一种大豆圣豆9号GmNAC15基因的ABA诱导启动子的制作方法

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本发明涉及一种启动子，尤其涉及一种大豆圣豆9号GmNAC15基因的ABA诱导启动子。

背景技术：

大豆，豆科(Fabaceae)，大豆属(Glycine)，一年生草本，原产中国，中国各地均有栽培，亦广泛栽培于世界各地。大豆(Glycine max(L.)Merr)是重要的粮食作物和经济作物，富含高质量的蛋白质、脂肪和多种对人体有益的活性物质，具有很高的营养价值。此外，大豆也是是食品、饲料等多种加工工业的优质原料，在国民经济中处于重要的地位。随着经济的发展，对大豆需求量也将不断增大，然而大豆增产受环境恶化的限制日益明显。干旱、盐、极端温度、化学毒害和氧化胁迫是影响农作物产量的主要非生物胁迫因素，其中干旱和盐害限制了大豆种植业的发展。

植物在复杂的自然环境中要维持正常生长，需要对内外界刺激因子作出相应的响应，对植物自身各种功能基因作出精确的调控。目前已知，植物在抵抗干旱、高盐和低温等环境胁迫时存在4条信号传导途径：其中的2条属于依赖ABA信号传递系统，而另外2条则不依赖ABA信号传递系统。在依赖ABA信号途径I中需要MYC和MYB转录因子的生物合成从而激活下游抗逆基因表达。另一个依赖ABA信号途径II则是激活bZIP类转录因子，由bZIP类转录因子与目的基因启动子中的ABA反应调节元件(ABRE PyCGTGGC)结合，从而调控下游抗逆基因表达。对于不依赖ABA信号传导途径III则通过激活DREB类转录因子，通过它识别下游基因启动子区的DRE顺式反应元件从而调控下游目的基因表达。

利用逆境诱导型启动子驱动抗逆基因在转基因植物中表达是培育抗逆作物新品种的有效方法。目前能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少，对于新的抗逆相关启动子的发现、克隆、顺式作用元件分析以及与顺式元件相互作用的转录因子的研究仍然是今后研究的重点，将功能明确的抗逆启动子成功应用到转基因植物中调控抗逆基因的表达是植物抗逆基因工程的研究方向。NAC家族中逆境相关基因往往对多种逆境胁迫响应，这大部分归功与基因启动上含有多种逆境胁迫相关的顺式作用元件，通过对逆境相关的NAC家族基因启动子研究可以得到多种与胁迫相关的关键DNA片段和顺式作用元件，对构建有效的逆境诱导型启动子有重要意义。目前研究较深入的有：脱落酸响应元件(ABA-responsive element,ABRE)、乙烯响应元件(ethylene-responsive element,ERE)、茉莉酸类物质应答元件(jasmonate-responsive element,JRE)、低温响应元件(low-temprature reponsive element，LTRE)和干旱应答元件(dehydration-responsive element，DRE)等。对植物启动子的研究有助于了解基因转录调控表达模式和其调控机制，而对特异性及诱导性启动子功能的研究，有助得到正常高效的特异性表达的转基因植物。

本实验室前期工作中已经证明来源于耐盐品种——圣豆9号的GmNAC15基因为盐和ABA响应基因，且对盐胁迫为正调节作用(专利ZL2012101285907)。通过比较耐盐大豆圣豆9号在盐和非盐条件下的基因表达谱变化，发现了GmNAC15基因在盐处理下上调表达，将该基因的过表达载体转入模式植物拟南芥中，使转基因拟南芥获得了非转基因拟南芥所不具备的抗盐/耐旱性的能力。同时在ABA处理下，转基因拟南芥种子萌发率和叶气孔导度高于非转基因植株(对照)，表明GmNAC15基因通过ABA依赖途径参与拟南芥抗旱/耐盐性。通过大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法将该基因的过表达载体转入大豆中，经过比较分析证明，转基因大豆植株比非转基因植株的抗盐/耐旱性显著地提高。同时在ABA处理下，转基因大豆萌发率和气孔导度均高于非转基因植株(对照)，表明GmNAC15基因通过ABA依赖途径参与大豆抗旱/耐盐性。目前，GmNAC15基因参与ABA信号通路的机制并不明确，研究GmNAC15基因的ABA诱导启动子可以帮助更好地阐释GmNAC15基因的功能，同时研究GmNAC15启动子的ABA诱导特性可为获得通用型的ABA诱导型启动子提供重要参考，将来可用于转基因耐盐作物的培育。但检索发现，目前还未见有关于GmNAC15基因ABA诱导启动子的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种大豆圣豆9号GmNAC15基因的ABA诱导启动子及其应用。

本发明所述的大豆圣豆9号GmNAC15基因的ABA诱导启动子，其特征在于：所述ABA诱导启动子的核苷酸序列是下列核苷酸序列之一：

a)序列表中SEQ ID No:1的DNA序列；

与序列表中SEQ ID No:1的DNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列。

本发明还提供了一种含上述大豆圣豆9号GmNAC15基因ABA诱导启动子的报告基因GUS表达载体pGmNAC15::pKGWFS7，该表达载体的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；以及一种含上述大豆圣豆9号GmNAC15基因ABA诱导启动子的报告基因LUC表达载体pGmNAC15::pGreenII-0800LUC，该表达载体的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。

本发明所述大豆圣豆9号GmNAC15基因的ABA诱导启动子在受ABA诱导高效启动目标基因表达中的应用。

申请人首先在大豆圣豆9号植株中克隆到了GmNAC15基因启动子；利用Gateway系统，经过BP、LR反应，将GmNAC15基因启动子连接到GUS报告基因表达载体pKGWFS7(见图2)上；将pGmNAC15::pKGWFS7载体转入农杆菌菌株GV3101中，通过转化的农杆菌菌株转入模式植物拟南芥中，以验证GmNAC15基因启动子功能。

申请人还通过酶切连接将GmNAC15基因启动子连接到pGreenII-0800LUC载体中，通过拟南芥和大豆叶肉细胞原生质体瞬时转染体系，验证GmNAC15基因启动子受ABA诱导的功能。

实验证实：本发明所述圣豆9号GmNAC15基因的ABA诱导启动子能够在ABA诱导条件下上调目标基因的表达，可望用于转基因抗逆植物的培育。其中所述植物优选大豆或拟南芥。

本发明有益效果体现在：利用PCR克隆技术，本发明首次克隆得到了大豆圣豆9号GmNAC15基因启动子，并驱动GUS报告基因在拟南芥中进行表达，使转基因拟南芥获得了非转基因拟南芥所不具备表达GUS基因的能力，且在ABA诱导条件下能更高地表达。预示本发明所述的大豆圣豆9号GmNAC15基因及其ABA诱导启动子可广泛用于培育抗逆的植物品种。

附图说明

图1为PCR克隆大豆圣豆9号GmNAC15基因启动子电泳图，其中：M为Marker，泳道1、2为启动子DNA。

图2为pKGWFS7.0载体示意图。

图3为GmNAC15::GUS转基因拟南芥GUS染色结果

其中：A为转基因拟南芥培养2天后全株的染色结果，在顶端分生组织、下胚轴的维管组织及根尖部位有GUS信号表达；B为种子萌发后7天，GUS基因在子叶叶脉、真叶、真叶基部、顶端分生组织、主根根尖部位及侧根根尖中高表达；C为叶片；D为真叶基部、生长点；E为根尖；F为花序；G为角果。

图4为GmNAC15::GUS转基因拟南芥在有ABA(B)和无ABA(A)处理下GUS染色对比图。(B显示：ABA处理下在转基因拟南芥中子叶的GUS信号增强)。

图5为pGreenII-0800LUC载体T-DNA插入区示意图。

图6为GmNAC15启动子在ABA和非ABA条件下相对荧光素酶测定结果，其中，MOCK为转化原生质体正常培养24h的相对荧光素酶活性，实验组(ABA)为转化原生质体用50mM ABA处理24h的相对荧光素酶活性。

具体实施方式

实施例1大豆GmNAC15基因启动子的获得

根据NCBI网站上查到的GmNAC15基因转录起始位点ATG上游2026kb序列，设计启动子引物(F：5’-CGCGTCGACCATGATTGCGAATTATTTATC-3’：5’-ACTGCAGGGGGGAAGACAGAGGGA-3’)利用CTAB法提取圣豆9号基因组DNA，将提取的基因组DNA稀释到100ug/ul，用作扩增启动子模板。利用高保真酶HIFI(Takara)，扩增GmNAC15基因启动子。

1.1圣豆9号基因组DNA提取

(1)预先将CTAB提取液放到65℃水浴中预热；

(2)将圣豆9号植物材料放入研钵中，在液氮的保护下将其研磨成粉末；

(3)等液氮挥发后，立即将100-200mg植物粉末转入到1.5ml离心管中，然后迅速地加入65℃预热的2％CTAB提取液650μl，迅速翻转混匀，置于65℃水浴30min，期间每5min颠倒混匀一次；

(4)拿出材料冷却至室温，加入等体积酚/氯仿/异戊醇，混匀至乳白色，室温12000rpm离心10min；

(5)将上清转移至新的灭菌离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻翻转混匀，室温，12000rpm，离心10min；

(6)再将上清转移至新的灭菌离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻翻转混匀，-20℃放置20min；

(7)4℃，12000rpm，离心10min，弃上清，70％乙醇洗两次，在超净台中吹干；

(8)沉淀溶于40μl双蒸水(含0.1％RNase A)，-20℃保存备用。

1.2 GmNAC15基因启动子克隆

高保真酶HIFI扩增的反应体系如下(50μl体系)：

扩增条件如下：

PCR结束后，克隆产物于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。电泳结果如图1所示。

1.3克隆基因片段的纯化回收(天根试剂盒)

1)取500μl平衡液(BL)，添加到回收柱(CB2)中，12000rpm，离心1min；

2)将切下带有目的片段的凝胶放入1.5ml离心管中，加入3倍体积的溶胶液，50℃溶胶10min，期间不时地翻转；

3)凝胶完全融化后，转移至平衡过的回收柱(CB2)中，12000rpm，离心1min；

4)向吸附柱(CB2)中加600μl的漂洗液(PW)，室温2-5min，12000rpm，离心1min；

5)重复步骤4；

6)空柱，12000rpm，离心2min；

7)将回收柱子开盖，在超净台中吹数分钟干燥后，放入灭菌的1.5ml离心管，加入40μl预热到60℃的EB缓冲液，放置1min；

8)12000rpm离心1min，所得溶液即含有回收片段。

1.4连接GmNAC15启动子与pMD19-T载体

反应体系如下(20μl体系)：

16℃过夜连接。(pMD19-T载体购买自TAKARA公司)。

1.5大肠杆菌的质粒转化(无菌操作)

(1)将1-5μl连接产物加入50μl的大肠杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上放置30min；

(2)42℃水浴热激90sec，立即放置冰上2-3min；

(3)在超净台中加入1ml LB培养基，37℃摇床上培养40-50min；

(4)室温，5000rpm，离心3min；

(5)倒掉LB培养基，将菌涂布于含有相应抗生素的培养平皿上，37℃倒置培养过夜。

1.6大肠杆菌PCR验证

反应体系如下(20μl体系)：

扩增条件如下：

PCR结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 DNA测序

用含有Amp(50mg/L)的液体LB摇PCR检测为阳性的单菌落，37℃摇过夜，然后送上海铂尚生物技术有限公司测序，得到测序结果，启动子DNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。

经过序列比对分析，上述DNA序列(SEQ ID No.1)与大豆Williams 82的核苷酸同源99.69％，三次生物学重复证明所述DNA序列(SEQ ID No.1)就是大豆圣豆9号GmNAC15基因启动子，命名为大豆圣豆9号GmNAC15基因的ABA诱导启动子。

1.8提取阳性大肠杆菌中pGmNAC15::pMD19-T质粒(天根试剂盒)

(1)将测序正确的菌接种于10ml含有Amp(50mg/L)的液体LB培养基中，37℃摇过夜；

(2)将菌液加入灭菌的1.5ml离心管中，12000rpm，离心1min，收集菌体；

(3)弃上清，加入250μl 4℃的P1溶液，用1ml的移液枪轻柔悬浮菌体；

(4)再加入250ul的P2溶液轻柔颠倒混匀，静置5min；

(5)溶液澄清后加入350μl的P3溶液，轻轻混匀后放置5min；

(6)室温，12,000rpm，离心10min，同时在吸附柱中加入600μl BL平衡液，室温放置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体；

(7)将离心后的上清转移到平衡过的吸附柱中，室温放置2min，12000rpm，离心1min,倒掉收集管中的液体；

(8)在吸附柱中加入600μl漂洗液PW，室温放置2min，12000rpm，离心1min，倒掉收集管中的液体，再重复一次；

(9)吸附柱空管12000rpm，离心5min；

(10)将吸附柱置于一个无菌的1.5ml离心管中，向吸附柱的中间部位滴加55μl预热到65℃的EB洗脱液，室温放置2min，12000rpm，离心2min，将质粒溶液收集到离心管中，-20℃保存备用。

2.大豆圣豆9号GmNAC15基因启动子序列分析

利用在线启动子分析软件PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)和PLANTCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对克隆得到的GmNAC15基因启动子进行序列分析，发现在GmNAC15基因启动子区域内中预测的顺式元件有34个可能与胁迫相关(如下表所示)，包括(2个)4个GT1GMSCAM4、6个ARE、1个DRE、3个GRE以及一些MYB、MYC和WRKY家族转录因子结合位点表明该启动子上含有丰富的胁迫相关顺式作用元件，可能受到多种转录因子的调控，参与植物对多种生物和非生物胁迫响应。

实施例2，稳定转基因技术分析GmNAC15启动子活性

2.1.报告基因GUS表达载体pGmNAC15::GUS构建

利用Gateway系统构建启动子pGmNAC15::GUS表达载体的流程如图2所示，根据GmNAC15启动子序列设计分别含有attB接头的引物(引物对为5’-AAA AAG CAG GAC CGT CGT GTT CAC AAA TC-3’，R：5’-AGA AAG CTG GGT TTT TTC A AA AAC ACA ATT TCG-3’，下划线处分别为attB1接头和attB2接头)。

2.1.1 PCR扩增含有attB接头的GmNAC15基因启动子片段

(1)高保真酶HIFI进行Gateway系统的第一轮扩增(20μl体系)：

扩增条件如下：

(2)高保真酶HIFI进行Gateway系统的第二步扩增。

attb引物序列：

attb-F：5’-G GGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC T-3’

attb-R：5’-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GT-3’

反应体系如下(50μl体系)：

扩增条件如下：

2.1.2克隆基因片段的纯化回收(天根试剂盒)(同1.3)

2.1.3克隆基因片段的BP反应

BP反应(Gateway系统)体系如下：

25℃反应8小时-过夜。

2.1.4大肠杆菌感受态质粒转化(同1.5)

2.1.5大肠杆菌PCR验证(同1.6)

2.1.6 DNA测序(同1.8)

验证连接到pDONR221中的GmNAC15启动子克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.1.7大肠杆菌质粒DNA的提取得到pGmNAC15::pDONR221质粒(同1.7)

2.1.8克隆基因片段的LR反应

LR反应(Gateway系统)体系如下：

25℃反应8小时-过夜。pKGWFS7载体示意图如图2所示(pKGWFS7购买自Invitrogen公司)。

2.1.9大肠杆菌感受态的制备和质粒转化(同1.5)

2.1.10大肠杆菌PCR验证(同1.6)

2.1.11大肠杆菌质粒DNA的提取(同1.8)

验证转入pKGWFS7载体的阳性质粒的pGmNAC15::pKGWFS7即pGmNAC15::GUS克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.1.12农杆菌感受态的制备(无菌操作)

(1)取农杆菌GV3101菌种接种于10ml YEP液体培养基中，28℃摇床培养过夜；

(2)按1：50接种于50ml YEP液体培养基中，28℃振荡培养3-4小时，至OD₆₀₀值为0.4-0.6；

(3)4℃，4200rpm，离心10min，收集菌体；

(4)弃上清，加入10ml预冷的0.15M的NaCl悬浮菌体；

(5)重复步骤3；

(6)弃上清，加入2ml预冷的20mM的CaCl₂悬浮菌体，分装于1.5ml离心管中，现用或加入终体积7％DMSO经液氮速冻后-80℃保存备用。

2.1.13农杆菌的质粒转化(无菌操作)

(1)将10μl质粒DNA加入50μl的感受态细胞中，轻弹离心管混匀，冰浴30min；

(2)液氮速冻1min；然后37℃水浴5min，立即冰浴2-3min；

(3)加入1ml YEP培养基，28℃培养2-4h；

(4)室温，4000rpm，离心3min，收集菌体；

(5)将菌涂布于含有相应抗生素的YEP培养平板上，28℃倒置培养48h。

2.1.14转化农杆菌的PCR验证

反应体系如下(20μl体系)：

扩增条件如下：

反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

2.2在拟南芥中验证圣豆9号GmNAC15基因启动子的功能验证

2.2.1花侵染法转化拟南芥

(1)拟南芥(Col-0野生型)生长至抽苔1cm时，将顶端减掉以诱导侧生花序的生成；

(2)在转化前一天，取1ml活化过的含有表达载体质粒的农杆菌GV3101加到含相应抗生素及50μg/ml利福平的40ml YEP培养基中，28℃震荡培养至OD600约为1.0-1.2；

(3)室温，4200rpm,离心10min，收集菌体，用浸染液(5％蔗糖，0.05％Silwet L-77)重悬菌体，使OD600约为0.8；

(4)用移液器将农杆菌滴到花序上进行浸染，待所有花序都被侵染后，将拟南芥放入真空干燥器中抽真空1min；

(5)用保鲜袋覆盖花序，至于20-22℃避光培养一天剪开顶部露出花序，再培养一天后揭去保鲜袋，培养至种子成熟。

2.2.2拟南芥种子的表面消毒

将适量待灭菌的拟南芥中子放入1.5ml离心管中，加入1ml 75％的乙醇(含有0.03％体积比的TritonX-100)震荡消毒1min，再用70％的乙醇震荡消毒1min(两次)，最后用吸头将种子吸到无菌滤纸上吹干，然后用无菌的牙签将其点入培养基中。

2.2.3转基因植株的筛选

利用花侵染法通过农杆菌将pGmNAC15::GUS载体转入拟南芥中。将收获的T0代种子播在含有50mg/L卡钠霉素的1/2MS固体培养基上进行筛选，种子萌发10天后，将叶片为绿色，根较长的小苗移入土中，待苗快抽苔时取少量叶片粗提基因组DNA，采取PCR方法验证转基因植株，引物为att B1/2。待阳性植株成熟并收获T1代种子。T1代种子用含有50mg/L卡钠霉素的1/2MS固体培养基进行抗性筛选，选取抗性：

非抗性比为3:1的单拷贝插入株系，种植阳性植株，成熟后即收获T2代种子。T2代种子经过卡钠霉素抗性筛选得到转基因纯合系。

2.2.4转基因拟南芥分析GmNAC15启动子

为了分析GmNAC15启动子的活性和组织特异性，对pGmNAC15::GUS转基因拟南芥进行GUS组织染色。结果显示，pGmNAC15::GUS在萌发两天时，GUS基因在顶端分生组织、下胚轴的维管组织及根尖部位表达(图3-A)；种子萌发后7天，GUS基因在在子叶叶脉、真叶、真叶基部、顶端分生组织、主根根尖部位及侧根根尖中高表达(图3-B/C/E/G)，。转基因植株的花器官中有强GUS基因表达：雄蕊部分，花瓣、花丝和萼片中GUS表达水平较高，在花药中未检测到GUS信号(图3-G)；雌蕊部分，GUS信号主要集中在花柱和柱头中；在成熟的角果中，果皮和果柄处都检测到显著的GUS信号(图3-H)。实验结果表明克隆得到的GmNAC15启动子具有较强的启动子活性，还具有时空特异性，能启动外源基因在拟南芥特定发育时期的特定组织中高表达。

实施例3.利用拟南芥原生质体瞬时转化技术验证GmNAC15启动子受ABA诱导。

3.1 GmNAC15启动子pGreen II-0800LUC载体的构建

3.1.1克隆含有酶切位点的GmNAC15启动子片段

利用双酶切-连接法构建GmNAC15启动子的双荧光报告载体pGreen II-0800LUC。利用Primer 5对圣豆9号GmNAC15启动子上的限制性酶切位点分析，与pGreen II-0800LUC的多克隆位点(pGreen II-0800LUC载体T-DNA插入区如图5所示)进行比较，筛选出可用酶切位点为Sal I和Pst I。

利用GmNAC15含有酶切位点的引物(F：5’-ACG CGT CGA CAC CGT CGT GTT CAC AAA TC-3’，R：5’-AAC TGC AGT TTT TCA AAA ACA CAA TTT CG-3’)PCR扩增GmNAC15启动子，

高保真酶HIFI扩增的反应体系如下(20μl体系)：

扩增条件如下：

反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

3.1.2胶回收PCR产物(同1.3)

3.1.3 Sal I和Pst I分别双酶切PCR产物和pGreen II-0800LUC载体过夜。

反应体系如下：

37℃过夜充分酶切。

3.1.4第二天胶回收酶切产物及pGreen II-0800LUC载体。(同1.3)

3.1.5将回收的酶切产物和载体进行连接反应过夜。(同1.4)

3.1.6大肠杆菌感受态质粒转化。(同1.5)

3.1.7大肠杆菌PCR验证。(同1.6)

3.1.8 DNA测序(同1.7)。

验证连接到pGreenII-0800LUC中的GmNAC15启动子克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.1.9大肠杆菌质粒DNA的提取得到pGmNAC15::pGreenII-0800LUC质粒：无内毒素质粒纯化DNA纯化体系(NucleoBond Xtra Midi EF)(MACHEREY-NAGEL)

(1).菌体培养收集：4500g，15min，4℃

(2).菌体裂解：8ml Buffer RES-EF彻底重悬菌体，加入8ml Buffer LYS-EF裂解菌体，轻柔混匀，常温裂解5min；

(3).平衡柱子和滤头：15ml Buffer EQU-EF

(4).中和:8ml NEU-EF,轻柔混合10-15次，冰上放置5min

(5).净化和装柱裂解液：颠倒试管3次，将裂解液倒入柱子中

(6).1st洗：5ml Buffer FIL-EF

(7).去除过滤柱：去除Nucleobond Xtra Column Filter

(8).2ed洗：35ml Buffer ENDO-EF

(9).溶解：5ml ELU-EF

(14).沉淀：3.5ml异丙醇，15000g，4℃，30min

(15).清洗和干燥DNA沉淀：2ml 70％乙醇常温，5min，15000g，常温，5min

(16).溶解DNA：加入适量体积的H2O-EF，使DNA浓度达到1000ug/ml，-20℃保存。

3.2 GmNAC15启动子对ABA的响应情况

为了分析GmNAC15基因启动子对胁迫的响应情况，对pGmNAC15::GUS拟南芥进行胁迫处理，通过GUS染色检测GUS基因的表达变化。将在1/2MS固体培养基中培养2周的pGmNAC15::GUS转基因幼苗，移植到含有多种胁迫分子的MS液体培养基中进行胁迫处理，分别进行了不同浓度梯度的ABA和MOCK处理，在3h、6h和24h时取材进行GUS染色。结果表明，GUS染色强度仅在ABA处理24h时具有显著增强，且增强区域主要在子叶，根尖GUS染色程度的增强不明显(图4)。实验结果表明，GmNAC15启动子具有ABA处理诱导表达的特性，且其诱导表达主要发生在子叶中。

3.3利用LUC报告基因定量检测GmNAC15启动子不同5’缺失片段的活性

利用Promega Luciferase Assay System检测启动子LUC质粒转化的原生质体相对荧光素酶活性，操作参照说明书。将-80℃的原生质体拿出放在冰上融化，取20ul原生质体溶液+20ul Luciferase Reagent，25℃反应10min后测定萤火虫发光值，加入20ul Stop& Reagent测定，25℃反应10min，测定海肾发光值。计算相对荧光素酶活性值，相对活性值＝萤火虫发光值/海肾发光值。GmNAC15启动子的相对活性值和受A BA诱导情况如图6所示，结果证明，在ABA诱导下，GmNAC15启动子能上调驱动报告基因在转基因拟南芥和大豆原生质体中的表达，GmNAC15启动子具有ABA诱导功能，能够用于今后GmNAC15基因耐盐/旱调控机制研究，预示着将来广泛地应用于培育耐盐/旱转基因植物。

序列表

<110>山东大学

<120>一种大豆圣豆9号GmNAC15基因的ABA诱导启动子

<141> 2016-11-30

<160> 3

<210> 1

<211> 2004

<212> DNA

<213>大豆属大豆（Glycine max.）

<221>大豆圣豆9号GmNAC15基因的ABA诱导启动子

<222>（1）…（2004）

<400>1

catgattgcg aattatttat catttaaaca aattgcctag aatgagttac aactttaaat 60

tgaccgaatt gtatgggtta aattgattaa aaaaattatt aactaactat ttaagttgaa 120

agtattcaat aaagttatct aactttcttt tgataaaata aaattaacta actagccaat 180

gcatataaat taatgtaaaa aggtaaaacc atgtgtacgc gtatataata attttaaaaa 240

aatggaaaaa aaaactgtaa agttcccagt ttataaaaaa tacattattt ttattaactt 300

atgaaaaaaa attaaaatta aaattttctt taaaaaaatc tctgtaatta aactcccctg 360

ataacttatt ttttgtcaaa taaagtaatt aattaactta taattttccc aacacacaca 420

taaacgtaag acacagaata ctaaataata atttgagctg agtaatgtgg tgtttgacta 480

gtgcttaatt taatttaaaa acacttgttc cacactccca agtaacttag acgtttccat 540

tattttgaga ataaactggg aaaataaaca acaaattagg cccacataga aatataatat 600

gactggaaaa cacacgatca tgtctgatat agaatagatt ttctcattgg ttttatatgg 660

ctatagtttt tatgcatgta gctttaataa gaatatatgc caatttgtat ggttagtcga 720

tttcagcgta atttagaccc ttaagttatt gaaaagctaa cagaatattt taattgatct 780

gaaaatgatt tcgcaagtgt atgtttacgt tcacggctcc ttaaatcaat gtggtacaat 840

aaattaattt ttcatttgag tctcagaaac ataattaatt atttgtgatc taaaaaaaat 900

cttgagcaag cgtaaacctt aaaaatgaaa agcttactca aagctaaaaa gtaaatggta 960

aagtagaaac atatggagta gtaaatcttt gttaaaataa ataatattat tttcaggaga 1020

ctttttataa gaaaaaatga aagagaagtg aggaaataaa aatttacatc tataattatt 1080

aataacaaat aattatccta tttggtgtat acatcttatt agacaattta atccttaaat 1140

tatttctttt aacttagatt aacttttata cttttacatt taacttctat tatagtatta 1200

atcttgtaaa tgtagaagct aacagaagag agagagagag agagagagag gggaaggggt 1260

aagtaaaggt aataccgaca gaaaggggtg tgtctgaaga agttacgtta ggagcaccaa 1320

aacgaaacgg cagaggagag actagtggtt gggtaagggt tgagtttccg tacaaattaa 1380

ctgttgcttc ttttaagggg ccagggtgag ttgcgttgca aaatctgata gtattcatct 1440

catttcattt gttccccgtt aagggagaga cagggttact tgtgtacttt cactcactca 1500

ctcactcact cactctccag ctgtatccaa tcacataagc tgacttcatt gcattctctc 1560

gcctcatttt tattttaact aacaaaaatc cttacttttt ttacatttca taaaacatac 1620

tctacttttc tttctttttg ttttgttcaa ggaaggaaca ctgtgacagt agaagcaagc 1680

aagaattgga attggaattg gaattggaat gaattctcct cctcctccaa gaccaagagt 1740

ggagaggtcg agcggaacta ggctagcagc agtttccaca caagccaaaa ccaaaaccaa 1800

aaccaaaacc aaaataaaaa ctgtagttgt caaagtaaaa gaaaggttga gtctagttta 1860

cgccaaatgt gtcttcttat tcttctcctt cttgtcagac ccattactat aaaagaagcc 1920

acactgcatc cttctccata cccttttact ttctttatcc aataataata actccatttt 1980

ccctctgtct tccccccctc ctct 2004

<210> 2

<211> 13046

<212> DNA

<213>人工序列

<221>报告基因GUS表达载体pGmNAC15::pKGWFS7

<222>（1）…（13046）

<400>2

tgatcacagg cagcaacgct ctgtcatcgt tacaatcaac atgctaccct ccgcgagatc 60

atccgtgttt caaacccggc agcttagttg ccgttcttcc gaatagcatc ggtaacatga 120

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ctgtatcgag tggtgatttt gtgccgagct gccggtcggg gagctgttgg ctggctggtg 240

gcaggatata ttgtggtgta aacaaattga cgcttagaca acttaataac acattgcgga 300

cgtttttaat gtactgaatt aacgccgaat tgaattatca gcttgcatgc cggtcgatct 360

agtaacatag atgacaccgc gcgcgataat ttatcctagt ttgcgcgcta tattttgttt 420

tctatcgcgt attaaatgta taattgcggg actctaatca taaaaaccca tctcataaat 480

aacgtcatgc attacatgtt aattattaca tgcttaacgt aattcaacag aaattatatg 540

ataatcatcg caagaccggc aacaggattc aatcttaaga aactttattg ccaaatgttt 600

gaacgatctg cttgactcta gctagagtcc gaaccccaga gtcccgctca gaagaactcg 660

tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg 720

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atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg 840

ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag gcatcgccgt gggtcacgac gagatcctcg 900

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cgcattgcat cagccatgat ggatactttc tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga 1140

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ggaacgtcag tggagcattt ttgacaagaa atatttgcta gctgatagtg accttaggcg 1560

acttttgaac gcgcaataat ggtttctgac gtatgtgctt agctcattaa actccagaaa 1620

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gctcggtacc cggggatcct ctagagtcga cctgcaggca tgcaagctct cccatatggt 1800

cgacctgcag gcggccgcac tagtgatatc acaagtttgt acaaaaaagc tgaaccatga 1860

ttgcgaatta tttatcattt aaacaaattg cctagaatga gttacaactt taaattgacc 1920

gaattgtatg ggttaaattg attaaaaaaa ttattaacta actatttaag ttgaaagtat 1980

tcaataaagt tatctaactt tcttttgata aaataaaatt aactaactag ccaatgcata 2040

taaattaatg taaaaaggta aaaccatgtg tacgcgtata taataatttt aaaaaaatgg 2100

aaaaaaaaac tgtaaagttc ccagtttata aaaaatacat tatttttatt aacttatgaa 2160

aaaaaattaa aattaaaatt ttctttaaaa aaatctctgt aattaaactc ccctgataac 2220

ttattttttg tcaaataaag taattaatta acttataatt ttcccaacac acacataaac 2280

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atttttattt taactaacaa aaatccttac tttttttaca tttcataaaa catactctac 3480

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aaaccaaaat aaaaactgta gttgtcaaag taaaagaaag gttgagtcta gtttacgcca 3720

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gcatccttct ccataccctt ttactttctt tatccaataa taataactcc attttccctc 3840

tgtcttcccc ccctcctctc agctttcttg tacaaagtgg tgatatcccg cggatggtga 3900

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taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc 4020

tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga 4080

ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg 4140

acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg 4200

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aggaagtgat ggagcatcag ggcggctata cgccatttga agccgatgtc acgccgtatg 4980

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gcgtcaatgt aatgttctgc gacgctcaca ccgataccat cagcgatctc tttgatgtgc 6000

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ccgccgagaa tgaacgccaa gaggaacaag catgaaaccg caccaggacg gccaggacga 7800

accgtttttc attaccgaag agatcgaggc ggagatgatc gcggccgggt acgtgttcga 7860

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aaggtgatgt gtatttgagt aaaacagctt gcgtcatgcg gtcgctgcgt atatgatgcg 8040

atgagtaaat aaacaaatac gcaaggggaa cgcatgaagg ttatcgctgt acttaaccag 8100

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ggggccgatg ttctgttagt cgattccgat ccccagggca gtgcccgcga ttgggcggcc 8220

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tgagcaaatg aataaatgag tagatgaatt ttagcggcta aaggaggcgg catggaaaat 9000

caagaacaac caggcaccga cgccgtggaa tgccccatgt gtggaggaac gggcggttgg 9060

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gaacccggac gtgctgacgg ttcaccccga ttactttttg atcgatcccg gcatcggccg 9960

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tctctttcct gtggatagca cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggaa 10320

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tataaaagag aaaaaaggcg atttttccgc ctaaaactct ttaaaactta ttaaaactct 10440

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cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 11340

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gcacaacaat ggtgacttct acagcgcgga gaatctcgct ctctccaggg gaagccgaag 12540

tttccaaaag gtcgttgatc aaagctcgcc gcgttgtttc atcaagcctt acggtcaccg 12600

taaccagcaa atcaatatca ctgtgtggct tcaggccgcc atccactgcg gagccgtaca 12660

aatgtacggc cagcaacgtc ggttcgagat ggcgctcgat gacgccaact acctctgata 12720

gttgagtcga tacttcggcg atcaccgctt cccccatgat gtttaacttt gttttagggc 12780

gactgccctg ctgcgtaaca tcgttgctgc tccataacat caaacatcga cccacggcgt 12840

aacgcgcttg ctgcttggat gcccgaggca tagactgtac cccaaaaaaa catgtcataa 12900

caagaagcca tgaaaaccgc cactgcgccg ttaccaccgc tgcgttcggt caaggttctg 12960

gaccagttgc gtgacggcag ttacgctact tgcattacag cttacgaacc gaacgaggct 13020

tatgtccact gggttcgtgc ccgaat 13046

<210> 3

<211> 5871

<212> DNA

<213>人工序列

<221>报告基因LUC表达载体pGmNAC15::pGreenII-0800LUC

<222>（1）…（5871）

<400>3

agatcttggc aggatatatt gtggtgtaac gttatcgtac ccctactcca aaaatgtcaa 60

agatacagtc tcagaagacc aaagggctat tgagactttt caacaaaggg taatttcggg 120

aaacctcctc ggattccatt gcccagctat ctgtcacttc atcgaaagga cagtagaaaa 180

ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg cgataaagga aaggctatca ttcaagatgc 240

ctctgccgac agtggtccca aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga 300

agacgttcca accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt gacatctcca ctgacgtaag 360

ggatgacgca caatcccact atccttcgca agacccttcc tctatataag gaagttcatt 420

tcatttggag aggacagccc accaccatga cttcgaaagt ttatgatcca gaacaaagga 480

aacggatgat aactggtccg cagtggtggg ccagatgtaa acaaatgaat gttcttgatt 540

catttattaa ttattatgat tcagaaaaac atgcagaaaa tgctgttatt tttttacatg 600

gtaacgcggc ctcttcttat ttatggcgac atgttgtgcc acatattgag ccagtagcgc 660

ggtgtattat accagacctt attggtatgg gcaaatcagg caaatctggt aatggttctt 720

ataggttact tgatcattac aaatatctta ctgcatggtt tgaacttctt aatttaccaa 780

agaagatcat ttttgtcggc catgattggg gtgcttgttt ggcatttcat tatagctatg 840

agcatcaaga taagatcaaa gcaatagttc acgctgaaag tgtagtagat gtgattgaat 900

catgggatga atggcctgat attgaagaag atattgcgtt gatcaaatct gaagaaggag 960

aaaaaatggt tttggagaat aacttcttcg tggaaaccat gttgccatca aaaatcatga 1020

gaaagttaga accagaagaa tttgcagcat atcttgaacc attcaaagag aaaggtgaag 1080

ttcgtcgtcc aacattatca tggcctcgtg aaatcccgtt agtaaaaggt ggtaaacctg 1140

acgttgtaca aattgttagg aattataatg cttatctacg tgcaagtgat gatttaccaa 1200

aaatgtttat tgaatcggac ccaggattct tttccaatgc tattgttgaa ggtgccaaga 1260

agtttcctaa tactgaattt gtcaaagtaa aaggtcttca tttttcgcaa gaagatgcac 1320

ctgatgaaat gggaaaatat atcaaatcgt tcgttgagcg agttctcaaa aatgaacaat 1380

aattctagcc ggtacgctga aatcaccagt ctctctctac aaatctatct ctctctattt 1440

tctccataaa taatgtgtga gtagtttccc gataagggaa attagggttc ttatagggtt 1500

tcgctcatgt gttgagcata taagaaaccc ttagtatgta tttgtatttg taaaatactt 1560

ctatcaataa aatttctaat tcctaaaacc aaaatccagt actaaaatcc agatcgataa 1620

cattaacgtt tacaatttcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc 1680

ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt 1740

aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt 1800

gtaatacgac tcactatagg gcgaattggg taccgggccc cccctcgagg tcgaccatga 1860