胶质母细胞瘤中同时敲除EGFRwt和EGFRvIII的方法与流程

本发明涉及DNA重组技术，更具体地是一种胶质母细胞瘤中同时敲除EGFRwt和EGFRvIII的方法。

背景技术：

胶质瘤是人颅内最常见的原发肿瘤，胶质母细胞瘤是其最恶性的一种，尽管使用先进的技术手术治疗和放化疗，胶质母细胞瘤的平均生存期仍保持在14个月左右，治疗胶质母细胞瘤是一个世界难题。患胶质母细胞瘤的患者，40-60%具有EGFR扩增，约25%伴有EGFR的III型突变（EGFRvIII），这两种情况都使EGFR活性增强，增强肿瘤的恶性程度和降低患者的预后。目前，针对EGFR扩增和突变体治疗的EGFR单克隆抗体（mAb）和小分子抑制剂（TKI）在肺癌中取得了成功，但是因为血脑屏障的存在，mAb和TKI不能到达胶质母细胞瘤，并且许多mAb和TKI并不能针对EGFRvIII起作用。

CRISPR/CAS9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9）是一种新兴的并日趋成熟的基因编辑技术。使用一段序列特异性向导RNA分子(sgRNA)引导核酸内切酶（Cas9）到靶点处，从而完成基因组的编辑。切开的DNA可以通过非同源末端链接（NHEJ）的方式修复DNA损伤，从而形成开放读码框的改变，影响基因的转录与翻译。

对于以EGFR扩增和EGFRvIII突变的胶质母细胞瘤来说，阻断或抑制EGFR wt/vIII的表达是治疗该型肿瘤的有效手段，但是如何同时针对EGFR wt/vIII的表达进行阻断和抑制是摆在眼前的难题。

技术实现要素：

本发明为了解决现有的技术手段无法同时阻断或抑制EGFRwt和EGFRvIII的表达的问题，所提出一种胶质母细胞瘤中同时敲除EGFRwt和EGFRvIII的方法。

本发明是按照以下技术方案实现的。

一种在胶质母细胞瘤中基于CRISPR/Cas9系统同时靶向敲除EGFRwt和EGFRvIII的sgRNA，所述sgRNA的基因序列如Seq ID NO.1所示。

所述sgRNA在EGFR基因的靶向位点位于EGFR基因的第17号外显子上，是表达EGFR跨膜区的基因序列。

所述sgRNA指导的CRISPR/Cas9系统在治疗胶质母细胞瘤的新型药物中的应用。

一种胶质母细胞瘤中同时敲除EGFRwt和EGFRvIII的方法：包括以下步骤：

A. Cas9和sgRNA慢病毒设计和包装：将权利要求1所述sgRNA序列使用GV371质粒连接；将含有表达sgRNA或Cas9的质粒的转染体系混合物采用瞬时共转染法转入 293T 高表达细胞系而产生重组慢病毒；最后重组慢病毒分泌到培养基中进行培养而得到大量载体慢病毒；

B.CRISPR/Cas9靶向EGFRwt/vIII抑制胶质瘤细胞：将合成好的Cas9病毒以感染复数为1加入U87胶质瘤细胞，用含10%FBS的DMEM培养，嘌呤霉素筛选5-7天后，加入EGFR sgRNA病毒，5-7天后收集细胞，western blot检测EGFR及下游基因表达，提取DNA进行EGFR基因测序，并行CCK8细胞增殖试验。

本发明获得了如下有益效果。

本发明有效的解决了现有的技术手段无法同时阻断或抑制EGFRwt和EGFRvIII的表达的问题。使用本发明所述方法可同时稳定的敲除EGFRwt和EGFRvIII两个基因，敲除后可有效的抑制肿瘤发生发展。本发明所述sgRNA有望在治疗EGFR扩增和EGFRvIII突变型胶质母细胞瘤的新型药物中得到应用。

附图说明

图1是本发明敲除EGFRwt/vIII后U87细胞增殖图；

图2是本发明敲除EGFRwt/vIII后LN229细胞增殖图；

图3是本发明敲除EGFR后基因编辑区的基因测序图；

图4是本发明敲除EGFR后EGFRwt/vIII及其下游基因蛋白变化图；

图5是本发明敲除EGFR后小鼠体内实验图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述。

1.Cas9和sgRNA慢病毒设计和包装

Cas9质粒从addgene购买，EGFR sgRNA根据EGFR序列（NM_005228）从http://crispr.mit.edu/设计，取打分最高的序列，位于第17号染色体：AGATCCCGTCCATCGCCACT，将sgRNA序列使用GV371质粒连接。

细胞准备：

1）弃去旧培养液，加入5 ml灭菌 PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然后弃去PBS溶液。

2）用2 ml 胰蛋白酶（Gibco ，Thermo Fisher Scientific，USA）消化对数生长期的293T细胞（ATCC）。

3）以含10%血清的培养基调整细胞密度为5×10⁶ 细胞/10ml，重新接种于100 mm细胞培养皿中，37℃，5% CO₂继续培养，转染前细胞密度80%左右。

质粒转染：

1)转染前 2 h 将细胞培养基更换为 Opti-MEM （Gibco ，Thermo Fisher Scientific，USA）培养基。

2)取20µl表达sgRNA或Cas9的质粒和25µl Lenti-Easy Packaging Mix（ViraPower，Thermo Fisher Scientific，USA），与相应体积（1455µl）的Opti-MEM混合均匀，总体积为1.5 ml，在室温下温育5分钟。

3)将Lipofectamine 2000（Gibco ，Thermo Fisher Scientific，USA）试剂轻柔摇匀，取60μl Lipofectamine 2000与1440µl的Opti-MEM混合均匀，总体积为1.5 ml，在室温下温育5分钟。

4)把稀释后的包装体系与稀释后的 Lipofectamine2000进行混合，轻轻地颠倒混匀（共3ml），不要振荡。在室温下温育20分钟，以便形成 DNA与Lipofectamine 2000 稀释液的转染复合物。

5)将转染体系混合物转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃, 5% CO₂细胞培养箱中培养。

6)培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每盘细胞加入10 ml的 PBS液，轻轻洗涤残余的转染混和物，然后倒去。

7)每盘细胞中加入含10%血清的 DMEM 细胞培养基 12ml，于37℃、5% CO₂培养箱内继续培养48小时。

病毒上清收集：

1）转染后 48~72h，收集细胞上清液，并根据细胞生长状况适当补充新鲜细胞培养基（10% FBS，DMEM）。

2）将收集的细胞上清液1500rpm 离心5分钟，并用 0.22µm 的过滤膜（Millipore，USA）过滤，分装并于-70℃以下储存。

2.CRISPR/Cas9靶向EGFRwt/vIII抑制胶质瘤细胞

将合成好的Cas9病毒以感染复数（MOI）为1加入U87胶质瘤细胞，细胞数量大约为10-15万，含10%FBS（Hyclone）的DMEM(Gibco)培养，嘌呤霉素筛选5-7天后，加入EGFR sgRNA病毒，5-7天后收集细胞，western blot检测EGFR及下游基因表达，提取DNA进行EGFR基因测序，并行CCK8(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)细胞增殖试验。

Western blot具体方法：使用蛋白质提取试剂盒提取细胞中总蛋白，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以GAPDH(抗GAPDH抗体，Millipore)为内参，检测EGFR(抗EGFR抗体：cell signaling technology)及其下游的基因表达。使用invitrogen公司DNA提取试剂盒，提取基因组DNA，将DNA产物进行PCR扩增，引物序列为：前导GGAAACGTTGCCTTAGAAGC，反向GCTTTGTGGACATTGAAGGG。反应条件为95℃ 5 min，95℃ 30 s，53℃ 45 s，72℃30 s，从第二步开始循环39次。琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，将目的条带回收。再用invitrogen公司DNA提纯试剂盒将DNA提纯，送测序公司测序。

CCK8试验：将U87 EGFRwt/vIII和LN229 EGFRwt/vIII使用CRISPR/Cas9技术敲除（knockout，KO）细胞分别种入96孔板，每孔3000细胞，在0，24，48，72，96小时分别在100ml DMEM培养基中加入10ul CCK8，培养2小时后，用酶标仪检测细胞吸光度，试验结果参见图1、图2 。

3.体外实验

以胶质瘤中U87和LN229细胞(ATCC)为例，EGFRvIII细胞先用表达EGFRvIII的慢病毒（3ul）转染并用puromycin筛选成为稳定表达的细胞系。分别分为四个组，空白病毒对照组（阴性空白对照病毒3ul）、共转Cas9和sgRNA组（表达Cas9和sgRNA慢病毒各3ul）、EGFRvIII组（不含表达Cas9和sgRNA慢病毒）、共转EGFRvIII(含表达Cas9和sgRNA慢病毒各3ul)。按照病毒的滴度以及培养皿中细胞的密度加入相应量的Cas9病毒，稳定表达5-7天后，加入相应量的sgRNA，在培养箱中培养5-7天，待基因剪切、修复、再次表达后，收集细胞DNA，蛋白，通过基因测序（图3）和western blot（图4）的方法，确认EGFR基因被编辑，并且EGFR蛋白表达下调，进而影响EGFR下游蛋白活性。细胞增殖试验也证明了敲除EGFR或EGFRvIII有效的抑制体外肿瘤细胞增殖活性。

4. 小鼠颅内原位模型的建立

（1）取U87EGFR和U87EGFR KO胶质母细胞瘤细胞经 0.125%胰酶消化，1000rpm×10 分钟常温离心去上清，以 PBS 离心洗涤 2 次；（2）计算细胞数；调整细胞浓度至 2×10⁸/ml，将细胞悬浮于无血清 DMEM 培养液中，制成细胞悬液。（3）将待试验小鼠称重，用 5%的水合氯醛腹腔注射麻醉(剂量：0.001ml/g)。（4）常规酒精消毒头部皮肤，沿头部正中线偏右 3mm 并与两耳连线垂直切开头部皮肤，暴露颅骨，取对侧眼、耳连线交点偏右 2mm 处，细针钻透颅骨，将小鼠用立体定向仪三角架固定。（5）量程为 5μl 的微样进样器吸取 3μl 细胞悬液(约含 5×10⁵细胞)后置于立体定向仪（STOELTING CO.620 WHEAT LANE，USA）上，沿钻孔处进针 3mm，后退 1mm，后启动立体定向仪缓慢注入细胞悬液。（6）注射完毕后，将皮肤切口缝合，并消毒创面，小鼠放回笼中。

结果判定：体外成像技术：颅内肿瘤模型成瘤一周后，每周一次从每组中随机抽取三只小鼠，5%的水合氯醛腹腔注射麻醉后，1×荧光素酶底物200ul腹腔注射，反应十分钟后，荧光成像仪检测荧光强度（参见图5a）。生存分析：从颅内成瘤模型形成后，每日观察小鼠的生长状态，并记录小鼠的生存时间（参见图5b）。免疫组化：将处死的小鼠大脑取出，PBS清洗后放入4%多聚甲醛中固定24小时，蜡块包埋并切10um片，分别行HE染色和抗EGFR免疫组化染色（参见图5c）。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津医科大学总医院

<120> 胶质母细胞瘤中同时敲除EGFRwt和EGFRvIII的方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> RNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<220>

<221> sgRNA

<222> (1)..(20)

<400> 1

agatcccgtc catcgccact 20

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<110> 天津医科大学总医院

<120> 胶质母细胞瘤中同时敲除EGFRwt和EGFRvIII的方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> RNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<220>

<221> sgRNA

<222> (1)..(20)

<400> 1

agatcccgtc catcgccact 20