本发明涉及生物医学领域中，埃博拉病毒感染血液中的特征miRNA与应用。
背景技术：
埃博拉病毒病是由纤丝病毒科(filoviridae)的埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)所引起的一种急性出血性传染病。病死率很高，可达50％～90％。
埃博拉病毒基因组为单股负链RNA，约长19kb，能编码核蛋白(NP)及包膜蛋白(VP35、VP40、VP30、VP24)、糖蛋白(GP)和RNA聚合酶等7个结构蛋白，其中GP基因对EBOV复制有独特的编码和转录功能。病毒在感染细胞的胞质中复制、装配，以芽生方式释放。埃博拉病毒主要包括扎伊尔型(EBOV-Z)，苏丹型(EBOV-S)，科特迪瓦型(EBOV-C)及雷斯顿型(EBOV-R)等，不同亚型的特性不同，其中扎伊尔型毒力最强，苏丹型次之，两者对人类和非人灵长类的致死率很高。雷斯顿型和科特迪瓦型对人的毒力较低，表现为亚临床感染，但对非人灵长类具有致命性。
EBOV是一种人兽共患病毒，其传播途径尚不明确，通常由与人类密切接触到感染动物的血液、分泌物、器官或其他体液造成感染，而直接接触感染者的体液等均可造成人际传播。各种非人灵长类动物和人类普遍易感。因此，感染者家属、医务人员、检验人员、在埃博拉病毒流行现场的工作人员，感染动物接触者等均是高危人群。
EBOV是一种泛嗜性的病毒，可侵犯各系统器官，尤以肝、脾损害为重。埃博拉病毒病的发生与机体的免疫应答水平有关。单核吞噬细胞系统尤其是吞噬细胞是首先被病毒攻击的靶细胞，随后成纤维细胞和内皮细胞均被感染，血管通透性增加，纤维蛋白沉着。感染后2天病毒首先在肺中检出，4天后在肝、脾等组织中检出，6天后全身组织均可检出。
目前许多关于病毒致病性的研究都是在动物模型和体外实验中进行的，而关于人体病毒感染的相关研究少。病毒感染机体的每个阶段，从病毒进入细胞、局部复制、传播(病毒血症)、在靶器官内繁殖、患者康复(但仍带毒)或死亡，均存在两种因素的相互制约：病毒感染和宿主机体应答与防御。研究EBOV对人类的致病机理和免疫逃逸机制，进而根据这些关键步骤，确定新型靶标位点，研发治疗药物，对于埃博拉出血热的综合防控具有重要意义。同时，研究人体感染EBOV的反应特征，发现感染和预后特征性的分子标识，对于建立快速诊断方法、建立及时有效干预方案可以提供理论依据。
技术实现要素：
本发明所要结决的技术问题是如何诊断EBOV感染。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了下述1)或2)的应用：
1)检测R1含量的系统在制备诊断或辅助诊断EBOV感染产品中的应用；所述R1为hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-744-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-1285-3p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-550a-5p、hsa-miR-3940-3p、hsa-miR-574-5p和/或hsa-miR-941；
2)检测所述R1含量的系统在诊断或辅助诊断EBOV感染中的应用。
上述应用中，所述检测R1含量的系统可为利用现有技术中的方法检测所述R1含量所需的试剂和/或仪器，如利用高通量测序检测所述R1含量所需的试剂和/或仪器，或利用定量PCR检测所述R1含量所需的试剂和/或仪器，或利用northern杂交技术检测所述R1含量所需的试剂和/或仪器，或利用基因芯片检测所述R1含量所需的试剂和/或仪器。
上述应用中，所述高通量测序可利用Illumina测序平台进行。
上述应用中，所述检测R1含量的系统还可包括数据处理系统，所述数据处理系统用来分析现有技术中的方法直接得到的结果，确定所述R1的含量。所述数据处理系统可为软件和/或模块。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述N1)或N2)的应用：
N1)以所述R1作为EBOV感染标志物的诊断或辅助诊断EBOV感染方法中所用的系统在下述a1)或a2)中的应用：
a1)制备诊断或辅助诊断EBOV感染产品；
a2)诊断或辅助诊断EBOV感染；
N2)以所述R1作为EBOV感染标志物在上述a1)或a2)中的应用。
所述以所述R1作为EBOV感染标志物的诊断或辅助诊断EBOV感染方法中所用的系统可为上文所述检测R1含量的系统。
为解决上述技术问题，本发明还提供了诊断或辅助诊断EBOV感染产品。
本发明所提供的诊断或辅助诊断EBOV感染产品，为所述检测R1含量的系统。
为解决上述技术问题，本发明还提供了非诊断目的的EBOV病毒载量相关分子特征谱的构建方法。
本发明所提供的非诊断目的的EBOV病毒载量相关分子特征谱的构建方法包括：分别对EBOV感染组和非EBOV感染组血液中的RNA进行定量分析，根据分析结果获得EBOV病毒载量相关分子特征谱；所述EBOV病毒载量相关分子特征谱为所述R1。
上述方法中，所述对EBOV感染组和非EBOV感染组血液中的RNA进行定量分析具体还可包括：纯化EBOV感染组和非EBOV感染组血液中的RNA，利用Illumina测序平台检测RNA的含量。
所述纯化EBOV感染组和非EBOV感染组血液中的RNA可利用15％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(PAGE)进行。纯化得到的RNA可为15-30bp的RNA。
所述利用Illumina测序平台检测RNA的含量可包括：将纯化后的RNA连接3’和5’端接头后反转录为cDNA；然后进行PCR扩增，构建文库；利用Illumina测序平台对所述文库进行高通量测序，检测待测样本中RNA的含量。
所述反转录可利用反转录酶进行，如Invitrogen的SuperScriptII反转录酶。
所述扩增的条件可为：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸15s，14个循环，72℃延伸8min。
上述方法中，所述EBOV感染组可包括至少一个EBOV感染者。所述非EBOV感染组可包括至少一个非EBOV感染者。
本发明中，所述诊断或辅助诊断EBOV感染产品可为诊断或辅助诊断EBOV感染的医药和/或卫生器械，如试剂、试纸、材料或仪器。
本发明中，所述R1含量可为血液中所述R1的含量。
在实际应用中，可通过比较所述R1的11个miRNA在待测对象与非EBOV感染者血液中的表达水平来判断待测对象是否为EBOV感染者。具体的判断标准可为：如待测对象的hsa-miR-1285-3p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-3940-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-550a-5p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-744-5p和hsa-miR-941这11个miRNA中有至少一个的表达水平低于非EBOV感染者相应miRNA表达水平的1/3，所述待测对象为候选为EBOV感染者，如所述待测对象的hsa-miR-1285-3p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-3940-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-550a-5p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-744-5p和hsa-miR-941这11个miRNA的表达水平均不低于非EBOV感染者相应miRNA表达水平的1/3，所述待测对象非或候选非EBOV感染者。
本发明通过分析EBOV感染者与非EBOV感染者的差异表达miRNA，进一步通过相关性分析，发现了与EBOV病毒感染相关的miRNA(p<0.01)：11个miRNAs这11个miRNAs分别为：hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-744-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-1285-3p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-550a-5p、hsa-miR-3940-3p、hsa-miR-574-5p和hsa-miR-941，并且这11个miRNA在EBOV感染者中相对于非EBOV感染者中表达量下降，表明这11个miRNA可以作为生物分子标识，用于EBOV感染者的临床诊断。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、EBOV感染者血液中与病毒载量相关的分子标识
从EBOV感染者与非EBOV感染者全血中提取总RNA，用带有Oligo(dT)的磁珠吸附纯化总RNA中的mRNA，在加热条件下将mRNA片段化，并以此为模板反转录合成双链cDNA。对双链cDNA进行末端修复补齐，使其5’端磷酸化，3’端加“A”。将带3’dTMP端的双链cDNA接头连到测序接头上，通过PCR扩增，利用AMPure XP磁珠富集纯化接头产物，通过PCR反应鉴定文库。将构建好的文库用Illumina测序平台进行双末端测序。使用Perl脚本过滤测序产生的原始数据中的接头序列、两端低质量序列(Q<＝20的碱基数占整条reads的50％以上的序列)、低复杂度序列。
使用Tophat软件将有效数据比对到人参考基因组上，Cutfflinks软件组装比对结果，通过Cutffdiff软件得出EBOV感染者(n＝22)与非EBOV感染者(n＝10)相比的差异表达基因，进一步通过相关性分析，发现与EBOV感染者血液中EBOV病毒载量相关的差异表达分子。结果显示，89个基因的差异表达与EBOV病毒载量相关(r2>0.64,p<0.01)，其中，排在前10的分子为：DPAGT1(dolichyl-phosphate N-acetylglucosaminephosphotransferase 1),GPR125(G protein-coupled receptor 125),CYP4B1(cytochrome P450 family 4 subfamily B member 1),PTPRK(protein tyrosine phosphatase,receptor type K),NEK10(NIMA related kinase 10),NCAPD3(non-SMC condensin II complex subunit D3),ABCA13(ATP binding cassette subfamily A member 13),DNAH11(dynein,axonemal,heavy chain 11),KDELC1(KDEL motif containing 1),MTA3(metastasis associated 1 family member 3)，并且这10个分子在EBOV感染者中相对于非EBOV感染者中表达量增加。具体结果如表1所示，表明这10个分子可以作为生物分子标识，用于EBOV感染者的临床诊断。
表1、EBOV感染相关的分子标识
注：表1中列出了10个分子在EBOV感染者中相对于非EBOV感染者中表达水平的差异倍数及10个分子与EBOV病毒载量相关性分析结果。
在实际应用中，可通过比较DPAGT1、GPR125、CYP4B1、PTPRK、NEK10、NCAPD3、ABCA13、DNAH11、KDELC1和MTA3在待测对象与非EBOV感染者血液中的表达水平来判断待测对象是否为EBOV感染者。具体的，根据上述结果得到的判断标准如下：如待测对象的DPAGT1、GPR125、CYP4B1、PTPRK、NEK10、NCAPD3、ABCA13、DNAH11、KDELC1和MTA3这10个基因中至少有一个的表达水平高于非EBOV感染者相应基因的3倍，该待测对象疑似EBOV感染者，如待测对象的DPAGT1、GPR125、CYP4B1、PTPRK、NEK10、NCAPD3、ABCA13、DNAH11、KDELC1和MTA3这10个基因的表达水平均不高于非EBOV感染者相应基因的3倍，该待测对象为非EBOV感染者。
实施例2、EBOV感染者血液中与病毒载量相关的小RNAs(sRNAs)
从EBOV感染者与非EBOV感染者全血中提取总RNA，利用15％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(PAGE)从总RNA中分离小片段(15-30nt)RNA，纯化后对分离的小片段RNA连接3’和5’端接头，再运用SuperScriptII反转录酶(Invitrogen产品)将连接有接头的RNA进行反转录，合成cDNA。然后，进行PCR扩增，扩增程序：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸15s，14个循环，72℃延伸8min，由此构建文库。最后，扩展产物利用Illumina测序平台进行高通量测序。使用Perl脚本过滤测序产生的原始数据中的接头序列、两端低质量序列(sQ<＝5的碱基数占整条reads的50％以上的序列、N的比例大于10％的序列、polyA/T/G/C序列)。
使用bowtie软件将长度筛选后的sRNA有效数据比对到人参考基因组上，分析sRNAs在参考基因组上的分布和表达情况，将比对上的序列与miRBase序列进行比对，获得miRNA信息，同时尽可能的去除rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA。结合样本信息得出EBOV感染者(n＝12)与非EBOV感染者(n＝3)相比的差异表达miRNA，进一步通过相关性分析，发现与EBOV病毒感染相关的miRNA。结果显示，11个miRNAs以及它们的靶基因与EBOV病毒载量(VL)相关(p<0.01，差异表达倍数>3)，这11个miRNAs分别为：hsa-miR-151a-5p,hsa-miR-744-5p,hsa-miR-423-5p,hsa-miR-331-3p,hsa-miR-1306-5p,hsa-miR-1285-3p,hsa-miR-185-5p,hsa-miR-550a-5p,hsa-miR-3940-3p,hsa-miR-574-5p,hsa-miR-941。miRNAs在高水平(VL>107拷贝/mL全血)和中水平(105拷贝/mL全血<VL<107拷贝/mL全血)的病毒载量的EBOV感染样本中的表达水平值见于下表2，并且这11个miRNA在EBOV感染者中相对于非EBOV感染者中表达量下降。具体结果如表2所示，表明这11个miRNA可以作为生物分子标识，用于EBOV感染者的临床诊断。
表2、EBOV感染相关的miRNA
注：表2中列出了11个miRNA的表达水平(中位数TPM值)及与EBOV病毒载量相关性分析结果。
在实际应用中，可通过比较这11个miRNA在待测对象与非EBOV感染者血液中的表达水平来判断待测对象是否为EBOV感染者。具体的，根据上述结果得到的判断标准如下：如待测对象的hsa-miR-1285-3p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-3940-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-550a-5p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-744-5p和hsa-miR-941这11个miRNA中有至少一个的表达水平低于非EBOV感染者相应miRNA表达水平的1/3，该待测对象疑似EBOV感染者，如待测对象的hsa-miR-1285-3p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-3940-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-550a-5p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-744-5p和hsa-miR-941这11个miRNA的表达水平均不低于非EBOV感染者相应miRNA表达水平的1/3，该待测对象为非EBOV感染者。
实施例3、EBOV感染者血液中与临床预后相关的分子标识
从EBOV感染者与非EBOV感染者全血中提取总RNA，用带有Oligo(dT)的磁珠吸附纯化总RNA中的mRNA，在加热条件下将mRNA片段化，并以此为模板反转录合成双链cDNA。对双链cDNA进行末端修复补齐，使其5’端磷酸化，3’端加“A”。将带3’dTMP端的双链cDNA接头连到测序接头上，通过PCR扩增，利用AMPure XP磁珠富集纯化接头产物，通过PCR反应鉴定文库。将构建好的文库用Illumina测序平台进行双末端测序。使用Perl脚本过滤测序产生的原始数据中的接头序列、两端低质量序列(Q<＝20的碱基数占整条reads的50％以上的序列)、低复杂度序列。
使用Tophat软件将有效数据比对到人参考基因组上，Cutfflinks软件组装比对结果，通过Cutffdiff软件得出EBOV感染者(n＝22)与非EBOV感染者(n＝10)相比的差异表达基因，进一步通过相关性分析，发现与EBOV病毒感染者预后相关的分子标识。结果显示，22个分子的差异表达与EBOV病毒感染预后相关(p<0.01，差异表达倍数>2)，其中，15个基因编码蛋白质，其编码的蛋白质的名称为：MS4A2(membrane spanning 4-domains A2),SYCN(syncollin),LCE3E(late cornified envelope 3E),FJX1(four jointed box 1),ARMS2(age-related maculopathy susceptibility 2),RMI2(RecQ mediated genome instability 2),PHLDA2(pleckstrin homology like domain family A member 2),OPRM1(opioid receptor mu 1),TGFBR3L(transforming growth factor beta receptor 3 like),BEND5(BEN domain containing 5),TP53AIP1(tumor protein p53 regulated apoptosis inducing protein 1),SBK2(SH3 domain binding kinase family member 2),GJC2(gap junction protein gamma 2),LDHD(lactate dehydrogenase D),CHST1(carbohydrate sulfotransferase 1)；7个为lincRNA，这7个lincRNA具体为：RP11-552E20.4,RP4-758J18.10,RP11-142G7.2,RP5-1065P14.2,RP11-255A11.21,LINC00639,LINC00092。并且这22个分子在EBOV感染者中的死亡群体中相对于存活群体中表达量升高。具体结果如表3所示，表明这22个分子可以作为生物分子标识，用于EBOV感染者的预后。
表3、预后EBOV病毒感染的分子标识
注：表3中列出了23个分子的表达水平(中位数FKPM值)及其与EBOV感染者预后的分析结果。
在实际应用中，可通过分析这22个分子在待测对象血液中的表达量来对待测对象预后。具体的，根据上述结果得到的判断标准如下：在以EBOV感染者为待测对象时，如待测对象的MS4A2、SYCN、LCE3E、FJX1、ARMS2、RMI2、PHLDA2、OPRM1、TGFBR3L、BEND5、TP53AIP1、SBK2、GJC2、LDHD、CHST1、RP11-552E20.4、RP4-758J18.10、RP11-142G7.2、RP5-1065P14.2、RP11-255A11.21、LINC00639和LINC00092这22个分子中有至少一个的表达水平高于EBOV感染者中的存活对象中相应分子表达水平的2倍，该待测对象疑似为高死亡风险EBOV感染者，如待测对象的MS4A2、SYCN、LCE3E、FJX1、ARMS2、RMI2、PHLDA2、OPRM1、TGFBR3L、BEND5、TP53AIP1、SBK2、GJC2、LDHD、CHST1、RP11-552E20.4、RP4-758J18.10、RP11-142G7.2、RP5-1065P14.2、RP11-255A11.21、LINC00639和LINC00092这22个分子的表达水平均不高于EBOV感染者中的存活对象中相应分子表达水平的2倍，该待测对象为非高死亡风险EBOV感染者，即MS4A2、SYCN、LCE3E、FJX1、ARMS2、RMI2、PHLDA2、OPRM1、TGFBR3L、BEND5、TP53AIP1、SBK2、GJC2、LDHD、CHST1、RP11-552E20.4、RP4-758J18.10、RP11-142G7.2、RP5-1065P14.2、RP11-255A11.21、LINC00639和LINC00092这22个分子中至少一个表达水平高的EBOV感染者的死亡风险高于MS4A2、SYCN、LCE3E、FJX1、ARMS2、RMI2、PHLDA2、OPRM1、TGFBR3L、BEND5、TP53AIP1、SBK2、GJC2、LDHD、CHST1、RP11-552E20.4、RP4-758J18.10、RP11-142G7.2、RP5-1065P14.2、RP11-255A11.21、LINC00639和LINC00092这22个分子的表达水平均低的EBOV感染者。
实施例4、EBOV感染者血液中与临床预后相关的细胞因子
从EBOV感染者与非EBOV感染者全血中提取总RNA，用带有Oligo(dT)的磁珠吸附纯化总RNA中的mRNA，在加热条件下将mRNA片段化，并以此为模板反转录合成双链cDNA。对双链cDNA进行末端修复补齐，使其5’端磷酸化，3’端加“A”。将带3’dTMP端的双链cDNA接头连到测序接头上，通过PCR扩增，利用AMPure XP磁珠富集纯化接头产物，通过PCR反应鉴定文库。将构建好的文库用Illumina测序平台进行双末端测序。使用Perl脚本过滤测序产生的原始数据中的接头序列、两端低质量序列(Q<＝20的碱基数占整条reads的50％以上的序列)、低复杂度序列。
使用Tophat软件将有效数据比对到人参考基因组上，Cutfflinks软件组装比对结果，通过Cutffdiff软件得出EBOV感染者(n＝22)与非EBOV感染者(n＝10)相比的差异表达基因，进一步通过相关性分析，发现与病毒感染预后相关的细胞因子。结果显示，8个细胞因子的差异表达与病毒感染预后相关(p<0.01，差异表达倍数>1.5)，这8个细胞因子分别为：THPO(thrombopoietin),STC2(stanniocalcin 2),IL17D(interleukin 17D),SEMA3C(semaphorin 3C),SEMA3F(semaphorin 3F),EDN2(endothelin 2),GDF10(growth differentiation factor 10),FGF20(fibroblast growth factor 20)，并且这8个细胞因子在EBOV感染者中的死亡群体中相对于存活群体中表达量升高。具体结果如表4所示，表明这8个细胞因子可以作为生物分子标识，用于EBOV感染者的预后。
表4、预后EBOV病毒感染的细胞因子
注：表4中列出了8个细胞因子的表达水平(中位数FKPM值)及其与EBOV感染者预后的分析结果。
在实际应用中，可通过分析这8个细胞因子在待测对象血液中的表达量来对待测对象预后。具体的，根据上述结果得到的判断标准如下：在以EBOV感染者为待测对象时，如待测对象的THPO、STC2、IL17D、SEMA3C、SEMA3F、EDN2、GDF10和FGF20这8个细胞因子中至少有一个的表达水平高于EBOV感染者中的存活对象相应细胞因子表达水平的150％，该待测对象疑似为高死亡风险EBOV感染者，如待测对象的THPO、STC2、IL17D、SEMA3C、SEMA3F、EDN2、GDF10和FGF20这8个细胞因子的表达水平均不高于EBOV感染者中的存活对象相应细胞因子表达水平的150％，该待测对象为非高死亡风险EBOV感染者，即THPO、STC2、IL17D、SEMA3C、SEMA3F、EDN2、GDF10和FGF20中至少一个表达水平高的EBOV感染者的死亡风险高于THPO、STC2、IL17D、SEMA3C、SEMA3F、EDN2、GDF10和FGF20的表达水平均低的EBOV感染者。
本发明还另外选取了非EBOV感染者、存活EBOV感染者以及死亡EBOV感染者的血液样本，利用定量RT-PCR技术检测了这8个细胞因子中的THPO基因和STC2基因在这些研究对象血液中的表达水平。其中，THPO基因的引物序列为5'-TCACTGCCTCAGCCAGAACTAC-3'(序列1)和5'-GGTTCAGCAGACCAGGAATCTT-3'(序列2)，测试非EBOV感染者15例、存活EBOV感染者31例、死亡EBOV感染者18例的血液样本；STC2基因的引物序列为5'-CACAGGTTCGGCTGCATAAG-3'(序列3)和5'-AGTTCACGAGGTCCACGTAGG-3'(序列4)，测试非EBOV感染者15例、存活EBOV感染者26例、死亡EBOV感染者14例的血液样本。
结果发现，THPO和STC2在存活EBOV感染者血液中的表达水平均明显低于死亡EBOV感染者血液中相应细胞因子表达水平(表5)，表明，THPO和STC2是可以作为标志物对EBOV感染者进行预后的。
表5、研究对象血液中STC2和THPO的RT-PCR实验结果
<110> 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所
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<170> PatentIn version 3.5
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