用试剂购自上海生工有限公司，PCR反应体系如表2所示：PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后4℃保存备用。2.2.3目的DNA序列测序和系统发育学分析将18SrDNA和ITSrDNA的PCR产物交由上海生工有限公司进行测序。获得序列后，在NCBI中进行Blast比对，下载与供试菌株序列同源性相近的菌株序列利用ClustalX软件进行序列的多重比对，利用MEGA7.0软件N-J方法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，自展数为1000。3.菌株小量发酵将4℃冰箱保存的香椿内生真菌TS8接种到PDA平板培养基上，28℃培养箱活化培养4d，然后接种到盛有200mLPDA液体发酵培养基的锥形三角瓶中，28℃、150rpm摇床发酵培养7d。4.菌株次级代谢产物的制备菌株发酵完成后，香椿内生真菌TS8的发酵培养液先用匀浆搅拌机搅碎，再用布氏漏斗抽滤，得到发酵液和菌丝体；然后采用乙酸乙酯分别对发酵液和菌丝体进行萃取，重复萃取3次，合并萃取液，浓缩，制备得到香椿内生真菌TS8的次级代谢产物；其中，对发酵液进行萃取时，乙酸乙酯的用量与发酵液等体积；对菌丝体进行萃取时，乙酸乙酯的用量以浸泡住菌丝体为准。5.离体抑菌活性测定采用琼脂扩散法中的滤纸片法。5.1香椿内生真菌TS8的次级代谢产物用无水乙醇溶解配成20mg/mL质量浓度的溶液，作为供试样液。5.2欧文氏菌(Erwiniasp)ACCC02203接种于营养肉汁培养基中，30℃培养12h。5.3吸取1mL5.2培养12h的试验菌液至100mL已加热的营养肉汁琼脂培养基中，混匀，倒平板，然后用镊子分三个地方（即平行3次）将打好孔的4层滤纸片(6mm)放置在培养基表面，并吸取15µL供试样液置于每个滤纸片的孔中，平板于30℃培养12h后观察并测定抑菌圈的直径。同时作阳性对照实验，其中，阳性对照为1mg/mL和10mg/mL链霉素。6.结果6.1菌株形态特征菌落正面形态和反面形态分别见图1a、图1b，菌丝20倍和100倍形态分别见图1c、图1d。可知：TS8菌株菌落正面为白色菌丝，絮状棉质，生长茂密；反面则呈淡黄色（图1a、b）。菌株生长速度较快，28℃培养4-5d菌落布满培养皿。显微镜观察下菌丝有分支，有隔，光滑透明（图1c、d）。6.2菌株的18S、ITS序列及其系统发育学分析18S和ITSrDNA基因片段的PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，如图2、3所示，扩增产物分别为1200bp和600bp左右的特异性扩增条带，大小与期望值相符。18S和ITSrDNA基因片段的PCR扩增产物由上海生工有限公司进行测序，测序结果，分别如序列表SEQIDNo.1和序列表SEQIDNo.2所示，表明：该菌株的18S和ITSrDNA基因序列长度分别为1203bp和553bp。将PCR扩增获得的18SrDNA序列（SEQIDNo.1）在NCBI中进行BLAST分析，结果表明，菌株TS8的18SrDNA序列与球毛壳属Chaetomiumsp.的18S序列同源性最高，相似性达100%。利用ClastalX与Mega5.0软件，基于18SrDNA序列构建系统发育树，见图4，从系统进化树上可以看出，每一个属分别形成一个独立的分枝，菌株TS8与Chaetomiumglobosum(JN639019.1)、Chaetomiumglobosum(JN394588.1)和Chaetomiumsp.(EU826480.1)处于同一分枝，亲缘关系最近，判断该菌株为球毛壳属。将PCR扩增获得的ITSrDNA序列（SEQIDNo.2）在NCBI中进行BLAST比对，结果表明，该序列与Chaetomiumglobosum的ITS序列同源性很高，相似性达99%。基于ITSrDNA序列构建系统发育树，见图5，从系统发育树可以看出每一个种分别形成一个独立的分枝，菌株TS8与Chaetomiumglobosum(GQ906953.1)和Chaetomiumglobosum(KJ186956.1)聚为一枝，自展值为99，表现出非常近的亲缘关系。综合菌落形态、显微形态特征以及18S和ITSrDNA基因序列分析结果，将香椿内生真菌TS8鉴定为子囊菌门Ascomycota、子囊菌纲Ascomycetes、粪壳亚纲Sordariomycetidae、粪壳目Sordariales、毛壳科Chaetomiaceae、毛壳属Chaetomium、球毛壳菌Chaetomiumglobosum。6.3抑菌活性抑菌结果如表3所示，香椿内生真菌菌株TS8的次级代谢产物对欧文氏菌的抑菌圈为19.20±2.39mm，大于10mg/mL阳性对照链霉素的抑菌圈(16.01±0.58mm)，所以该菌株次级代谢产物对欧文氏菌具有比较显著的抑制作用。表3：菌株TS8的次级代谢产物链霉素1mg/mL链霉素10mg/mL实施例119.20±2.3912.16±0.1916.01±0.58实施例2与实施例1基本相同，区别在于：本实施例按照以下主要步骤完成菌株次级代谢产物的发酵、制备及抑菌活性测定。1-2步骤同实施例1。3.菌株小量发酵：将4℃冰箱保存的香椿内生真菌TS8接种到PDA平板培养基上，28℃培养箱活化培养4d，然后接种到盛有200mLPDA液体发酵培养基的锥形三角瓶中，室温静置发酵培养30d。4.菌株次级代谢产物的制备：菌株发酵完成后，菌株TS8的发酵培养液先用匀浆搅拌机搅碎，然后布氏漏斗抽滤，得到发酵液和菌丝体；发酵液用等量乙酸乙酯萃取，重复萃取3次，合并发酵液的乙酸乙酯层萃取物，真空浓缩至干，即得到发酵液的乙酸乙酯层萃取物；菌丝体用80v%的丙酮水溶液（即丙酮在水溶液中占的体积分数为80%）浸泡提取，反复3次，合并提取液，真空浓缩至不含丙酮后，再用等体积的乙酸乙酯萃取，重复3次，然后合并乙酸乙酯萃取液并且真空浓缩至干，即得到菌丝体的乙酸乙酯层萃取物，最后合并得到发酵液与菌丝体的乙酸乙酯层萃取物，即为香椿内生真菌TS8的次级代谢产物。5.活性测定采用琼脂扩散法中的滤纸片法。5.1香椿内生真菌TS8的次级代谢产物用无水乙醇溶解配成20mg/mL质量浓度的溶液，作为供试样液。5.2茄科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)ACCC01474接种于营养肉汁培养基中，30℃培养12h。5.3吸取1mL5.2培养12h的试验菌液至100mL已加热的营养肉汁琼脂培养基中，混匀，倒平板，然后用镊子分三个地方（即平行3次）将打好孔的4层滤纸片(6mm)放置在培养基表面，并吸取15µL供试样液置于每个滤纸片的孔中，平板于30℃培养12h后观察并测定抑菌圈的直径。同时作阳性对照实验，其中，阳性对照为1mg/mL和10mg/mL链霉素。6.结果：抑菌结果如表4所示，香椿内生真菌菌株TS8的次级代谢产物对茄科雷尔氏菌的抑菌圈为19.59±0.24mm，与1mg/mL阳性对照链霉素的抑菌圈（19.93±0.75mm）相当。所以该菌株次级代谢产物对茄科雷尔氏菌具有较好的抑制作用。表4：菌株TS8的次级代谢产物链霉素1mg/mL链霉素10mg/mL实施例219.59±0.2419.93±0.7527.75±0.84SEQUENCELISTING<110>河南省农业科学院<120>一种香椿内生真菌TS8及其次级代谢产物、制备方法和应用<130><160>2<170>PatentInversion3.4<210>1<211>1203<212>DNA<213>人工合成<400>1gtaccttactacatggataaccgtggtaattctagagctaatacatgctaaaaatcccga60cttcggaagggatgtatttattagattaaaaaccaatgcccttcggggctctctggtgat120tcataataacttctcgaatcgcacggccttgcgccggcgatggttcattcaaatttctgc180cctatcaactttcgacggctgggtcttggccagccgtggtgacaacgggtaacggagggt240tagggctcgaccccggagaaggagcctgagaaacggctactacatccaaggaaggcagca300ggcgcgcaaattacccaatcccgacacggggaggtagtgacaataaatactgatacaggg360ctctttcgggtcttgtaattggaatgagtacaatttaaatcccttaacgaggaacaattg420gagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatattaaagt480tgttgaggttaaaaagctcgtagttgaaccttgggcctagccggccggtccgcctcaccg540cgtgcactggctcggctgggtctttccttctggagaaccgcatgcccttcactgggtgtg600ccggggaaccaggacttttactctgaacaaattagatcgcttaaagaaggcctatgctcg660aatacattagcatggaataatagaataggacgtgtggttctattttgttggtttctagga720ccgccgtaatgattaatagggacagtcgggggcatcagtattcaattgtcagaggtgaaa780ttcttggatttattgaagactaactactgcgaaagcatttgccaaggatgttttcattaa840tcaggaacgaaagttaggggatcgaagacgatcagataccgtcgtagtcttaaccataaa900ctatgccgattagggatcggacggcgttattttttgacccgttcggcaccttacgataaa960tcaaaatgtttgggctcctgggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaaagaaattgac1020ggaagggcaccaccaggggtggagcctgcggcttaatttgactcaacacggggaaactca1080ccaggtccagacacgatgaggattgacagattgagagctctttcttgatttcgtgggtgg1140tggtgcatggccgttcttagttggtggagtgatttgtctgcttaattgcgataacgaacg1200aga1203<210>2<211>553<212>DNA<213>人工合成<400>2cctgcggagggatcattacagagttgcaaaactccctaaaccattgtgaacgttacctac60accgttgcttcggcgggcggccccggggtttaccccccgggcgcccctgggccccaccgc120gggcgcccgccggaggtcaccgaactcttgatactttatggcctctctgagtcttctgta180ctgaataagtcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgca240gcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgc300acattgcgcccgccagtattctggcgggcatgcctgttcgagcgtcatttcaaccatcaa360gcccccgggcttgtgttggggacctgcggctgccgcaggccctgaaaagcagtggcgggc420tcgctgtcacaccgagcgtagtagcatacatctcgctccggtcgtgctgcgggttccggc480cgttaaaccaccttttaacccaaggttgacctcggatcaggtaggaagacccgctgaact540taagcatatcaat553当前第1页1 2 3