1.一种在胶质母细胞瘤中基于CRISPR/Cas9系统同时靶向敲除EGFRwt和EGFRvIII的sgRNA,其特征在于:所述sgRNA的基因序列如Seq ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种在胶质母细胞瘤中基于CRISPR/Cas9系统同时靶向敲除EGFRwt和EGFRvIII的sgRNA,其特征在于:所述sgRNA在EGFR基因的靶向位点位于EGFR基因的第17号外显子上,是表达EGFR跨膜区的基因序列。
3.根据权利要求1所述的一种在胶质母细胞瘤中基于CRISPR/Cas9系统同时靶向敲除EGFRwt和EGFRvIII的sgRNA,其特征在于:所述sgRNA指导的CRISPR/Cas9系统在治疗胶质母细胞瘤的新型药物中的应用。
4.一种胶质母细胞瘤中同时敲除EGFRwt和EGFRvIII的方法,其特征在于:包括以下步骤:
A. Cas9和sgRNA慢病毒设计和包装:将权利要求1所述sgRNA序列使用GV371质粒连接;将含有表达sgRNA或Cas9的质粒的转染体系混合物采用瞬时共转染法转入 293T 高表达细胞系而产生重组慢病毒;最后重组慢病毒分泌到培养基中进行培养而得到大量载体慢病毒;
B.CRISPR/Cas9靶向EGFRwt/vIII抑制胶质瘤细胞:将合成好的Cas9病毒以感染复数为1加入U87胶质瘤细胞,用含10%FBS的DMEM培养,嘌呤霉素筛选5-7天后,加入EGFR sgRNA病毒,5-7天后收集细胞,western blot检测EGFR及下游基因表达,提取DNA进行EGFR基因测序,并行CCK8细胞增殖试验。