本发明属于医药领域，涉及药物新应用，具体涉及波罗蜜中的异戊烯基黄酮类化合物在制备治疗骨质疏松症药物中的新应用。
背景技术：
骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是以骨微观结构退化、脆性增加和易发生骨折为特征的一种全身性骨骼疾病。随着人类寿命延长和老龄化社会的到来，OP的发生率正逐年上升。据流行病学资料统计，OP的发生率已占全球中老年人口总数的10％，已成为严重威胁中老年人健康的常见、多发病。我国老年人口数居世界首位，现有OP患者9000万，占总人口的7.01％，预计到2050年将增加到2.12亿，那时全世界一半以上的骨质疏松性骨折将发生在亚洲，绝大部分在我国。因此，如何有效的治疗OP，预防脆性骨折的发生，已经成为医学界亟待解决的问题。
现代医学认为，OP是骨代谢过程中骨吸收和骨形成的偶联出现了失衡，导致人体内的钙磷代谢不平衡、骨密度逐渐减少，从而引发的临床症状。组织蛋白酶K(Cathepsin K，CatK)是一种大量表达于破骨细胞中的半胱氨酸蛋白酶，对占骨基质95％的I型胶原、骨桥接素和骨连接素具有最强的降解能力，在破骨细胞介导的骨吸收机制中扮演了关键的角色。动物实验及临床研究均证实，CatK抑制剂可以有效抑制骨吸收。因此，近年来CatK被确认为治疗OP的一个重要分子靶标，以该酶为靶点的抗OP新药筛选研究已成为新药研究领域的热点之一。
从天然药物中分离鉴定结构新颖、活性显著的天然产物一直是新药发现的主要途径之一。波罗蜜又名“树波罗”、“木波罗”、“牛肚子果”等，为桑科波罗蜜属植物，在我国华南各省及台湾地区有广泛栽培。波罗蜜在民间有多重药用用途，如治疗贫血、哮喘和皮肤病、缓解抽搐和溃疡、镇静、抗梅毒、驱虫等，但是在治疗骨质疏松症方面的应用未见文献报道。在本课题组的的前期活性筛选中，波罗蜜根的95％乙醇提取物对人源CatK表现了较强的抑制活性。因此，本发明拟对该活性提取物进行深入的研究，以前发现其中的CatK抑制剂，为针对CatK靶点的抗骨质疏松药物研究与开发提供基础。
技术实现要素：
本发明的目的是提供具有CatK抑制活性的物质，为针对CatK靶点的抗骨质疏松药物的研究与开发提供物质基础。具体涉及波罗蜜中提取的7个异戊烯基黄酮类化合物：5′-hydroxycudraflavone A、artochamin B、artelastoxanthone、artoindonesianin Q、kuwanon T、artoheteroid A和artoheteroid B。其中，artoheteroid A和artoheteroid B是未见文献报道的新化合物。
本发明的进一步目的是提供上述异戊烯基黄酮类化合物在制备治疗骨质疏松症药物中的新用途。
本发明所述的7个异戊烯基黄酮类化合物具有如下所示的化学结构：
本发明所述化合物通过下述方法制备：
波罗蜜根药材(17Kg)，用95％乙醇渗漏提取，提取液减压浓缩得浸膏1.5Kg。浸膏以水混悬，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，并分别浓缩至干。取氯仿萃取部位浸膏532g，上大孔吸附树脂柱(柱规格：15*55cm，5.3Kg)，用乙醇-水梯度洗脱，最后用丙酮冲洗。乙醇-水(3∶2)洗脱所得流份以乙醇-水(2∶5，9∶10)进行反相硅胶柱色谱得6个流份：A～F。流份C以乙醇-水(3∶5，9∶10)进行MCI柱色谱得流份C1～C7。C4和C7分别经制备型分离获得了7个异戊烯基黄酮。
经过活性筛选实验证实，本发明所述的波罗蜜中异戊烯基黄酮类成分对CatK具有明显的抑制活性。其中，artelastoxanthone活性较强，半数抑制浓度(IC50)达到0.88μM。
本发明所述的波罗蜜中异戊烯基黄酮类化合物可进一步制备成治疗骨质疏松症的药物。
附图说明
图1为本发明所述新化合物artoheteroid A的核磁共振氢谱(1H NMR)。
图2为本发明所述新化合物artoheteroid A的核磁共振碳谱(13H NMR)。
图3为本发明所述新化合物artoheteroid B的核磁共振氢谱(1H NMR)。
图4为本发明所述新化合物artoheteroid B的核磁共振碳谱(13H NMR)。
图5为本发明所述新化合物artoheteroids A-B的主要HMBC(H→C)相关。
具体实施方式
通过以下给出的具体实施例，可以进一步清楚地了解本发明。
实施例1 波罗蜜中异戊烯基黄酮类成分的制备
取波罗蜜根药材(17Kg)，用95％乙醇渗漏提取，提取液减压浓缩得浸膏1.5Kg。浸膏以2L水混悬，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取(体积比1∶1)，并分别浓缩至干。取氯仿萃取部位浸膏532g，HP-20大孔吸附树脂拌样(重量比1∶1)，上HP-20大孔吸附树脂柱(柱规格：15*55cm，5.3Kg)，以乙醇-水梯度洗脱(0～95％)，最后用丙酮冲洗。取60％乙醇洗脱流份，以乙醇-水(2∶5，9∶10)进行ODS反相硅胶柱色谱得6个流份：A～F。流份C以乙醇-水(3∶5，9∶10)进行MCI柱色谱得流份C1～C7。C4和C7流份经过进一步的处理获得本发明所述的7个异戊烯基黄酮，具体步骤如下：
(1)流份C4上Sephadex LH-20凝胶柱(甲醇洗脱)，所得流份经反相C18制备色谱得化合物2(8mg)、3(10mg)、4(6mg)。
(2)流份C7经反相C18制备色谱得化合物1(2mg)、5(33mg)、6(10mg)及7(11mg)。
实施例2 波罗蜜中异戊烯基黄酮类成分的结构鉴定
所分离的单体，经高分辨质谱(HR-ESI-MS)和核磁共振谱(1D NMR和2D NMR)鉴定为7个异戊烯基化黄酮类化合物。其中，化合物1-5为已知化合物，而化合物6和7为两个未见文献报道的新化合物。
其中，化合物1被鉴定为5′-hydroxycudraflavone A。C25H22O7，黄色无定型粉末。1H NMR(CD3OD，600MHz)δppm 7.15(1H，s，H-6′)、6.65(1H，d，J＝10.0Hz，H-16)、6.39(1H，s，H-H-3′)、6.35(1H，s，H-8)、6.10(1H，d，J＝9.0Hz，H-11)、5.69(1H，d，J＝10.0Hz，H-17)、5.44(1H，d，J＝9.0Hz，H-12)、1.97(3H，s，H-15)、1.70(3H，s，H-14)、1.47(6H，s，H-19，20)；13C NMR(CD3OD，150MHz)δppm：157.7(C-2)、110.5(C-3)、179.6(C-4)、157.8(C-5)、106.5(C-6)、160.3(C-7)、96.0(C-8)、157.3(C-9)、106.3(C-10)、70.2(C-11)、122.3(C-12)、139.7(C-13)、26.0(C-14)、18.7(C-15)、116.1(C-16)、129.5(C-17)、79.1(C-18)、28.5(C-19，20)、107.6(C-1′)、153.5(C-2′)、105.4(C-3′)、152.6(C-4′)、142.0(C-5′)、109.9(C-6′)。
其中，化合物2被鉴定为atochamin B。C25H24O7，黄色无定型粉末。1H NMR(CD3OD，600MHz)δppm 7.15(1H，s，H-6′)、6.43(1H，s，H-6)、6.36(1H，s，H-3′)、6.11(1H，d，J＝9.0Hz，H-11)、5.44(1H，d，J＝9.0Hz，H-12)、5.24(1H，t，J＝7.2Hz，H-2”)、3.30(2H，d，J＝7.2Hz，H-1″)、1.95(3H，s，H-15)、1.79(3H，s，H-5″)、1.71(3H，s，H-14)、1.68(3H，s，H-4″)；13C NMR(CD3OD，150MHz)δppm 157.2(C-2)、109.9(C-3)、179.6(C-4)、160.1(C-5)、99.9(C-6)、163.0(C-7)、107.4(C-8)、156.4(C-9)、105.5(C-10)、70.2(C-11)、122.5(C-12)、139.5(C-13)、26.0(C-14)、18.7(C-15)、22.2(C-1″)、123.5(C-2″)、132.0(C-3″)、26.0(C-4″)、17.9(C-5″)、108.0(C-1′)、152.4(C-2′)、105.4(C-3′)、153.0(C-4′)、141.9(C-5′)、110.5(C-6′)。
其中，化合物3被鉴定为artelastoxanthone。C25H22O7，黄色无定型粉末。1H NMR(CD3OD，600MHz)δppm 6.77(1H，d，J＝10.0Hz，H-16)、6.45(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)、6.21(1H，d，J＝2.0Hz，H-6)、5.70(1H，d，J＝10.0Hz，H-17)、4.68(1H，s，H-14α)、4.27(1H，s，H-14β)、3.96(1H，d，J＝6.3Hz，H-12)、3.36(1H，dd，J＝6.7，15.8Hz，H-11α)、2.44(1H，dd，J＝6.7，15.8Hz，H-11β)、1.80(3H，s，H-15)、1.50(3H，s，H-20)、1.49(3H，s，H-19)；13C NMR(CD3OD，150MHz)δppm 162.1(C-2)、112.2(C-3)、181.6(C-4)、163.0(C-5)、100.0(C-6)、165.4(C-7)、95.0(C-8)、158.1(C-9)、105.0(C-10)、22.6(C-11)、38.4(C-12)、145.6(C-13)、112.0(C-14)、21.9(C-15)、117.7(C-16)、129.9(C-17)、78.5(C-18)、28.1(C-19)、28.1(C-20)、108.2(C-1′)、146.3(C-2′)、111.5(C-3′)、145.8(C-4′)、137.6(C-5′)、129.7(C-6′)。
其中，化合物4被鉴定为artoindonesianin Q。C22H22O7，黄色无定型粉末。1H NMR(CD3OD，600MHz)δppm 6.75(1H，s，H-6′)、6.62(1H，s，H-3′)、6.46(1H，d，J＝2.2Hz，H-8)、6.32(1H，d，J＝2.2Hz，H-6)、5.08(1H，t，J＝7.0Hz，H-12)、3.89(3H，s，MeO-7)、3.74(3H，s，MeO-4′)、3.04(2H，d，J＝6.7Hz，H-11)、1.61(3H，s，H-15)、1.40(3H，s，H-14)；13C NMR(CD3OD，150MHz)δppm 163.0(C-2)、122.2(C-3)、183.6(C-4)、163.3(C-5)、98.8(C-6)、167.0(C-7)、92.8(C-8)、159.6(C-9)、106.1(C-10)、24.9(C-11)、122.6(C-12)、132.8(C-13)、25.9(C-14)、17.6(C-15)、113.5(C-1′)、149.8(C-2′)、101.3(C-3′)、152.5(C-4′)、139.9(C-5′)、117.8(C-6′)、56.6(7-OCH3)、56.3(4′-OCH3)。
其中，化合物5被鉴定为kuwanon T。C25H26O6，黄色无定型粉末。1H NMR(CD3OD，600MHz)δppm 6.91(1H，d，J＝8.3Hz，H-6′)、6.46(1H，d，J＝2.1Hz，H-8)、6.45(1H，d，J＝8.3Hz，H-5′)、6.19(1H，d，J＝2.1Hz，H-6)、5.26(1H，m，H-2")、5.10(1H，m，H-12)、3.40(2H，d，J＝7.0Hz，H-1″)、3.09(2H，d，J＝7.0Hz，H-11)、1.80(3H，s，H-5″)、1.69(3H，s，H-4")、1.59(3H，s，H-15)、1.35(3H，s，H-14)；13C-NMR(CD3OD，150MHz)δppm 163.2(C-2)、122.1(C-3)、183.7(C-4)、163.6(C-5)、99.5(C-6)、165.5(C-7)、94.6(C-8)、159.3(C-9)、105.5(C-10)、113.8(C-1′)、154.7(C-2′)、117.7(C-3′)、159.0(C-4′)、108.1(C-5′)、128.8(C-6′)、23.3(C-1″)、124.0(C2″)、131.9(C-3″)、18.0(C-4″)、26.0(C-5″)、24.8(C-11)、122.6(C-12)、132.8(C-13)、17.6(C-14)、25.9(C-15)。
其中，化合物6为一种红色无定形粉末，HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z379.0821([M-H]-，计算值：379.0823)，确定其分子式为C21H16O7。红外光谱(vmax 3355，1654，1633，1614，1512，1450cm-1)和紫外光谱(λmax 256，308nm)显示化合物6具有异戊烯基黄酮类化合物的典型的吸收特性。化合物6的氢谱显示了以下质子信号：苯环上间位耦合的两个氢质子δH 6.53(1H，d，J＝1.8Hz，H-8)和6.32(1H，d，J＝1.8Hz，H-6)；一个醌型质子δH 6.02(1H，s)；一个甲氧基δH 3.89(MeO-4′)；以-CH2-CH-C(CH3)＝CH2片段形式出现的一个部分环化的异戊烯基δH 4.79，4.59(each 1H，brs，H2-14)，3.84(1H，d，J＝8.4Hz，H-12)，3.42(1H，d，J＝16.8Hz，Ha-11)，2.63(1H，dd，J＝16.8，8.4Hz，Hb-11)和1.82(3H，s，H-15)。化合物6的1H-NMR谱与已知化合物artomunoxanthone非常相似，不同的是6的氢谱中没有出现artomunoxanthone在C-7/C-8位拼接的2，2-二甲基吡喃环的质子信号，而是多了一个芳香质子信号δH 6.53(1H，s，H-8)。这表明6的C-8位并不存在如artomunoxanthone那样的异戊烯基取代。这个结论在6的13C-NMR谱可以得到进一步解释：6的13C NMR和DEPT谱显示有21个碳信号，即3个羰基碳，10个sp2杂化的季碳(5个被氧化)，3个sp2杂化的次甲基碳，1个sp2杂化的亚甲基碳，1个sp3杂化的次甲基碳，1个sp3杂化的亚甲基碳，1个sp3杂化的甲基碳及1个甲氧基。除了个别碳(如C-3，5，8，1′和6′)外，6的13C-NMR谱的化学位移值与artomunoxanthone非常相似。通过HSQC和HMBC，我们归属了6的所有质子和碳原子的信号，并确定了各个取代基的连接位置，最终获得6的化学结构。化合物6为一个新的异戊烯基取代黄酮，我们命名为artoheteroid A。
其中，化合物7为一种橙色无定形粉末。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 395.0771([M-H]-，计算值：395.0772)，确定其分子式为C21H16O8。化合物7与6的UV，IR，和1H NMR谱非常相似，表明7也属于异戊烯基黄酮类化合物。7的13C NMR谱显示3个羰基碳信号δc 179.4，184.9和183.7，进一步证实7和6具有一样的醌型结构单元。比较6和7的13C NMR数据可见，7的碳谱化学位移值与6基本一致。仅有的差异在于C-1′和C-6′。7的C-1′和C-6′信号分别出现在δc 56.2和67.9，与6相比均有超过75ppm的高场位移。这种位移来自于醌环的进一步氧化形成的C-1′/C-6′位三元氧环的屏蔽效应。通过HSQC和HMBC谱，我们归属了7的所有质子和碳原子的信号，并确定了各个取代基的连接位置，最终获得7的化学结构。化合物7也是一个新的异戊烯基取代黄酮，我们将之命名为artoheteroid B。
表1 新异戊烯基黄酮artoheteroids A-B的氢谱和碳谱数据
实施例3 波罗蜜中异戊烯基黄酮对CatK的抑制活性实验
将40μL CatK(用0.1％Brii35稀释)加入96孔板。随后加入35μL含有待测化合物的缓冲溶液(含400mM NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液，88mM DTT和4mM EDTA，pH 6.8)，在25°条件下保温10分钟，使化合物与酶充分结合。然后将25μL底物Z-GPR-AMC(1％DMSO稀释)加入到混合物中开始反应。底物和CatK的最终浓度分别为5μM和5.6μM，每个孔的总体积为100μL。该反应体系在37℃条件下培养2h后，加入50μL反应终止液(含100mM CH3COOH-CH3COONa，100mM Cl3CCOONa，pH 4.3)到每个孔中。用Omega微孔分光光度计(BMG LABTECH，德国)在355nm激发光和460nm发射光下，检测反应体系中的AMC荧光信号强度。根据荧光值计算各个化合物的抑制率IP。测定多浓度的抑制率，采用新药数据统计处理软件(NDST-21世纪版)计算IC50值。
IP的计算公式为：
式中，F1为加入酶和样品后的本底值；F2为样品孔的荧光值，含样品、酶、底物和缓冲液；F3为只有缓冲液和底物的空白值；F4为酶的正常活性值，含酶、底物和缓冲液。
表2是本发明所述7个异戊烯基黄酮类化合物对CatK抑制活性实验结果(IC50 inμM)。
表2 波罗蜜中异戊烯基黄酮对CatK的抑制活性