用于检测产超广谱β‑内酰胺酶三种细菌耐药基因的LAMP引物组合及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域中，用于检测产超广谱β-内酰胺酶三种细菌耐药基因的LAMP引物组合及其应用。

背景技术：

抗菌药物是临床应用最广泛的一类药物，但近年感染性疾病的病死率迅速提升，究其原因在于抗生素滥用，耐药菌带来的用药困难。我国是抗生素滥用情况最为严重的国家之一，然而随着抗生素使用量的加大，细菌耐药情况也越发严重。

抗生素种类繁多，作用机制多样，其中β-内酰胺类抗生素是指其化学结构中含有β-内酰胺环的一大类，包括青霉素类、头孢菌素类、β-内酰胺酶抑制剂、单环内酰胺类、碳青霉烯类等，可通过结合在青霉素结合蛋白(PBPs)上，从而破坏细菌细胞壁合成已达到抑菌灭菌的目的。

细菌产生耐药性的原因很多，主要分为产生灭活酶、抗菌药物作用靶位改变、改变细菌外膜通透性、影响主动泵出系统、影响细菌被膜的形成及交叉耐药性等六方面。

部分细菌可产生β-内酰胺酶，即细菌产生的能水解β-内酰胺类抗菌药物的灭活酶，它是细菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的主要机制。根据《产超广谱β-内酰胺酶细菌感染防治专家共识》中所述，其中超广谱β-内酰胺酶(Extended-Sperctrumβ-Lactamases,ESBLs)是一类主要由大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌等肠杆菌科细菌由于体内相关耐药基因的存在，而产生的一类耐药形式。即细菌在持续的各种β-内酰胺类抗菌药物的选择压力下，被诱导产生的及不断变异的β-内酰胺酶，它扩展了其耐受头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟等第3代及第4带头孢菌素，以及氨曲南等单环β-内酰胺类抗菌药物的能力。

目前关于对细菌耐药性的检测主要有以下几种方法：细菌耐药表型的检测(包括耐药筛选试验、折点敏感试验及药敏试验的仪器化和自动化等)，β-内酰胺酶检测，特殊耐药菌检测和耐药基因检测等。其中最为直观的检测方法是以体外培养的药物检测，但仍存在培养时间长等缺陷。随着耐药机理的研究逐步深入，分子生物学方法检测细菌耐药逐渐被临床接受。常见检测细菌耐药基因的方法主要有：聚合酶链式反应(PCR)、PCR-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)、PCR-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)、生物芯片技术(gene chip)、自动DNA测序(DNA sequencing)等。传统的基因鉴定方法为PCR法和DNA测序法，其中传统的PCR法检测周期较长，通常需要3-4个小时；SangerDNA测序法对引物特异性要求较高，且价格较昂贵，后期数据分析较复杂，不适合临床推广使用。近年新发展起来的核酸等温扩增技术，无论是在反应时间还是仪器要求方面，都比PCR技术更有优势。在这些众多等温扩增技术中，又以环介导等温扩增(LAMP)的应用最为成熟、最为广泛，其高灵敏度、高特异性、快速的扩增得到了市场的检验和认可。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于检测产ESBL酶的三种耐药基因LAMP引物组合及其应用。

本发明首先提供了一种引物组合，为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)由引物组Ⅰ、引物组Ⅱ和引物组Ⅲ组成；

(a2)由所述引物组Ⅰ、所述引物组Ⅱ和所述引物组Ⅲ中的任意两个组成；

(a3)所述引物组Ⅰ、所述引物组Ⅱ或所述引物组Ⅲ；

所述引物组Ⅰ由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB组成；

所述引物Ⅰ-F3为如下(b1)或(b2)；

(b1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅰ-B3为如下(b3)或(b4)；

(b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅰ-FIP为如下(b5)或(b6)；

(b5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；

(b6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅰ-BIP为如下(b7)或(b8)；

(b7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；

(b8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅰ-LF为如下(b9)或(b10)；

(b9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；

(b10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅰ-LB为如下(b11)或(b12)；

(b11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；

(b12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。

所述引物组Ⅱ由引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB组成；

所述引物Ⅱ-F3为如下(c1)或(c2)；

(c1)序列表的序列7所示的单链DNA分子；

(c2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅱ-B3为如下(c3)或(c4)；

(c3)序列表的序列8所示的单链DNA分子；

(c4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅱ-FIP为如下(c5)或(c6)；

(c5)序列表的序列9所示的单链DNA分子；

(c6)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅱ-BIP为如下(c7)或(c8)；

(c7)序列表的序列10所示的单链DNA分子；

(c8)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅱ-LF为如下(c9)或(c 10)；

(c9)序列表的序列11所示的单链DNA分子；

(c10)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅱ-LB为如下(c11)或(c12)；

(c11)序列表的序列12所示的单链DNA分子；

(c12)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的DNA分子。

所述引物组Ⅲ由引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB组成；

所述引物Ⅲ-F3为如下(d1)或(d2)；

(d1)序列表的序列13所示的单链DNA分子；

(d2)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅲ-B3为如下(d3)或(d4)；

(d3)序列表的序列14所示的单链DNA分子；

(d4)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅲ-FIP为如下(d5)或(d6)；

(d5)序列表的序列15所示的单链DNA分子；

(d6)将序列15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅲ-BIP为如下(d7)或(d8)；

(d7)序列表的序列16所示的单链DNA分子；

(d8)将序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅲ-LF为如下(d9)或(d10)；

(d9)序列表的序列17所示的单链DNA分子；

(d10)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅲ-LB为如下(d11)或(d12)；

(d11)序列表的序列18所示的单链DNA分子；

(d12)将序列18经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列18具有相同功能的DNA分子。

所述引物组Ⅰ中，所述引物Ⅰ-F3、所述引物Ⅰ-B3、所述引物Ⅰ-FIP、所述引物Ⅰ-BIP、所述引物Ⅰ-LF和所述引物Ⅰ-LB的摩尔比可为0.5：0.5：2：2：1：1。

所述引物组Ⅱ中，所述引物Ⅱ-F3、所述引物Ⅱ-B3、所述引物Ⅱ-FIP、所述引物Ⅱ-BIP、所述引物Ⅱ-LF和所述引物Ⅱ-LB的摩尔比可为0.5：0.5：2：2：1：1。

所述引物组Ⅲ中，所述引物Ⅲ-F3、所述引物Ⅲ-B3、所述引物Ⅲ-FIP、所述引物Ⅲ-BIP、所述引物Ⅲ-LF和所述引物Ⅲ-LB的摩尔比可为0.5：0.5：2：2：1：1。

所述引物组Ⅰ中，各引物的量如下：0.5μmol所述引物Ⅰ-F3、0.5μmol所述引物Ⅰ-B3、2.0μmol所述引物Ⅰ-FIP、2.0μmol所述引物Ⅰ-BIP、1.0μmol所述引物Ⅰ-LF和1.0μmol所述引物Ⅰ-LB；

所述引物组Ⅱ中，各引物的量如下：0.5μmol所述引物Ⅱ-F3、0.5μmol所述引物Ⅱ-B3、2.0μmol所述引物Ⅱ-FIP、2.0μmol所述引物Ⅱ-BIP、1.0μmol所述引物Ⅱ-LF和1.0μmol所述引物Ⅱ-LB；

所述引物组Ⅲ中，各引物的量如下：0.5μmol所述引物Ⅲ-F3、0.5μmol所述引物Ⅲ-B3、2.0μmol所述引物Ⅲ-FIP、2.0μmol所述引物Ⅲ-BIP、1.0μmol所述引物Ⅲ-LF和1.0μmol所述引物Ⅲ-LB。

本发明还保护所述引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(e1)或(e2)或(e3)：

(e1)检测待测菌是否含有产ESBL酶的耐药基因CTX-M-1基因、CTX-M-9基因和/或GES-1基因；

(e2)鉴定产ESBL酶的耐药基因CTX-M-1基因、CTX-M-9基因和/或GES-1基因；

(e3)检测待测样本中是否含有产ESBL酶的耐药基因CTX-M-1基因、CTX-M-9基因和/或GES-1基因。

本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(e1)或(e2)或(e3)：

(e1)检测待测菌是否含有产ESBL酶的耐药基因CTX-M-1基因、CTX-M-9基因和/或GES-1基因；

(e2)鉴定产ESBL酶的耐药基因CTX-M-1基因、CTX-M-9基因和/或GES-1基因；

(e3)检测待测样本中是否含有产ESBL酶的耐药基因CTX-M-1基因、CTX-M-9基因和/或GES-1基因。

所述试剂盒还可包括反应液，所述反应液具体可为博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020。

本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。

本发明还保护一种检测待测菌是否含有产ESBL酶的耐药基因CTX-M-1基因、CTX-M-9基因和/或GES-1基因的方法，包括：

(1)提取待测菌的基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别采用所述引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：

如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌含有或候选含有耐药基因CTX-M-1基因；

如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌含有或候选含有耐药基因CTX-M-9基因；

如果采用所述引物组Ⅲ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌含有或候选含有耐药基因GES-1基因。

本发明还保护一种检测待测样本中是否含有产ESBL酶的耐药基因CTX-M-1基因、CTX-M-9基因和/或GES-1基因的方法，包括：

(1)提取待测样本的总DNA；

(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，分别采用所述引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：

如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有耐药基因CTX-M-1基因；

如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有耐药基因CTX-M-9基因；

如果采用所述引物组Ⅲ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有耐药基因GES-1基因。

以上任一所述方法中，采用所述引物组Ⅰ时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。

以上任一所述方法中，采用所述引物组Ⅱ时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。

以上任一所述方法中，采用所述引物组Ⅲ时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。

以上任一所述方法中，环介导等温扩增反应条件为：65℃恒温50min。

所述待测样本可为人(Homo sapiens)的脓液。

上文中，所述实现环介导等温扩增具体可体现为：在利用荧光定量PCR进行检测时可出现环介导等温扩增曲线。所述环介导等温扩增曲线可为为典型的“S型”扩增曲线。

本发明还保护所述引物组合在检测待测菌是否含有耐药基因CTX-M-1基因、CTX-M-9基因和/或GES基因中的应用。

本发明还保护所述引物组合在检测待测样本中是否含有耐药基因CTX-M-1基因、CTX-M-9基因和/或GES-1基因中的应用。

本发明还保护所述引物组合在鉴定产ESBL酶的耐药基因CTX-M-1基因、CTX-M-9基因和/或GES-1基因中的应用。

上文中，耐药基因CTX-M-1基因的Genebank号为KT459487.1。耐药基因CTX-M-9基因的Genebank号为KP128034.1。耐药基因GES-1基因的Genebank号为GU831563.1。耐药基因CTX-M-1基因、CTX-M-9基因和GES-1基因均属产ESBL酶的三种细菌耐药基因，这三种基因均耐含β-内酰胺环的抗生素。

环介导等温扩增技术(loop-mediated i sothermal ampl ificat ion,LAMP)是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的核酸扩增技术,其原理是在一种具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下，识别6-8个区域的4-6条引物，在等温条件下快速、特异地扩增目的基因，可推广应用于快速、准确的检测常见的碳青霉烯类耐药基因。LAMP方法具有灵敏性高、特异性好、反应时间短、判定结果方便、不需要昂贵仪器等优势。

本发明提供的引物组合鉴定用于检测常见的三种超广谱β-内酰胺耐药基因，具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。本发明具有重大的推广价值。

附图说明

图1为实施例2中采用引物组Ⅰ的检测结果。

图2为实施例2中采用引物组Ⅱ的检测结果。

图3为实施例2中采用引物组Ⅲ的检测结果。

图4为实施例4中样本一的检测结果。

图5为实施例4中样本二的检测结果。

图6为实施例4中样本三的检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

反应液为博奥生物集团有限公司产品，产品目录号为CP.440020。

DNA拷贝数的计算方法如下：

1A260吸光度值＝ds DNA 50μg/ml；

核酸浓度＝(OD260)×(稀释倍数)×(50)＝x ng/μl；

平均分子量(MW)代表克/摩尔，单位道尔顿(dolton)，即1dolton＝1g/mol；

摩尔＝6.02×10²³；

平均分子量(MW):dsDNA＝(碱基数)×(660道尔顿/碱基)；

拷贝数计算公式:

(6.02×10²³copies/摩尔)×(x ng/μl×10^-9)/(DNA长度×660)＝copies/μl。

实施例1、引物组Ⅰ、引物组Ⅱ和引物组Ⅲ的制备

试剂盒由三个LAMP引物组组成，每个引物组用于检测一种产ESBL酶耐药基因。

用于检测耐药基因CTX-M-1引物组如下(5’→3’)：

外引物F3(序列1)：TGATTTCTCACGTTGGC；

外引物B3(序列2)：CAGCCTGAATGCTCGCT；

内引物FIP(序列3)：TATCACGCGGATCGCCCGTCCGTCTCGACCGTACC；

内引物BIP(序列4)：TGGCGCAAACTCTGCGGAATTTTCATCCATGTCACCAGC；

环引物LF(序列5)：TGTTTAACGTCGGCTC；

环引物LB(序列6)：CTGGGTAAAGCATTGGG。

用于检测耐药基因CTX-M-9引物组如下(5’→3’)：

外引物F3(序列7)：CCTGTCGAGATCAAGCCT；

外引物B3(序列8)：ACGTCTCATCGCCGATC；

内引物FIP(序列9)：AGCGTCATTGTGCCGTTGAGCCGATCTGGTTAACTACAATCC；

内引物BIP(序列10)：CCGCGTTGCAGTACAGCGACAAAAGCCGTCACGCCTC；

环引物LF(序列11)：CGTGTTTTTCGGCAATC；

环引物LB(序列12)：TACCGCCATGAACAAATT。

用于检测耐药基因GES-1引物组如下(5’→3’)：

外引物F3(序列13)：ACCTCAGAGATACAACTACG；

外引物B3(序列14)：TGGCGCAGGTACCAGTT；

内引物FIP(序列15)：CGAGGTGGACGTCAGTGCCCTATTGCTATGGCACGTACT；

内引物BIP(序列16)：ACCCACACCATTGAGAGGTGGAACCCAATCTTTAGGAAAACCCG；

环引物LF(序列17)：CGCCATAGAGGACTTTAGCCAC；

环引物LB(序列18)：CTGATCGGAAACCAAACGGGA。

用于检测耐药基因CTX-M-1的引物组命名为引物组Ⅰ。用于检测耐药基因CTX-M-9的引物组命名为引物组Ⅱ。用于检测耐药基因GES的引物组命名为引物组Ⅲ。

检测产ESBL酶的耐药基因的引物组合由引物组Ⅰ、引物组Ⅱ和引物组Ⅲ组成，该引物组合中，各单链DNA各自独立包装。

引物组Ⅰ中，引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB的摩尔比为0.5：0.5：2：2：1：1；

引物组Ⅱ中，引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB的摩尔比为0.5：0.5：2：2：1：1；

引物组Ⅲ中，引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB的摩尔比为0.5：0.5：2：2：1：1。

实施例2、产ESBL酶的耐药基因的引物组合的特异性

一、待测样本的制备

待测样本1：耐药基因CTX-M-1基因质粒。

待测样本2：耐药基因CTX-M-9基因质粒。

待测样本3：耐药基因GES-1基因质粒。

各质粒的制备方法如下：

耐药基因CTX-M-1基因质粒：将-T Easy质粒(Promega)的EcoRI和SpeI间的DNA片段替换为Genebank号为KT459487.1的核苷酸序列所示的DNA分子，得到重组质粒，该质粒即为耐药基因CTX-M-1基因质粒。

耐药基因CTX-M-9基因质粒：将-T Easy质粒(Promega)的EcoRI和SpeI间的DNA片段替换为Genebank号为KP128034.1的核苷酸序列所示的DNA分子，得到重组质粒，该质粒即为耐药基因CTX-M-9基因质粒。

耐药基因GES-1基因质粒：在pUC57质粒(生工生物工程(上海)股份有限公司)的MCS间插入Genebank号为GU831563.1的核苷酸序列所示的DNA分子，得到重组质粒，该质粒即为耐药基因GES-1基因质粒。

二、待测样本的检测

各个待测样本分别进行如下步骤进行检测：

以步骤一的质粒DNA为模板，分别采用实施例1制备的引物组Ⅰ、引物组Ⅱ和引物组Ⅲ对步骤一制备的三个质粒—耐药基因CTX-M-1基因质粒、耐药基因CTX-M-9基因质粒和耐药基因GES-1基因质粒进行环介导等温扩增检测，每个引物组合均检测三种质粒。

反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL模板DNA(5pg-50pg)，补水至10μL。引物混合物即引物组Ⅰ、引物组Ⅱ或引物组Ⅲ中的各条引物组成的混合物。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。

反应条件：65℃恒温50min。

反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。

采用引物组Ⅰ的结果见图1。只有当待测样本为耐药基因CTX-M-1基因质粒的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)。当待测样本为待测样本2、3的时候均不显示阳性扩增曲线。图1中“S型”扩增曲线为待测样本1的结果；图1中非“S型”扩增曲线中有各有一条分别为待测样本2和待测样本3的结果，其余均为未添加模板的结果。

采用引物组Ⅱ的结果见图2。只有当待测样本为耐药基因CTX-M-9基因质粒的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)。当待测样本为待测样本1、3的时候均不显示阳性扩增曲线。图2中“S型”扩增曲线为待测样本2的结果；图2中非“S型”扩增曲线中有各有一条分别为待测样本1和待测样本3的结果，其余均为未添加模板的结果。

采用引物组Ⅲ的结果见图3。只有当待测样本为耐药基因GES-1基因质粒的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)。当待测样本为待测样本1、2的时候均不显示阳性扩增曲线。图3中“S型”扩增曲线为待测样本3的结果；图3中非“S型”扩增曲线中有各有一条分别为待测样本1和待测样本2的结果，其余均为未添加模板的结果。

以上结果表明，本发明提供的产ESBL酶的耐药基因的引物组合中的三个引物组分别对其靶标基因和有很高的特异性。

实施例3、产ESBL酶的耐药基因的引物组合的灵敏性

待测样本1：实施例2的耐药基因CTX-M-1基因质粒。

待测样本2：实施例2的耐药基因CTX-M-9基因质粒。

待测样本3：实施例2的耐药基因GES-1基因质粒。

1、提取待测样本的质粒DNA，用无菌水进行梯度稀释，得到各个稀释液。

2、以步骤1得到的稀释液为模板，分别采用实施例1制备的引物组Ⅰ、引物组Ⅱ和引物组Ⅲ进行环介导等温扩增。

待测样本为待测样本1时，采用引物组Ⅰ进行环介导等温扩增。待测样本为待测样本2时，采用引物组Ⅱ进行环介导等温扩增。待测样本为待测样本3时，采用引物组Ⅲ进行环介导等温扩增。

反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数分别为10³、5×10²、10²或10¹)，补水至10μL。引物混合物即引物组Ⅰ、引物组Ⅱ或引物组Ⅲ中的各条引物组成的混合物。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。

反应条件：65℃恒温50min。

反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。

如果在50min内出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在50min内没有出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。

引物组Ⅰ检测靶标基因的灵敏度为5×10²个拷贝数/反应体系，引物组Ⅱ检测靶标基因的灵敏度为5×10²个拷贝数/反应体系，引物组Ⅲ检测靶标基因的灵敏度为5×10²个拷贝数/反应体系。

实施例4、利用产ESBL酶的耐药基因的引物组合检测临床样本

待测样本为如下样本一、样本二或样本三：

样本一：已通过药敏鉴定及PCR测序鉴定确认含有CTX-M-1基因的人的脓液；

样本二：已通过药敏鉴定及PCR测序鉴定确认含有CTX-M-9基因的人的脓液；

样本三：已通过药敏鉴定及PCR测序鉴定确认含有GES-1基因的人的脓液。

1、提取待测样本的总DNA。

2、以步骤1提取的总DNA为模板，分别采用实施例1制备的各个引物组对这三个样本进行环介导等温扩增，每个引物组合均检测三种样本。

反应体系与反应条件均同实施例2。

反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。

样本一的结果见图4。只有采用引物组Ⅰ检测的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组Ⅰ以外的其它两个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线，与实际情况一致。图4“S型”扩增曲线为引物组Ⅰ的结果；图4中非“S型”扩增曲线中有各有一条分别为引物组Ⅱ和引物组Ⅲ的结果，其余均为未添加模板的结果。

样本二的结果见图5。只有采用引物组Ⅱ检测的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组Ⅱ以外的其它两个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线，与实际情况一致。图5中“S型”扩增曲线为引物组Ⅱ的结果；图5中非“S型”扩增曲线中有各有一条分别为引物组Ⅰ和引物组Ⅲ的结果，其余均为未添加模板的结果。

样本三的结果见图6。只有采用引物组Ⅲ检测的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组Ⅲ以外的其它两个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线，与实际情况一致。图6中“S型”扩增曲线为引物组Ⅲ的结果；图6中非“S型”扩增曲线中有各有一条分别为引物组Ⅰ和引物组Ⅱ的结果，其余均为未添加模板的结果。

以上结果表明，利用本发明提供的产ESBL酶的耐药基因的引物组合可以进行三种常见产ESBL酶耐药基因的检测，结果准确可靠。

<110> 博奥生物集团有限公司

<120> 用于检测产超广谱β-内酰胺酶三种细菌耐药基因的LAMP引物组合及其应用

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<170> PatentIn version 3.5

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