1.一种人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法,所述的方法包括以下步骤:
A、RPS5的原核表达及工程菌破碎;
B、RPS5变性蛋白阳离子交换层析纯化;
C、RPS5变性蛋白阴离子交换层析纯化;
D、RPS5变性蛋白复性;
E、RPS5蛋白凝胶过滤层析纯化。
2.根据权利要求1所述的人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法,其特征在于,步骤A中,RPS5的原核表达的工程菌用大肠杆菌,表达所用的LB培养基中添加1%~10%的葡萄糖或者甘油。
3.根据权利要求1或2所述的人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法,其特征在于,步骤A中,4℃高速离心收集原核表达RPS5的工程菌的菌体,按照1g菌体湿重使用10mL第一缓冲液悬浮,置于冰上超声破碎,参数为功率300w、工作时间3s、间隙时间3s、工作次数99次,高速离心去掉上清;直到离心上清液淡黄色消失为止;
所述的第一缓冲液为:40-60mmol/L NaH2PO4,pH 7.2。
4.根据权利要求1或2所述的人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法,其特征在于,步骤B中,在第二缓冲液条件下溶解RPS5包涵体蛋白,高速离心去掉不溶物,上清液上样于阳离子交换层析柱,使用第二缓冲液充分洗涤杂蛋白,使用第三缓冲液再次充分洗去杂蛋白,最后使用第四缓冲液洗脱目的蛋白;
所述的第二缓冲液为:8mol/L尿素和40-60mmol/L NaH2PO4,pH 7.2;
所述的第三缓冲液为:8mol/L尿素、20mmol/L NaCl和40-60mmol/L NaH2PO4,pH 7.2;
所述的第四缓冲液为:8mol/L尿素、300mmol/L NaCl和40-60 mmol/L NaH2PO4,pH 7.2。
5.根据权利要求1或2所述的人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法,其特征在于,步骤C中,使用第八缓冲液透析从阳离子柱洗脱下来的目的蛋白溶液,在第八缓冲液条件下,将目的蛋白上样于阴离子交换柱,收集穿透液;
所述的第八缓冲液为:8mol/L尿素和10mmol/L-30mmol/L Tris,pH 8.0。
6.根据权利要求1或2所述的人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法,其特征在于,步骤D中,在4℃条件下,使用透析的方法逐步降低变性剂浓度至完全去除变性剂来复性RPS5蛋白;所用的缓冲液不含NaCl。
7.根据权利要求6所述的人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法,其特征在于,步骤D为:纯化好的RPS5变性蛋白溶液开始透析于第九缓冲液中6h以上,然后每隔3h使用预冷的第十缓冲液置换1/5、2/5、3/5、4/5体积的透析液,最后完全使用第十缓冲液透析蛋白溶液两次;高速离心得到的上清液即为复性的RPS5蛋白溶液;复性的RPS5蛋白溶液保存于4℃条件下;
所述的第九缓冲液为:8mol/L尿素、50mmol/L-150mmol/L Hepes和1mmol/L DTT,pH 7.2;
所述的第十缓冲液为:50mmol/L-150mmol/L Hepes和1mmol/L DTT,pH 7.2。
8.根据权利要求1或2所述的人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法,其特征在于,步骤E中,使用截留分子量为10kDa的超滤管浓缩复性好的RPS5蛋白,上样于预先使用第十缓冲液平衡好的凝胶过滤层析柱,使用第十缓冲液洗脱至出峰,收集蛋白峰;
所述的第十缓冲液为:100mmol/L Hepes和1mmol/L DTT,pH 7.2。
9.根据权利要求1或2所述的人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法,其特征在于,步骤A中的RPS5的原核表达为:
原核表达载体的构建:PCR扩增两端带有Nco I酶和BamH I酶酶切位点的RPS5基因片段,上游引物如SEQ ID NO:1所示;下游引物为如SEQ ID NO:2所示;所使用的表达载体为pET-28a(+),PCR扩增产物插入的酶切位点为Nco I和BamH I之间,使用质粒PCR法鉴定出阳性克隆;
原核表达:使用的工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)种,使用的培养基为添加了1%-10%的葡萄糖或者甘油的LB培养基,工程菌起始诱导菌液OD600=1.6±0.1,诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度为0.2mmol/L;诱导时间为3h;诱导温度为37℃。
10.根据权利要求8所述的人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法,其特征在于,收集到的RPS5蛋白纯度达99%以上;浓度达3mg/mL以上。