聚乙烯醇‑丝胶‑纳米银增强型复合薄膜抗菌材料的制备方法及其产品和应用与流程

本发明属于生物医学抗菌材料领域，具体涉及聚乙烯醇-丝胶-纳米银增强型复合薄膜抗菌材料的制备方法，还涉及由该方法制得的产品和该产品的应用。

背景技术：

蚕丝蛋白主要由丝素蛋白和丝胶蛋白组成。其中丝胶占总茧重的20-30％，丝素占总茧重的70-80％，丝素被广泛地用于纺织工业和医疗领域。然而，长期以来，丝胶在蚕丝脱胶处理过程中被当作废物而丢弃。世界上每年流失的丝胶高达500000吨，并且丝胶在降解过程中需要消耗大量的氧，因此丝胶的排放无疑会造成严重的环境污染。如果丝胶这种天然的生物蛋白能够被合理的开发利用，不仅可以产生重大的经济效益，而且可以减少对环境的污染。丝胶是由多种多肽组成，含有18种氨基酸，这18种氨基酸中包括人体所需的一些必须氨基酸。其中含量最多的三种氨基酸丝氨酸，天冬氨酸和谷氨酸都有相应的药理用途。丝氨酸可以防治高血压、合成治疗结核病和抗肿瘤药物。甘氨酸能降低血液中的胆固醇、血糖的含量对于防治高血压和糖尿病有很好的作用。天门冬氨酸对肝和心肌都有保护作用，可以用于治疗心绞痛、心肌梗塞等疾病。此外，丝胶蛋白具有良好的生物活性，如抗氧化性、促进细胞的增殖与分化等，除此之外，丝胶还具有生物可降解性、良好的亲水性，并且拥有丰富的极性基团，因此受到越来越多的关注并应用于再生医学领域，但是丝胶本身的一些缺陷如易碎等限制了它的应用。目前通常采用共混、接枝大分子聚合物的方法对丝胶进行改性，从而拓宽丝胶蛋白在不同领域的应用。

随着科技的发展，纳米技术受到了越来越多的关注。形形色色具备不同结构和功能的纳米材料被制备出来，并广泛地应用于不同的领域。纳米银系列抗菌材料是一类广泛应用的纳米抗菌材料，具有比表面积大、表面反应活性高、表面活性中心多、催化效率高、吸附能力强等特点。纳米银抗菌材料具有广谱的抗菌活性，对于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有良好的抗性，并具有耐热性好、安全性高、不易产生耐药性等优势，但是在实际应用中，纳米银容易脱落，从而导致其长期的抗菌活性受到一定的影响。而将纳米银与丝胶蛋白联合同时改善丝胶蛋白和纳米银的性能未见报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种聚乙烯醇-丝胶-纳米银增强型复合薄膜抗菌材料的制备方法；本发明的目的之二在于提供由该方法制得的产品；本发明的目的之三在于提供聚乙烯醇-丝胶-纳米银增强型复合薄膜抗菌材料在制备抗菌材料中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

聚乙烯醇-丝胶-纳米银增强型复合薄膜抗菌材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)丝胶粉末的制备：取蚕茧进行脱胶，收集丝胶溶液，然后将丝胶溶液冻结后进行冷冻干燥，得丝胶粉末；

(2)聚乙烯醇-丝胶复合薄膜的制备：将步骤(1)制得丝胶粉末加水溶解，得丝胶溶液；然后将丝胶溶液与聚乙烯醇溶液共混，经过冷冻-解冻循环得到丝胶-聚乙烯醇复合水凝胶，烘干得聚乙烯醇-丝胶复合薄膜；

(3)聚电解质层包裹的聚乙烯醇-丝胶复合薄膜制备：将步骤(2)所得聚乙烯醇-丝胶复合薄膜先浸泡于聚丙烯酸溶液中，得到表面带负电荷的聚乙烯醇-丝胶复合薄膜；随后浸泡于二甲基二烯丙基氯化铵溶液中，再用聚丙烯酸溶液浸泡，最后用水冲洗后烘干，得聚电解质层包裹的聚乙烯醇-丝胶复合薄膜；

(4)纳米银修饰的聚乙烯醇-丝胶复合薄膜抗菌材料的制备：将步骤(3)所得聚电解质层包裹的聚乙烯醇-丝胶复合薄膜置于AgNO₃溶液中，利用紫外辐照还原法在丝胶-聚乙烯醇共混薄膜的表面合成纳米银，获得聚乙烯醇-丝胶-纳米银增强型复合薄膜抗菌材料。

本发明中，步骤(1)为取蚕茧剪碎，浴比为1：30加水，于120℃、0.1Mpa条件下脱胶20～30min；然后在-80℃冻结后经过冷冻干燥，得丝胶粉末。

本发明步骤(2)中，所述丝胶溶液的浓度为4％(w/t)；所述聚乙烯醇溶液浓度为5％(wt)；所述冷冻-解冻循环是在-20℃条件下冷冻4小时，然后放于18-25℃条件下解冻1～2小时，循环4次；所述烘干的温度为55℃。

优选的，所述丝胶溶液与聚乙烯醇溶液的质量比为3：3。

本发明中，步骤(3)为将步骤(2)所得聚乙烯醇-丝胶复合薄膜先浸泡于浓度为2％(w/v)的聚丙烯酸溶液中2～8min，得到表面带负电荷的聚乙烯醇-丝胶复合薄膜；随后浸泡于浓度为2％(w/v)的二甲基二烯丙基氯化铵溶液中2～8min，再用浓度为2％(w/v)的聚丙烯酸溶液浸泡2～8min，最后用去离子水冲洗后烘干，得聚电解质层包裹的聚乙烯醇-丝胶复合薄膜。

本发明中，步骤(4)为将步骤(3)所得聚电解质层包裹的聚乙烯醇-丝胶复合薄膜置于浓度为20mM AgNO₃溶液中，紫外辐照至少10min，获得聚乙烯醇-丝胶-纳米银增强型复合薄膜抗菌材料。

2、由所述制备方法制得的聚乙烯醇-丝胶-纳米银增强型复合薄膜抗菌材料。

3、所述聚乙烯醇-丝胶-纳米银增强型复合薄膜抗菌材料在制备抗菌材料中的应用。

优选的，所述抗菌材料为抗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌材料。

更优选的，所述抗革兰氏阳性菌为大肠杆菌，所述革兰氏阴性菌为金黄色葡萄球菌。

本发明的有益效果在于：本发明公开了聚乙烯醇-丝胶-纳米银增强型复合薄膜抗菌材料的制备方法，利用从蚕茧中提取的丝胶蛋白与聚乙烯醇共混后，成功制备了具有良好力学性能的聚乙烯醇-丝胶复合薄膜；然后通过静电吸附作用在聚乙烯醇-丝胶复合薄膜表面负载带电聚合物层，再利用紫外还原法在聚乙烯醇-丝胶复合薄膜表面修饰纳米银，提高了纳米银的负载量，并使纳米银在复合薄膜表面修饰牢固，从而得到一种具有持久抗菌活性的聚乙烯醇-丝胶-纳米银增强型复合薄膜抗菌材料。这种自组装薄膜的实验方法简单，容易重复；聚合物层与层之间通过强烈的静电相互作用力结合在一起，提高了聚电解质薄膜结构的稳定性；适用范围广。理论上，任何带有相反电荷的分子都可以通过该方法自组装形成聚电解质层，该方法具有较强的实用性。在聚乙烯醇-丝胶复合薄膜的表面包被聚电解质层，不仅可以提高银纳米离子的负载量，而且可以通过静电吸附作用，增强银纳米离子与聚电解质层的结合，从而赋予了聚乙烯醇-丝胶复合薄膜长效持久地抗菌活性。该薄膜具有良好的机械性能、生物相容性、吸水性和高效持久的抗菌性能，可用于抗菌敷料等相关医用生物材料领域，具有良好的应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为聚乙烯醇-丝胶-纳米银增强型复合薄膜抗菌材料的制备原理示意图。

图2为聚乙烯醇-丝胶-纳米银增强型复合薄膜抗菌材料的表面扫描电子显微镜照片(A：聚电解质层包裹的聚乙烯醇-丝胶复合薄膜；B：复合薄膜置于20mM AgNO₃溶液中紫外照射10min；C：聚电解质层包裹的复合丝胶薄膜置于20mM AgNO₃溶液中紫外照射10min；D：聚电解质层包裹的复合丝胶薄膜置于20mM AgNO₃溶液中紫外照射30min)。

图3为聚乙烯醇-丝胶-纳米银增强型复合薄膜抗菌材料的XRD图谱。

图4为聚乙烯醇-丝胶-纳米银增强型复合薄膜抗菌材料的FT-IR图谱(a：丝胶；b：聚乙烯醇-丝胶复合薄膜；c：聚电解质层包裹的复合薄膜；d：纳米银修饰的聚电解质层包裹的复合薄膜)。

图5为添加聚乙烯醇-丝胶-纳米银增强型复合薄膜抗菌材料后大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长曲线(A：大肠杆菌的生长曲线；B：金黄色葡萄球菌的生长曲线)。

图6为添加聚乙烯醇-丝胶-纳米银增强型复合薄膜抗菌材料后大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌环(A为大肠杆菌的抑菌环图；B为金黄色葡萄球菌的抑菌环图)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

聚乙烯醇-丝胶-纳米银增强型复合薄膜抗菌材料，其原理图如图1所示，具体是通过高温高压的方法，从家蚕蚕茧中提取丝胶蛋白，然后在丝胶溶液中加入聚乙烯醇溶液，混合均匀，经过冷冻-解冻循环后烘干得到聚乙烯醇-丝胶复合薄膜；然后通过静电相互作用在复合薄膜表面包裹聚电解质层，利用静电吸附将带正电荷的银离子吸附在复合薄膜的表面，然后用紫外辐照还原的方法将纳米银修饰在复合薄膜表面，进而获得聚乙烯醇-丝胶-纳米银增强型复合薄膜抗菌材料。该薄膜具有良好的机械性能、生物相容性、吸水性和高效持久的抗菌性能，可用于抗菌敷料等相关医用生物材料领域。

实施例1

聚乙烯醇-丝胶-纳米银增强型复合薄膜抗菌材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)丝胶粉末的制备：称取一定重量的蚕茧，剪碎，按照1：30的浴比在121℃、0.1MPa的条件下高温高压30min，经过滤处理得到丝胶溶液，再将丝胶溶液置于-80℃的条件下冷冻4h，然后冷冻干燥，得到丝胶粉末；

(2)聚乙烯醇-丝胶复合薄膜的制备：将步骤(1)所得丝胶粉末按浓度为4％(wt)溶于热水(90℃)中，得到的丝胶溶液，然后向丝胶溶液中按质量比为3：3加入浓度为5％(wt)的聚乙烯醇溶液，混合均匀后，放于-20℃冷冻4h后，放于室温(18～25℃)解冻1h，经过4次冷冻-解冻循环后，取出成形的复合水凝胶，55℃烘干后得到聚乙烯醇-丝胶复合薄膜；

(3)聚电解质层包裹的聚乙烯醇-丝胶复合薄膜制备：将步骤(2)所得聚乙烯醇-丝胶复合薄膜浸泡于2％(w/v，g/ml)聚丙烯酸溶液(PAA)中2min，然后置于2％(w/v，g/ml)的二甲基二烯丙基氯化铵(PDDA)溶液中浸泡2min，再置于2％(w/v，g/ml)聚丙烯酸溶液(PAA)中浸泡2min，去离子水冲洗，烘干后得到聚电解质层包裹的复合薄膜，其中聚电解质层为PAA-PDDA-PAA。

(4)纳米银修饰的聚乙烯醇-丝胶复合薄膜抗菌材料的制备：将步骤(3)所得聚电解质包裹的聚乙烯醇-丝胶复合薄膜放入20mM的AgNO₃溶液中，经过紫外辐照10min后，将纳米银修饰在复合薄膜的表面，获得聚乙烯醇-丝胶-纳米银增强型复合薄膜抗菌材料。

实施例2

聚乙烯醇-丝胶-纳米银增强型复合薄膜抗菌材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)丝胶粉末的制备：称取一定重量的蚕茧，剪碎，按照1：30的浴比在121℃、0.1MPa的条件下高温高压30min，经过滤处理得到丝胶溶液，再将丝胶溶液置于-80℃的条件下冷冻4h，然后冷冻干燥，得到丝胶粉末；

(2)聚乙烯醇-丝胶复合薄膜的制备：将步骤(1)所得丝胶粉末按浓度为4％(wt)溶于热水(90℃)中，得到的丝胶溶液，然后向丝胶溶液中按质量比为3：3加入浓度为5％(wt)的聚乙烯醇溶液，混合均匀后，放于-20℃冷冻4h后，放于室温(18～25℃)解冻1h，经过4次冷冻-解冻循环后，取出成形的复合水凝胶，55℃烘干后得到聚乙烯醇-丝胶复合薄膜；

(3)聚电解质层包裹的聚乙烯醇-丝胶复合薄膜制备：将步骤(2)所得聚乙烯醇-丝胶复合薄膜浸泡于2％(w/v，g/ml)聚丙烯酸溶液(PAA)中4min，然后置于2％(w/v，g/ml)的二甲基二烯丙基氯化铵(PDDA)溶液中浸泡4min，再置于2％(w/v，g/ml)聚丙烯酸溶液(PAA)中浸泡4min，去离子水冲洗，烘干后得到聚电解质层包裹的复合薄膜，其中聚电解质层为PAA-PDDA-PAA。

(4)纳米银修饰的聚乙烯醇-丝胶复合薄膜抗菌材料的制备：将步骤(3)所得聚电解质包裹的聚乙烯醇-丝胶复合薄膜放入20mM的AgNO₃溶液中，经过紫外辐照10min后，将纳米银修饰在复合薄膜的表面，获得聚乙烯醇-丝胶-纳米银增强型复合薄膜抗菌材料。

实施例3

聚乙烯醇-丝胶-纳米银增强型复合薄膜抗菌材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)丝胶粉末的制备：称取一定重量的蚕茧，剪碎，按照1：30的浴比在121℃、0.1MPa的条件下高温高压30min，经过滤处理得到丝胶溶液，再将丝胶溶液置于-80℃的条件下冷冻4h，然后冷冻干燥，得到丝胶粉末；

(2)聚乙烯醇-丝胶复合薄膜的制备：将步骤(1)所得丝胶粉末按浓度为4％(wt)溶于热水(90℃)中，得到丝胶溶液，然后向丝胶溶液中按质量比为3：3加入浓度为5％(wt)的聚乙烯醇溶液，混合均匀后，放于-20℃冷冻4h后，放于室温(18～25℃)解冻1h，经过4次冷冻-解冻循环后，取出成形的复合水凝胶，55℃烘干后得到聚乙烯醇-丝胶复合薄膜；

(3)聚电解质层包裹的聚乙烯醇-丝胶复合薄膜制备：将步骤(2)所得聚乙烯醇-丝胶复合薄膜浸泡于2％(w/v，g/ml)聚丙烯酸溶液(PAA)中8min，然后置于2％(w/v，g/ml)的二甲基二烯丙基氯化铵(PDDA)溶液中浸泡8min，再置于2％(w/v，g/ml)聚丙烯酸溶液(PAA)中浸泡8min，去离子水冲洗，烘干后得到聚电解质层包裹的复合薄膜，其中聚电解质层为PAA-PDDA-PAA。

(4)纳米银修饰的聚乙烯醇-丝胶复合薄膜抗菌材料的制备：将步骤(3)所得聚电解质包裹的聚乙烯醇-丝胶复合薄膜放入20mM的AgNO₃溶液中，经过紫外辐照10min后，将纳米银修饰在复合薄膜的表面，获得聚乙烯醇-丝胶-纳米银增强型复合薄膜抗菌材料。

实施例4、表征测试

对实施例1～3制得的聚乙烯醇-丝胶-纳米银增强型复合薄膜抗菌材料进行相关表征测试，具体如下：

(1)扫描电子显微镜(SEM)测试：分别取实施例1～3制备的薄膜各一小块置于贴了导电胶的载物台上，进行喷金处理，在10kV电压，放大1300倍，高真空模式等技术参数下，所得的扫面电镜图像如图2所示。结果显示，将聚电解质层包裹的聚乙烯醇-丝胶增强复合薄膜浸泡于20mM AgNO₃溶液中，经紫外照射后能够在表面修饰纳米银，并且纳米银修饰量随着紫外照射时间的增加而增加，而未包裹聚电解质层的复合薄膜仅能修饰少量纳米银，表明在聚乙烯醇-丝胶增强复合薄膜表面包裹聚电解质层能够提高纳米银粒子的负载量。

(2)X射线衍射(XRD)测试：分别取实施例1～3制备的薄膜进行XRD图谱分析，结果如图3所示。结果表明纳米银成功修饰于聚电解质层包裹的聚乙烯醇-丝胶复合薄膜表面。

(3)FT-IR图谱检测结果如图4所示。结果显示，纳米银修饰的聚电解质层包裹的复合薄膜在3274cm^-1，1640cm^-1，1531cm^-1和1248cm^-1处有特征峰，表明聚电解质层包裹的复合薄膜表面成功修饰纳米银。

(4)抑菌实验

1)、生长曲线实验

本实施例通过对自然生长的细菌和加入聚乙烯醇-丝胶复合薄膜、聚电解质层包裹的聚乙烯醇-丝胶复合薄膜或纳米银修饰的聚乙烯醇-丝胶增强复合薄膜的细菌生长曲线进行对比，从而确定纳米银修饰的聚乙烯醇-丝胶增强复合薄膜的抗菌效果，具体方法为：

①分别取大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)的单菌落接种于灭菌的100mL LB液体培养基(pH 7.4)中，在转速为220rpm、温度为37℃条件下培养12小时；

②分别取步骤(1)活化的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌悬液100μL加入到10mL LB培养基中，每种菌液准备4组，其中一组为空白组，其余3组分别加入聚乙烯醇-丝胶复合薄膜、聚电解质层包裹的聚乙烯醇-丝胶复合薄膜或纳米银修饰的聚乙烯醇-丝胶增强复合薄膜，然后在转速为220rpm、温度为37℃条件下培养，并在0h、1h、2h、3h、4h、6h、8h、12h、14h、18h、22h、26h和30h时取菌悬液0.5mL，于4℃冰箱保藏；

③待培养30h的菌悬液取样后将不同时间取出的菌悬液从4℃冰箱中取出，室温(18-25℃)下放置20-40min后利用紫外分光光度计检测其在600nm处的光吸收值，根据测得的吸收值分别绘制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长曲线，结果如图5所示。分析聚乙烯醇-丝胶复合薄膜、聚电解质层包裹的聚乙烯醇-丝胶复合薄膜或纳米银修饰的聚乙烯醇-丝胶增强复合薄膜对细菌生长的影响，结果显示，添加纳米银修饰的聚乙烯醇-丝胶增强复合薄膜后，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长均受到了明显抑制，且时间长达22h以上，表明本发明制备的纳米银修饰的聚乙烯醇-丝胶复合薄膜具有优异且持久的抗菌活性。

2)、抑菌圈实验

为进一步确定纳米银修饰的复合丝胶薄膜的抗菌作用，利用抑菌圈的方法测试了纳米银修饰的聚乙烯醇-丝胶增强复合薄膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果，具体方法如下：

①分别取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的单菌落接种于灭菌的100mL LB液体培养基(pH7.4)中，在转速为220rpm、温度为37℃条件下培养10小时；

②将步骤(1)活化的菌悬液稀释100倍后取200～300μL加入LB固体培养基表面，并在转速为220rpm的摇床中培养1-2小时，使稀释液均匀分布在琼脂培养基表面；

③取直径为1.5cm的聚乙烯醇-丝胶复合薄膜、聚电解质层包裹的聚乙烯醇-丝胶复合薄膜或纳米银修饰的聚乙烯醇-丝胶增强复合薄膜，平铺在稀释液分布均匀的LB培养基表面；然后在37℃条件下培养12h，结果如图6所示。结果显示，在放置有聚乙烯醇-丝胶复合薄膜的LB培养基中，接种大肠杆菌的培养基和接种金黄色葡萄球菌的培养基上没有形成明显的抑菌圈，表明聚乙烯醇-丝胶复合薄膜本身对大肠杆菌的生长没有抑制作用，在放置聚电解质层包裹的聚乙烯醇-丝胶复合薄膜的LB培养基中，也未观察到明显的抑菌圈，表明聚电解质层本身对细菌的生长没有太大的影响，而在放置有纳米银修饰的聚乙烯醇-丝胶增强复合薄膜的平板中，可以观察到形成了明显的抑菌圈，表明纳米银修饰的聚乙烯醇-丝胶增强复合薄膜具有显著的抑菌能力，聚乙烯醇-丝胶-纳米银增强型复合薄膜抗菌材料具有优异的抗菌性能。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。