一种单域抗体蛋白骨架及其制备方法与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种单域抗体蛋白骨架及其制备方法。

背景技术：

抗体药物是生物医药的重要组成部分。与传统的小分子药物相比，抗体药物由于其靶向性好、副作用小，抗体药物成为生物药物发展最为迅速的产业，是今后若干年新药研发的主要方向，经济效益特别明显。据Reichert统计，2011年抗体类药物的市值达到480亿美元，领跑所有的生物类药物，预计到2016年更是达到680亿美元以上。

回顾抗体的研究历程，抗体的制备一直是整个产业的核心和瓶颈之一。在抗体药物的产业化过程中，常规抗体分子在哺乳动物细胞中表达量低，而在原核细胞体系中又容易出现聚集和无法糖基化等问题，从而使得抗体生产成本高，导致研发和使用费用高，就限制了其进一步的应用。而且，传统抗体由于其相对分子质量大，造成抗体分子在肿瘤组织和血管屏障的穿透性差，尤其在实体肿瘤中的有效浓度更低，大大限制了抗体药物的有效性。因此，抗体小型化已成为抗体药物研究的主要趋势。

重链抗体作为天然缺失轻链的抗体分子，在基因工程改造中相对于传统IgG抗体分子具有更大的优势。由重链抗体改造而来的单域抗体(single domain antibody)在天然状态下具有与抗原结合的能力，与人源或鼠源的单域抗体相比，其亲和力保留得更好，由于其相对分子质量远远小于传统抗体，抗体大小只有纳米级别又被称为纳米抗体(nanobody)。相对于传统的基因工程小分子抗体，单域抗体具有多方面的优势：1)分子量小以及CDR3的柔韧性增加,使单域抗体可以识别隐藏的抗原位点，这些表位传统的抗体无法识别,例如酶的活性中心，可以作为酶的抑制剂或者锥虫病的诊断试剂；2)由于单域抗体在自然状态下只有一个作用区域,对其进行基因操作更加方便；3)单域抗体只有识别抗原的可变区而没有不变区,从而增加了功能区的范围；4)因铰链区更加灵活多变，并且没有轻重链可变区的错配，使多价抗体的产生更加容易；5)由于单链的自然属性以及亲水性的增加导致折叠效率提高,从而具有很好的理化稳定性；6)由于亲水性增加,使其溶解性提高；7)分子量小,因此具有良好的组织渗透性,有利于携带毒素等物质的抗体到达肿瘤组织；8) 高效折叠可以帮助其很好地表达；9)分子量小，因而对人体的免疫原性弱；10)在生产方面，因为传统抗体要发挥生物学功能，常常需要合适的糖基化，所以绝大多数抗体只能在哺乳动物系统内进行表达，相对于原核和酵母系统，哺乳动物系统比较昂贵。而单域抗体由于分子量小，并且不需要糖基化修饰即可发挥生物学功能，适合在大肠杆菌中表达。由于具有以上优势，近年来单域抗体吸引了人们巨大的研究热情，在探索抗原受体起源，研发疫苗、治疗药物、诊断试剂和生物技术研究工具等方面取得了长足的进展。目前在单域抗体方面研究开发最好的的是骆驼单域抗体，其中比利时Ablynx生物制药公司已研发了多个骆驼单域抗体，其中抗血栓单域抗体已进入III期临床，还有4个自身免疫疾病骆驼单域抗体进入II期临床。1个抗癌骆驼单域抗体进入I期临床。但骆驼饲养以及免疫困难造成驼源单域抗体的研发成本太高，而且目前国际上驼源单域抗体的研究太多，针对多种疾病的多个靶点应用都被专利保护。因此开发除骆驼外的其他来源的单域抗体具有重要意义。

继骆驼发现单域抗体后，Greenberg等又相继从护士鲨等软骨鱼体内发现了类似结构的免疫球蛋白新抗原受体(Ig new antigen receptor，IgNAR)。如图1所示，IgNAR蛋白是一种二聚体，每条链由1个可变区(vNAR)和5个恒定区(cNAR)构成。没有L链或其他任何蛋白伴随此二聚体。电镜显示IgNAR的V区不同于传统的Ig和TCR，不形成二聚体，而是相当独立的柔性区。利用基因工程技术可将IgNAR的抗原结合柔性可变区表达成独立的可溶性蛋白，称为鲨鱼单域抗体，用vNAR表示。vNAR根据二硫键和软骨鱼的发育时段分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ共3种类型，Ⅰ型仅存于护士鲨，Ⅲ型主要存在于鲨鱼胚胎中，是抗原驱动的免疫反应成熟之前抵抗病原体的第一道防线。3种类型均含有4个保守的框架区和2个互补决定区，CDR1很短，多样性有限；CDR3较长，约5-23个氨基酸残基，多样性高；缺少传统的CDR2，相关位置被分子中部的短β-转角替代，该位于FR2-CDR2内的环状区域名为超变区2(hypervariable region 2，HV2)；在HV2和CDR3之间还有一个名为超变区4(hypervariable region 4，HV4)的环状结构，与T细胞受体的HV4同源。HV2和HV4可能参与抗原结合。Ⅱ型在CDR1和CDR3之间形成1个额外的二硫键；Ⅰ型在FR2和FR4之间形成1个额外的二硫键，并且在CDR3中形成1～2个二硫键。与骆驼单域抗体相比，鲨鱼来源单域抗体具有以下优势：1)鲨鱼的血液里存在着350mM的尿素。这造成了所有鲨鱼血液里的蛋白天生具有很强的稳定性。鲨源单域抗体的热稳定性比驼源的更好，可以在较高温度和变性剂存在的情况下保持生物学活性；2)鲨鱼单域抗体只有13kD左右比驼源的更小,因此具有更好的组织渗透性；3)鲨鱼与人的物种亲缘差异更大，能产生更高亲和力的单域抗体。

目前对鲨鱼单域抗体研究应用非常少，而且主要集中于护士鲨单域抗体的的研究，而 护士鲨个体大，免疫周期长，不利于规模化饲养免疫产生单域抗体。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种单域抗体蛋白骨架。

为实现上述目的，本发明提供一种单域抗体蛋白骨架，其特征在于，其序列组成依次为FR1，CDR1，FR2，CDR3和FR3区，其中FR1、FR2、FR3区为固定氨基酸序列，CDR1和CDR3区为抗体互补决定区，其氨基酸序列可变，CDR1和CDR3区决定与不同的抗原结合。

进一步，所述FR1区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，FR2区的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，FR3区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示。

进一步，所述单域抗体来源于条纹斑竹鲨。

进一步，所述CDR1为8个氨基酸，其中第二位为半胱氨酸，第七位为苏氨酸；优选的，CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:25-32中的任意一条。

进一步，CDR3的序列为10-25个氨基酸序列；优选的，CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:33-49中的任意一条。

本发明还提供一种所述单域抗体蛋白骨架的制备方法，其特征在于，步骤为，

1)条纹斑竹鲨免疫；

2)条纹斑竹鲨vNAR单域抗体库构建；

3)筛选并得到条纹斑竹鲨vNAR单域抗体。

进一步，所述条纹斑竹鲨免疫为，

A.采用抗原与完全弗氏佐剂1:1的体积比例混合免疫条纹斑竹鲨第一次；

B.4周后，采用抗原与非完全完全弗氏佐剂1:1的体积比例混合免疫条纹斑竹鲨第二次；

C.4周后,采用抗原直接尾静脉注射免疫条纹斑竹鲨第三次；

D.4周后采用抗原直接尾静脉注射免疫条纹斑竹鲨第四次；

E.4周后采用抗原直接尾静脉注射免疫条纹斑竹鲨第五次。

进一步，所述条纹斑竹鲨vNAR单域抗体库构建为，

A.cDNA的获得：从抗原免疫的条纹斑竹鲨的外周血和脾脏中得到cDNA；

B.目的基因的克隆与文库构建：根据条纹斑竹鲨vNAR保守序列设计引物，PCR扩增获得vNAR区编码基因并连接入合适的噬菌体展示载体，使vNAR区基因与噬菌体外壳蛋 白pIII融合表达，并通过电转TG1大肠杆菌得到构建好的文库。

进一步，所述筛选并得到条纹斑竹鲨vNAR单域抗体为，利用噬菌体可再扩增的特性，通过亲和吸附-洗脱-扩增，从构建好的文库中淘筛到能与抗原特异性结合的抗体及其基因即为条纹斑竹鲨vNAR单域抗体。

本发明以条纹斑竹鲨外周血和脾脏为起始材料，采用TRIZOL法提取RNA并采用逆转录试剂盒反转录为cDNA。根据条纹斑竹鲨vNAR区的保守序列设计引物(上游引物，序列如SEQ ID NO:1所示，具体为CAACGG GTTGAACAAACACC；下游引物，序列如SEQ ID NO:2所示，具体为TTTCACAGTCAGAATGGTGC)，通过PCR法扩增获得全套条纹斑竹鲨vNAR区编码。条纹斑竹鲨(Chiloscyllium plagiosum Bennett)vNAR代表序列(其蛋白序列如SEQ ID NO:3所示，也可以是SEQ ID NO:3-17中的任意一条)与斑纹须鲨(Orectolobus Maculatus)vNAR代表序列(Gene bank序列号AAP86761)比对确定条纹斑竹鲨vNAR的CDR1、CDR3区。随机选取15个条纹斑竹鲨vNAR区序列进行测序(SEQ ID NO:3-17)，通过比对发现CDR1区和CDR3区氨基酸序列高度变化(见图2和图3A和图3B)。图2中1表示条纹斑竹鲨(Chiloscyllium plagiosum Bennett)vNAR代表序列，序列号SEQ ID NO:3；2表示斑纹须鲨(Orectolobus Maculatus)vNAR代表序列，Gene bank序列号AAP86761。从图2、图3A和图3B可以看出，条纹斑竹鲨vNAR区是一个CDR1区和CDR3区氨基酸序列高度变化而FR1、FR2、FR3区都相对稳定的序列。本发明的蛋白骨架的序列为包括不变区域和可变区域，不变区域是由FR1、FR2、FR3区组成的稳定的氨基酸序列，抗体互补决定区为CDR1和CDR3区，CDR1的长度为8个氨基酸，其中第二位为半胱氨酸(Cys，C),第七位为苏氨酸(Thr，T)。CDR3的长度为9-25个氨基酸。

本发明所述单域抗体蛋白骨架，具有优势如下：1)分子量小只有13kD左右，比驼源的更小,2)条纹斑竹鲨与人的物种亲缘差异更大，能产生更高亲和力的单域抗体。同时条纹斑竹鲨便于饲养。

本发明的条纹斑竹鲨(Chiloscyllium plagiosum Bennett)属于板鳃亚纲(Elasmobranchii)须鲨目(Orectolobiformes)须鲨科(Orectolobldae)斑竹鲨属(Chiloscyllium)。对条纹斑竹鲨单域抗体的研究及利用在国际上还处于空白。

本发明的发明人从一条简单的条纹斑竹鲨发现了通往应用的可能的新途径。有望实现条纹斑竹鲨从厨房到实验室，再到应用的价值转化。

附图说明

图1是免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)及单域抗体结构图。

图2是条纹斑竹鲨(Chiloscyllium plagiosum Bennett)vNAR代表序列(以SEQ ID NO:3为例)与斑纹须鲨(Orectolobus Maculatus)vNAR代表序列(Gene bank序列号AAP86761)的序列比对图。

图3A是15个不同条纹斑竹鲨vNAR区序列比对图。

图3B是15个不同条纹斑竹鲨vNAR区序列比对图。

图4是条纹斑竹鲨vNAR区PCR产物电泳图。

图5是ELISA检测筛选到vNAR单域抗体与抗原HSA的结合数据图。

图6是条纹斑竹鲨vNAR区PCR产物电泳图。

图7是ELISA检测筛选到vNAR单域抗体与抗原原TNF-α的结合数据图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：条纹斑竹鲨来源抗HSA单域抗体的筛选

1.条纹斑竹鲨的免疫。

A.选择条纹斑竹鲨作为免疫对象，进行下面的条纹斑竹鲨来源单域抗体的筛选。

B.采用50微克抗原HSA(Sigma-Aldrich，70024-90-7，以下同此)与完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich，F5881)1:1的体积比例混合免疫条纹斑竹鲨第一次；

C.4周后，采用50微克抗原HSA与非完全完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich，F5606)1:1的体积比例混合免疫条纹斑竹鲨第二次；

D.4周后采用50微克抗原HSA直接尾静脉注射免疫条纹斑竹鲨第三次；

E.4周后采用50微克抗原HSA直接尾静脉注射免疫条纹斑竹鲨第四次；

F.4周后采用50微克抗原HSA直接尾静脉注射免疫条纹斑竹鲨第五次；

2.构建条纹斑竹鲨来源噬菌体抗体库并进行特异抗原HSA单域抗体的淘筛。

A.以上述HSA抗原免疫的条纹斑竹鲨的外周血和脾脏为起始材料，采用TRIZOL(Thermo，15596018)法提取RNA病采用逆转录试剂盒(TAKARA，6210B)反转录为cDNA。

去除基因组反应

42℃反应2min。

得到去除基因组的RNA。

反转录反应

37℃，15min；85℃，5sec。

得到cDNA。

B.目的基因的克隆。

根据条纹斑竹鲨vNAR保守序列设计引物，引物两端带有克隆进pComb3XSS载体的SfiI酶切位点，PCR法扩增获得vNAR区编码基因。

建库上游引物(SEQ ID NO:18)：

TCGCTACCGTGGCCCAGGCGGCCCAACGGGTTGAACAAACACC其中下划线为SfiI酶切位点序列。

建库下游引物(SEQ ID NO:19)：

TGATGGTGCTGGCCGGCCTGGCCTTTCACAGTCAGAATGGTGC其中下划线为SfiI酶切位点序列。

PCR反应体系(TAKARA,HS,R040Q)：

反应条件：

结果见图4，其中泳道M为分子Marker，泳道2和3为条纹斑竹鲨vNAR区PCR产物。从图中可以看出，条纹斑竹鲨vNAR区PCR产物大小为300bp左右，大小正确。

C.文库构建。将克隆到的全套单域抗体编码基因片段和pComb3XSS载体采用SfiI酶切，酶切完后用T4连接酶将vNAR区基因片段连接至pComb3XSS载体，使vNAR区基因与噬菌体外壳蛋白pIII融合表达。并通过电转TG1大肠杆菌建库。

pComb3XSS酶切反应体系：

50℃酶切过夜。

vNAR区PCR产物酶切反应体系：

50℃酶切过夜。

T4连接酶连接反应体系：

16℃连接过夜。

D.文库淘筛。利用噬菌体可再扩增的特性，将HSA通过生物素标记并与streptactin beads结合固定到珠子上面，通过三轮亲和吸附-洗脱-扩增，淘筛到能与抗原特异性结合的抗体及其基因。

实施例2ELISA检测筛选到vNAR单域抗体与抗原HSA的结合

1.包被：将抗原蛋白HSA稀释至含量为1μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml稀释后的抗原蛋白，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

2.噬菌体的感染：将TG1(北京华越洋生物)扩增使其OD600长到0.5，加入筛选到的噬菌体即实施例1所得，并在amp抗性平板上筛选出单克隆。

3.感染扩增：挑取单克隆，使其OD600长到0.5，加入helper phage M13KO7(购自NEB公司)，37℃孵育30-60min。3200g 4℃离心10min。收集沉淀，用500ml 2×YT培养基(含0.1％glucose，100μg/ml ampicillin，50μg/ml kanamycin)25℃，250rpm培养20h。3200g 4℃离心10min，收集上清。所述2×YT培养基配方(1L):蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化钠4ml，pH至7.0。

4.加样：加步骤3收集到的噬菌体上清于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白对照孔，空白对照孔除了不加抗原外，其它均相同)。

5.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的His酶标抗体(Santa Cruz sc-8036HRP，1:2500稀释)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

6.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。TMB底物溶液配方：TMB(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml；底物缓冲液10ml；0.75％过氧化氢32ul；其中50ml底物缓冲液:0.2M磷酸氢二钠25.7ml；0.1M柠檬酸24.3ml，蒸馏水。

7.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

8.结果判定：在酶标仪仪上，于450nm处测各孔OD值，结果见图5。其中对照为空白对照未加HSA抗原，2C1-2C11为筛选的不同的克隆。从图5可以看出，2C5号克隆的ELISA OD读数为1.0左右，而对照只有0.1左右，2C5号克隆可以很好的与HSA结合。

9.选取阳性克隆2C5进行测序(厦门铂瑞生物技术有限公司进行测序)得到条纹斑竹鲨来源抗HSA单域抗体序列，如SEQ ID NO:20所示。

SEQ ID NO:20：其中下划单线为CDR1区，下划双线为CDR3区。

QRVEQTPTTTTKEAGESLTINCVLKGSSCPMSNTYWYFTKKGATKKASLSTGG

RYSDTKNTASKSFSLRISDLRVEDSGTYHCEAGGGTILTVK

ELISA结果显示2C5号克隆可以很好的与HSA结合，证明通过免疫条纹斑竹鲨可以获得条纹斑竹鲨来源的单域抗体，测序结果也显示，获得的单域抗体骨架与已经测序的15个克隆(SEQ ID NO:3-17)的骨架一致，其序列组成依次为FR1，CDR1，FR2，CDR3和FR3区，FR1、FR2、FR3区组成的稳定的氨基酸序列，抗体互补决定区为CDR1和CDR3区，CDR1的长度为8个氨基酸，其中第二位为半胱氨酸(Cys，C),第七位为苏氨酸(Thr，T)。CDR3的长度为16个氨基酸。

实施例3.条纹斑竹鲨来源抗TNF-α单域抗体的筛选

1.条纹斑竹鲨的免疫。

A.选择条纹斑竹鲨作为免疫对象，进行下面的条纹斑竹鲨来源单域抗体的筛选。

B.采用50微克抗原TNF-α(Sigma-Aldrich，T6674，以下同此)与完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich，F5881)1:1的体积比例混合免疫条纹斑竹鲨第一次；

C.4周后，采用50微克抗原TNF-α与非完全完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich，F5606)1:1的体积比例混合免疫条纹斑竹鲨第二次；

D.4周后采用50微克抗原TNF-α直接尾静脉注射免疫条纹斑竹鲨第三次；

E.4周后采用50微克抗原TNF-α直接尾静脉注射免疫条纹斑竹鲨第四次；

F.4周后采用50微克抗原TNF-α直接尾静脉注射免疫条纹斑竹鲨第五次。

2.构建条纹斑竹鲨来源噬菌体抗体库并进行特异抗原TNF-α单域抗体的淘筛。

A.以TNF-α抗原免疫的条纹斑竹鲨的外周血和脾脏为起始材料，采用TRIZOL(Thermo，15596018)法提取RNA病采用逆转录试剂盒(TAKARA，6210B)反转录为cDNA。

去除基因组反应

42℃反应2min。

得到去除基因组的RNA。

反转录反应

37℃，15min；85℃，5sec。

得到cDNA。

B.目的基因的克隆。

根据条纹斑竹鲨vNAR保守序列设计引物，引物两端带有克隆进pComb3XSS载体的SfiI酶切位点，PCR法扩增获得vNAR区编码基因。

建库上游引物(SEQ ID NO:18)：

TCGCTACCGTGGCCCAGGCGGCCCAACGGGTTGAACAAACACC其中下划线为SfiI酶切位点序列。

建库下游引物(SEQ ID NO:19)：

TGATGGTGCTGGCCGGCCTGGCCTTTCACAGTCAGAATGGTGC其中下划线为SfiI酶切位点序列。

PCR反应体系(TAKARA,HS,R040Q)：

反应条件：

结果表明条纹斑竹鲨vNAR区PCR产物大小为300bp左右，大小正确。

C.文库构建。将克隆到的全套单域抗体编码基因片段和pComb3XSS载体采用SfiI酶切，酶切完后用T4连接酶将vNAR区基因片段连接至pComb3XSS载体，使vNAR区基因 与噬菌体外壳蛋白pIII融合表达。并通过电转TG1大肠杆菌建库。

pComb3XSS酶切反应体系：

50℃酶切过夜。

vNAR区PCR产物酶切反应体系：

50℃酶切过夜。

T4连接酶连接反应体系：

16℃连接过夜。

D.文库淘筛。利用噬菌体可再扩增的特性，将TNF-α通过生物素标记与streptactin beads结合固定到珠子上面，通过三轮亲和吸附-洗脱-扩增，淘筛到能与抗原特异性结合的抗体及其基因。

实施例4.ELISA检测筛选到vNAR单域抗体与抗原TNF-α的结合

1.包被：将抗原蛋白TNF-α稀释至含量为5μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

2.噬菌体的感染：将TG1(北京华越洋生物)扩增使其OD600长到0.5，加入筛选到的噬菌体即实施例3所得，并在amp抗性平板上筛选出单克隆。

3.感染扩增：挑取单克隆，使其OD600长到0.5，加入helper phage M13KO7(购自NEB公司)，37℃孵育30-60min。3200g 4℃离心10min。收集沉淀，用500ml 2x YT培养基(含0.1％glucose，100μg/ml ampicillin，50μg/ml kanamycin)25℃，250rpm培养20h。3200g 4℃ 离心10min，收集上清。

4.加样：加步骤3收集到的噬菌体于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白对照孔，空白对照孔除了不加抗原外，其它均相同)。

5.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的His酶标抗体0.1ml(Santa Cruz sc-8036HRP，1:2500稀释)。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

6.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

7.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

8.结果判定：在酶标仪上，于450nm处测各孔OD值，结果见图7。其中对照为不加抗原TNF-α，3D1-3D11为筛选的不同的克隆。从图7可以看出，3D2号克隆的ELISA OD读数为1.1左右，而对照只有0.1左右，3D2号克隆可以很好的与TNF-α结合。

9.选取阳性克隆3D2进行测序得到条纹斑竹鲨来源抗TNF-α单域抗体序列，如SEQ ID NO:21所示。

SEQ ID NO:21：其中下划单线为CDR1区，下划双线为CDR3区。

QRVEQTPTTTTKEAGESLTINCVLKGSSCALGSTYWYFTKKGATKKASLSTGG

RYSDTKNTASKSFSLRISDLRVEDSGTYHCEAGGGTILTVK

ELISA结果显示3D2号克隆可以很好的与TNF-α结合，证明通过免疫条纹斑竹鲨可以获得条纹斑竹鲨来源的单域抗体，测序结果也显示，获得的单域抗体骨架与已经测序的15个克隆(SEQ ID NO:3-17)的骨架一致，其序列组成依次为FR1，CDR1，FR2，CDR3和FR3区，FR1、FR2、FR3区组成的稳定的氨基酸序列，抗体互补决定区为CDR1和CDR3区，CDR1的长度为8个氨基酸，其中第二位为半胱氨酸(Cys，C),第七位为苏氨酸(Thr，T)。CDR3的长度为12个氨基酸。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 国家海洋局第三海洋研究所

<120> 一种单域抗体蛋白骨架及其制备方法

<130> HYSS-16001-CNI

<160> 49

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

caacgggttg aacaaacacc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tttcacagtc agaatggtgc 20

<210> 3

<211> 110

<212> PRT

<213> 条纹斑竹鲨

<400> 3

Gln Arg Val Glu Gln Thr Pro Thr Thr Thr Thr Lys Glu Ala Gly Glu

Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Lys Gly Ser Ser Cys Ala Leu Gly

Ser Thr Tyr Trp Tyr Phe Thr Lys Lys Gly Ala Thr Lys Lys Ala Ser

Leu Ser Thr Gly Gly Arg Tyr Ser Asp Thr Lys Asn Thr Ala Ser Lys

Ser Phe Ser Leu Arg Ile Ser Asp Leu Arg Val Glu Asp Ser Gly Thr

Tyr His Cys Glu Ala Cys Leu Gly Gly Pro Tyr Cys Asp Thr Leu Glu

Tyr Asp Tyr Tyr Glu Gly Gly Gly Thr Ile Leu Thr Val Lys

<210> 4

<211> 108

<212> PRT

<213> 条纹斑竹鲨

<400> 4

Gln Arg Val Glu Gln Thr Pro Thr Thr Thr Thr Lys Glu Ala Gly Glu

Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Lys Gly Ser Ser Cys Ala Leu Gly

Ser Thr Tyr Trp Tyr Phe Thr Lys Lys Gly Ala Thr Lys Lys Ala Ser

Leu Ser Thr Gly Gly Arg Tyr Ser Asp Thr Lys Asn Thr Ala Ser Lys

Ser Phe Ser Leu Arg Ile Ser Asp Leu Arg Val Glu Asp Ser Gly Thr

Tyr His Cys Glu Ala Ser Thr Val Gly Asp Cys Thr Ala Glu Tyr Asp

Tyr Tyr Glu Gly Gly Gly Thr Ile Leu Thr Val Lys

<210> 5

<211> 108

<212> PRT

<213> 条纹斑竹鲨

<400> 5

Gln Arg Val Glu Gln Thr Pro Thr Thr Thr Thr Lys Glu Ala Gly Glu

Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Lys Gly Ser Thr Cys Ala Leu Gly

Ser Thr Tyr Trp Tyr Phe Thr Lys Lys Gly Ala Thr Lys Lys Ala Ser

Leu Ser Thr Gly Gly Arg Tyr Ser Asp Thr Lys Asn Thr Ala Ser Lys

Ser Phe Ser Leu Arg Ile Ser Asp Leu Arg Val Glu Asp Ser Gly Thr

Tyr His Cys Glu Ala Tyr Ser Pro Val Gly Trp Asn Cys Ala Tyr Asn

Tyr Ile Glu Gly Gly Gly Thr Ile Leu Thr Val Lys

<210> 6

<211> 112

<212> PRT

<213> 条纹斑竹鲨

<400> 6

Gln Arg Val Glu Gln Thr Pro Thr Thr Thr Thr Lys Glu Ala Gly Glu

Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Lys Gly Ser Ser Cys Ala Leu Ser

Ser Thr Tyr Trp Tyr Phe Thr Lys Lys Gly Ala Thr Lys Lys Ala Ser

Leu Ser Thr Gly Gly Arg Tyr Ser Asp Thr Lys Asn Thr Ala Ser Lys

Ser Phe Ser Leu Arg Ile Ser Asp Leu Arg Val Glu Asp Ser Gly Thr

Tyr His Cys Glu Ala Tyr Lys Thr Ala Gly Met Ser Tyr Cys Glu Leu

Glu Leu Asp Ser Tyr Ile Glu Gly Gly Gly Thr Ile Leu Thr Val Lys

<210> 7

<211> 112

<212> PRT

<213> 条纹斑竹鲨

<400> 7

Gln Arg Val Glu Gln Thr Pro Thr Thr Thr Thr Lys Glu Ala Gly Glu

Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Lys Gly Ser Ser Cys Ala Leu Gly

Ser Thr Tyr Trp Tyr Phe Thr Lys Lys Gly Ala Thr Lys Lys Ala Ser

Leu Ser Thr Gly Gly Arg Tyr Ser Asp Thr Lys Asn Thr Ala Ser Lys

Ser Phe Ser Leu Arg Ile Ser Asp Leu Arg Val Glu Asp Ser Gly Thr

Tyr His Cys Glu Ala Tyr Asn Gln Ala Gly Arg Cys Asp Thr Ala Ser

Arg Trp Ile Gly Ser His Glu Gly Gly Gly Thr Ile Leu Thr Val Lys

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<212> PRT

<213> 条纹斑竹鲨

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Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Lys Gly Ser Ser Cys Ala Leu Gly

Ser Thr Tyr Trp Tyr Phe Thr Lys Lys Gly Ala Thr Lys Lys Ala Ser

Leu Ser Thr Gly Gly Arg Tyr Ser Asp Thr Lys Asn Thr Ala Ser Lys

Ser Phe Ser Leu Arg Ile Ser Asp Leu Arg Val Glu Asp Ser Gly Thr

Tyr His Cys Glu Ala Tyr Ser Tyr Ser Trp Asp Asp Val Pro Val Ile

Arg Thr Ile Ala Val Glu Gly Gly Gly Thr Ile Leu Thr Val Lys

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<212> PRT

<213> 条纹斑竹鲨

<400> 9

Gln Arg Val Glu Gln Thr Pro Thr Thr Thr Thr Lys Glu Ala Gly Glu

Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Lys Gly Ser Ser Cys Ala Leu Gly

Ser Thr Tyr Trp Tyr Phe Thr Lys Lys Gly Ala Thr Lys Lys Ala Ser

Leu Ser Thr Gly Gly Arg Tyr Ser Asp Thr Lys Asn Thr Ala Ser Lys

Ser Phe Ser Leu Arg Ile Ser Asp Leu Arg Val Glu Asp Ser Gly Thr

Tyr His Cys Glu Ala Tyr Pro Cys Tyr Ser Arg Thr His Asn Val Lys

Gly Gly Gly Thr Ile Leu Thr Val Lys

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<211> 105

<212> PRT

<213> 条纹斑竹鲨

<400> 10

Gln Arg Val Glu Gln Thr Pro Thr Thr Thr Thr Lys Glu Ala Gly Glu

Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Lys Gly Ser Ser Cys Ala Leu Gly

Ser Thr Tyr Trp Tyr Phe Thr Lys Lys Gly Ala Thr Lys Lys Ala Ser

Leu Ser Thr Gly Gly Arg Tyr Ser Asp Thr Lys Asn Thr Ala Ser Lys

Ser Phe Ser Leu Arg Ile Ser Asp Leu Arg Val Glu Asp Ser Gly Thr

Tyr His Cys Glu Ala Tyr Ser Tyr Cys Leu Gly Gln Pro Pro Ile Glu

Gly Gly Gly Thr Ile Leu Thr Val Lys

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<212> PRT

<213> 条纹斑竹鲨

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Gln Arg Val Glu Gln Thr Pro Thr Thr Thr Thr Lys Glu Ala Gly Glu

Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Lys Gly Ser Ser Cys Ala Leu Ser

Ser Thr Tyr Trp Tyr Phe Thr Lys Lys Gly Ala Thr Lys Lys Ala Ser

Leu Ser Thr Gly Gly Arg Tyr Ser Asp Thr Lys Asn Thr Ala Ser Lys

Ser Phe Ser Leu Arg Ile Ser Asp Leu Arg Val Glu Asp Ser Gly Thr

Tyr His Cys Glu Ala Tyr Arg Asp Trp Asp Val Gly Asn Tyr Cys Tyr

Thr Asp Ser Tyr Ile Glu Gly Gly Gly Thr Ile Leu Thr Val Lys

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<212> PRT

<213> 条纹斑竹鲨

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Gln Arg Val Glu Gln Thr Pro Thr Thr Thr Thr Lys Glu Ala Gly Glu

Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Lys Gly Ser Arg Cys Ala Leu Phe

Asn Thr His Trp Tyr Phe Thr Lys Lys Gly Ala Thr Lys Lys Ala Ser

Leu Ser Thr Gly Gly Arg Tyr Ser Asp Thr Lys Asn Thr Ala Ser Lys

Ser Phe Ser Leu Arg Ile Ser Asp Leu Arg Val Glu Asp Ser Gly Thr

Tyr His Cys Glu Ala Tyr Arg Val Asp Cys Ser Pro His Tyr Ile Glu

Gly Gly Gly Thr Ile Leu Thr Val Lys

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<212> PRT

<213> 条纹斑竹鲨

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Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Lys Gly Ser Ser Cys Ala Leu Asp

Ser Thr Tyr Trp Tyr Phe Thr Lys Lys Gly Ala Thr Lys Lys Ala Ser

Leu Ser Thr Gly Gly Arg Tyr Ser Asp Thr Lys Asn Thr Ala Ser Lys

Ser Phe Ser Leu Arg Ile Ser Asp Leu Arg Val Glu Asp Ser Gly Thr

Tyr His Cys Glu Ala Tyr Gly Cys Ser Thr Val Ile Trp Gly Ser Thr

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<212> PRT

<213> 条纹斑竹鲨

<400> 14

Gln Arg Val Glu Gln Thr Pro Thr Thr Thr Thr Lys Glu Ala Gly Glu

Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Lys Gly Ser Ser Cys Ala Leu Asp

Ser Thr Tyr Trp Tyr Phe Thr Lys Lys Gly Ala Thr Lys Lys Ala Ser

Leu Ser Thr Gly Gly Arg Tyr Ser Asp Thr Lys Asn Thr Ala Ser Lys

Ser Phe Ser Leu Arg Ile Ser Asp Leu Arg Val Glu Asp Ser Gly Thr

Tyr His Cys Lys Ala Tyr Thr Ala Gly Arg Gly Tyr Cys Ser Ser Trp

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<212> PRT

<213> 条纹斑竹鲨

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Gln Arg Val Glu Gln Thr Pro Thr Thr Thr Thr Lys Glu Ala Gly Glu

Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Lys Gly Ser Ser Cys Ala Leu Gly

Ser Thr Tyr Trp Tyr Phe Thr Lys Lys Gly Ala Thr Lys Lys Ala Ser

Leu Ser Thr Gly Gly Arg Tyr Ser Asp Thr Lys Asn Thr Ala Ser Lys

Ser Phe Ser Leu Arg Ile Ser Asp Leu Arg Val Glu Asp Ser Gly Thr

Tyr His Cys Glu Ala Tyr Cys Trp Gly Ser Ser Tyr Tyr Glu Gly Gly

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Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Lys Gly Ser Asp Cys Ala Leu Gly

Arg Thr Tyr Trp Tyr Phe Thr Lys Lys Gly Ala Thr Lys Lys Ala Ser

Leu Ser Thr Gly Gly Arg Tyr Ser Asp Thr Lys Asn Thr Ala Ser Lys

Ser Phe Ser Leu Arg Ile Ser Asp Leu Arg Val Glu Asp Ser Gly Thr

Tyr His Cys Glu Ala Tyr Pro Arg Pro Gly Ile Gly Val Phe Cys Ala

Leu Thr Ser Gly Ile Ser Asn Tyr Glu Gly Gly Gly Thr Ile Leu Thr

Val Lys

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Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Lys Gly Ser Ser Cys Pro Met Gly

Ser Thr Tyr Trp Tyr Phe Thr Lys Lys Gly Ala Thr Lys Lys Ala Ser

Leu Ser Thr Gly Gly Arg Tyr Ser Asp Thr Lys Asn Thr Ala Ser Lys

Ser Phe Ser Leu Arg Ile Ser Asp Leu Arg Val Glu Asp Ser Gly Thr

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<212> DNA

<213> 人工合成

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tgatggtgct ggccggcctg gcctttcaca gtcagaatgg tgc 43

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<213> 人工合成

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Gln Arg Val Glu Gln Thr Pro Thr Thr Thr Thr Lys Glu Ala Gly Glu

Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Lys Gly Ser Ser Cys Pro Met Ser

Asn Thr Tyr Trp Tyr Phe Thr Lys Lys Gly Ala Thr Lys Lys Glu Ser

Leu Thr Asn Gly Gly Arg Tyr Ser Val Thr Met Asn Lys Ala Ser Lys

Ser Phe Ser Leu Arg Ile Ser Asp Leu Arg Val Glu Asp Ser Gly Thr

Tyr His Cys Glu Ala Tyr Ser Ser Ser Thr Ala Gly Ser Tyr Cys Tyr

Glu Ala Gly Ile Pro His Asn Tyr Ile Glu Gly Gly Gly Thr Ile Leu

Thr Val Lys

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<212> PRT

<213> 人工合成

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Gln Arg Val Glu Gln Thr Pro Thr Thr Thr Thr Lys Glu Ala Gly Glu

Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Lys Gly Ser Ser Cys Ala Leu Gly

Ser Thr Tyr Trp Tyr Phe Thr Lys Lys Gly Ala Thr Lys Lys Ala Ser

Leu Ser Thr Gly Gly Arg Tyr Ser Asp Thr Lys Asn Thr Ala Ser Lys

Ser Phe Ser Leu Arg Ile Ser Asp Leu Arg Val Glu Asp Ser Gly Thr

Tyr His Cys Glu Ala Cys Lys Ala Gly Ala Thr Ser Gly Tyr Thr Pro

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Gln Arg Val Glu Gln Thr Pro Thr Thr Thr Thr Lys Glu Ala Gly Glu

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Trp Tyr Phe Thr Lys Lys Gly Ala Thr Lys Lys Ala Ser Leu Ser Thr

Gly Gly Arg Tyr Ser Asp Thr Lys Asn Thr Ala Ser Lys Ser Phe Ser

Leu Arg Ile Ser Asp Leu Arg Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr His Cys

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Gly Gly Gly Thr Ile Leu Thr Val Lys

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<212> PRT

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<212> PRT

<213> 条纹斑竹鲨

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Glu

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Glu

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<400> 49

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