通过静电纺丝制备载药细胞爬片的方法与流程

本发明属于生物医学领域用于细胞培养的细胞爬片的制备方法，特别涉及一种通过静电纺丝机制备载药细胞爬片的方法。

背景技术：

在进行生物学实验和细胞培养时，需要经常使用细胞爬片，细胞爬片是将盖玻片浸在细胞培养基中，使其在玻片上能够生长，细胞爬片根据实验需要有圆形和方形的，并且大小不同。利用细胞爬片进行体外实验的时候，可以很好的排除体内诸多的干扰因素对实验结果的影响，因此，制备细胞爬片是体外细胞培养的一种重要技术。

静电纺丝技术制备的纳米纤维膜结构类似于细胞外基质，其三维立体结构使得材料具有高比表面积，且便于制备，已被广泛应用于组织工程中。玉米醇溶蛋白(Zein)是从天然材料玉米蛋白粉中提取出来的，具有良好成膜性能，已经在药物释放领域有了深入的研究。申请号为201210084617.7的专利中，记载了用于细胞培养的载体材料，即玉米醇溶蛋白和聚乙烯醇静电纺出的纳米纤维膜的制备方法。

关于制备细胞爬片的方法，在申请号为201410141763.8的专利一文中，仅记载了一种直接将消毒后的爬片浸入到培养液内，而后放入培养板中，将细胞悬垂液加入进行培养的方法。申请号为201510175512.6的文献中，公开了一种对玻片表面进行处理的方法，但仍然没有任何载药细胞爬片的制备，从而适用不同细胞培养需求的记载。

因此，制备安全无毒、可降解的载药细胞爬片，成为亟待解决的课题。

技术实现要素：

本发明的目的是为解决目前存在的上述技术问题，提供一种通过静电纺丝制备载药细胞爬片的方法，这种方法可根据细胞培养过程中所需药量来控制载药量，简单易行，实用性强。

本发明通过静电纺丝制备载药细胞爬片的方法，包括如下步骤：

a.取普通盖玻片，用蒸馏水浸泡冲洗干净后，置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌备用，灭菌条件为121℃，20min；

b.称取玉米醇溶蛋白、聚乳酸，分别溶于六氟异丙醇中，配制成质量百分比浓度分别为14％和6％的壳层和核层纺丝溶液，并向壳核层溶液中分别加入设定量的地塞米松(DEX)和重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP-2)，磁力搅拌4h备用；

c.用步骤b制得的纺丝溶液在静电纺丝机上纺丝，纺丝电压为15KV，纺丝速度壳核层分别为0.8ml/h和0.6ml/h，纺丝距离为12cm，当纺丝层达到设定厚度后，将步骤a所述的灭菌盖玻片放置在该纺丝层上，再继续纺丝至设定厚度，纺丝结束；

d.纺丝结束，将步骤c获得的纺丝物从静电纺丝机的接收装置取下，切割整形后放入真空干燥箱干燥后即获得以盖玻片为基板，其外围包裹有同轴壳核层纤维膜的载药细胞爬片。

步骤b中所述加入的DEX为壳层纺丝溶液中玉米醇溶蛋白质量的5％，加入的rhBMP-2为核层纺丝溶液中聚乳酸质量的0.012％～0.03％。根据细胞实验需求可选取其它药物种类和质量。

本发明采用的盖玻片直径为13mm，制备出的细胞爬片直径为14mm。

本发明与现有技术相比具有如下有益效果：

本发明所采用的药物载体材料为生物相容性良好的天然蛋白类物质，以及高分子材料聚乳酸，安全无毒可体内降解，利用静电纺丝的方法制备出的覆盖普通盖玻片的载药纳米纤维膜具有三维多孔结构，有利于细胞培养时细胞的粘附、生长和增殖。且这种细胞爬片解决了将盖玻片置于培养皿底部被夹持时出现的不稳定，如倾覆和侧翻等现象，针对不同细胞培养有效提高了实验效果。

附图说明

图1是实施例1中所制备的细胞爬片的实物照片；

图2是实施例1中所述细胞爬片的微观扫描电镜图；

图3是应用实施例1中细胞培养一周的电镜图；

图4是应用实施例3中细胞培养一周的电镜图；

图5是应用实施例4中细胞培养一周的电镜图；

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，但这些实施例仅用于对本发明进行解释说明，并不限制本发明的范围。

实施例1

(1)取普通盖玻片21个，蒸馏水浸泡冲洗后，进行高压蒸汽灭菌；

(2)分别称取玉米醇溶蛋白0.2598g，聚乳酸0.1019g，并分别溶于1ml六氟异丙醇(25℃，密度为1.596g/ml)中，作为壳层和核层溶液，并在核层溶液中加入100μl含有12μg的rhBMP-2水溶液(含有1％BSA的无菌水，用来稳定rhBMP-2，保证其活性)，室温下磁力搅拌4h；

(3)进行静电纺丝前对静电纺丝装置进行紫外灭菌2h，纺丝过程中开启紫外灯，减少纺丝过程中的污染；

(4)调节静电纺丝工艺参数分别为：纺丝电压为15KV，纺丝距离为12cm，纺丝速率壳层和核层分别为0.8ml/h和0.6ml/h；

(5)静电纺丝20min后，将步骤(1)所述的盖玻片固定在已纺得的纳米纤维膜上,再继续纺丝40min后结束；

(6)从接收装置上取下纺丝物，切割整形后在温度为37℃，真空度为0.09MPa的真空干燥箱内干燥一周，即获得以盖玻片为基板，其外围包裹有同轴壳核层纤维膜的载药细胞爬片。所制细胞爬片外观照片如图1所示，微观扫描电镜图如图2所示。

实施例2

(1)取普通盖玻片21个，蒸馏水浸泡冲洗后，进行高压蒸汽灭菌；

(2)分别称取玉米醇溶蛋白0.2598g，聚乳酸0.1019g，并分别溶于1ml六氟异丙醇(25℃，密度为1.596g/ml)中，作为壳层和核层溶液，并在核层溶液中加入100μl含有30μg的rhBMP-2的水溶液，室温下磁力搅拌4h；

(3)进行静电纺丝前对静电纺丝装置进行紫外灭菌2h，纺丝过程中开启紫外灯，减少纺丝过程中的污染；

(4)调节静电纺丝工艺参数分别为：纺丝电压为15KV，纺丝距离为12cm，纺丝速率壳层和核层分别为0.8ml/h和0.6ml/h；

(5)静电纺丝20min后，将步骤(1)所述的盖玻片固定在已纺得的纳米纤维膜上,再继续纺丝40min后结束；

(6)从接收装置上取下纺丝物，切割整形后在温度为37℃，真空度为0.09MPa的真空干燥箱内干燥一周，即获得以盖玻片为基板，其外围包裹有同轴壳核层纤维膜的载药细胞爬片。

实施例3

(1)取普通盖玻片21个，蒸馏水浸泡冲洗后，进行高压蒸汽灭菌；

(2)分别称取玉米醇溶蛋白0.2598g，聚乳酸0.1019g，并分别溶于1ml六氟异丙醇(25℃，密度为1.596g/ml)中，作为壳层和核层溶液，并在壳层溶液中加入玉米醇溶蛋白质量的5％的DEX，室温下磁力搅拌4h；

(3)进行静电纺丝前对静电纺丝装置进行紫外灭菌2h，纺丝过程中开启紫外灯，减少纺丝过程中的污染；

(4)调节静电纺丝工艺参数分别为：纺丝电压为15KV，纺丝距离为12cm，纺丝速率壳层和核层分别为0.8ml/h和0.6ml/h；

(5)静电纺丝20min后，将步骤(1)所述的盖玻片固定在已纺得的纳米纤维膜上,再继续纺丝40min后结束；

(6)从接收装置上取下纺丝物，切割整形后在温度为37℃，真空度为0.09MPa的真空干燥箱内干燥一周，即获得以盖玻片为基板，其外围包裹有同轴壳核层纤维膜的载药细胞爬片。

实施例4

(1)取普通盖玻片21个，蒸馏水浸泡冲洗后，进行高压蒸汽灭菌；

(2)分别称取玉米醇溶蛋白0.2598g，聚乳酸0.1019g，并分别溶于1ml六氟异丙醇(25℃，密度为1.596g/ml)中，作为壳层和核层溶液，并在壳层溶液中加入玉米醇溶蛋白质量的5％的地塞米松(DEX)，核层溶液中加入100μl含有30μg的rhBMP-2的水溶液，室温下磁力搅拌4h；

(3)进行静电纺丝前对静电纺丝装置进行紫外灭菌2h，纺丝过程中开启紫外灯，减少纺丝过程中的污染；

(4)调节静电纺丝工艺参数分别为：纺丝电压为15KV，纺丝距离为12cm，纺丝速率壳层和核层分别为0.8ml/h和0.6ml/h；

(5)静电纺丝20min后，将步骤(1)所述的盖玻片固定在已纺得的纳米纤维膜上,再继续纺丝40min后结束；

(6)从接收装置上取下纺丝物，切割整形后在温度为37℃，真空度为0.09MPa的真空干燥箱内干燥一周，即获得以盖玻片为基板，其外围包裹有同轴壳核层纤维膜的载药细胞爬片。

应用实施例

对细胞爬片上的大鼠骨髓间充质干细胞进行培养。

1.原料：大鼠骨髓间充质干细胞、实施例1、3、4中所得的细胞爬片

2.方法：分别取实施例1、3、4中的细胞爬片，放入紫外光下照射2h消毒，然后在无菌的条件下放置在24孔的细胞培养板中，悬垂滴入1ml的细胞培养液，将细胞密度为2×10⁴个/ml的大鼠骨髓间充质干细胞植入孔板内进行细胞培养。经过一周细胞培养后，用戊二醛固定，并用乙醇梯度脱水干燥之后，使用扫描电子显微镜观察细胞爬片上大鼠骨髓间充质干细胞的生长状态。

3.结果：图3显示为大鼠骨髓间充质干细胞在实施例1制得的细胞爬片上的生长一周的形态，观察可得，细胞在细胞爬片的纳米纤维膜上粘附，细胞长势良好，呈长梭形、圆球形、扁平型等多种形态，证明其细胞培养效果优良。

图4显示为对实施例3中的细胞爬片进行大鼠骨髓间充质干细胞的培养，观察生长一周后的形态可得，细胞粘附在盖玻片周围的纤维膜上，细胞部分呈长梭形，部分扁平型，证明载入的药物起到了促进细胞生长的优良结果。

图5显示为大鼠骨髓间充质干细胞在实施例4制得的细胞爬片上生长一周的形态，观察可得，细胞在纳米纤维膜上粘附，长势良好，多呈现扁平型，证明载入的DEX和rhBMP-2对细胞产生了作用。