用于检测雌激素化合物的重组酵母及其构建方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及用于检测雌激素化合物的重组酵母及其构建方法。

背景技术：

雌激素类化合物是指所有具有雌激素活性的化合物，是一类重要的环境内分泌干扰物，种类繁多，结构多样。环境中的雌激素通过污染水、土壤、空气而进入生物链，在生物链富集、放大，通过饲料、饮水、空气等途径在畜禽体内富集、放大，危害家畜的生产繁殖性能以及危害动物性食品安全。该类化合物可与下丘脑、垂体、子宫等脏器的雌激素受体结合，对生殖发育过程、内分泌系统、癌症发生机制产生不利的影响，也威胁到生物种族的存亡。

随着人们对环境内分泌干扰物危害作用的认识不断深入，控制、防治内分泌干扰物对人群健康的影响己成为当务之急，而准确地甄别、评价内分泌干扰物是首先需要解决的关键问题之一。目前己建立的环境雌激素干扰物的检测方法主要有：体内试验方法(包括子宫增重试验、阴道细胞角化试验)和体外试验方法(包括受体竞争结合试验、细胞增殖试验、雌激素调控内源性基因的表达、受体转录激活试验)。从目前已建立的体外、体内检测方法来看，由于外源性化学物在体内产生内分泌干扰效应的机制十分复杂，涉及诸多环节，因此整体动物试验具有相对的准确性和权威性，但同时往往操作过程复杂、费时费力，不适用于高通量筛选以及现场应用，并且现有的检测方法大多数敏感性较低而特异性偏高，因此建立快速、简便、经济、可靠，并可实现高通量筛选的体外检测系统是目前该领域研究和发展的主要方向之一。

体外雌激素受体转录激活试验是近年来建立的一种测评方法。研究表明雌激素与雌激素受体(ER)在细胞核结合形成二聚体，增强雌激素受体与靶基因启动子区域中作为顺式调控元件的雌激素效应元件ERE特异性结合能力，二聚化的雌激素受体复合物再结合位于目标基因启动子的雌激素效应元件(EREs)，激活靶基因的转录表达，从而发挥作用。

该方法根据上述的激素在受体介导下调控靶基因转录表达的作用机制，构建能够表达雌激素受体、并带有雌激素反应元件及其所调控的报告基因的酵母或哺乳动物细胞系统，通过检测报告基因的表达水平评估受试物的雌激素样作用的强弱。宿主细胞可以选用酵母或哺乳动物细胞，酵母系统的优点是酵母本身不具有内源性类固醇激素及激素受体系统，且培养基中也无需加入血清，因此排除了内源性激素的干扰作用；酵母表达产物与天然蛋白有极为相似的生物活性；并且酵母所表达的激素受体是人为转化到细胞中的，因此排除了体内受体基因突变可能对结果产生的影响。但是，目前已构建的重组酵母细胞检测体系对雌激素类化合物的敏感性偏低。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种重组菌。

本发明提供的重组菌，为在酵母中表达雌激素受体β基因和含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒，得到的重组菌。

所述含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒依次包括所述3个串联ERE基因、驱动报告基因表达的启动子和所述报告基因。

上述重组菌中，所述重组菌中还表达抗性基因表达盒；

所述3个串联ERE基因的核苷酸为序列表中序列4第1815‐1853位；

或，所述驱动报告基因表达的启动子为部分ADH1；

所述部分ADH1的核苷酸序列为序列4第1860‐2269位。

上述重组菌中，所述在酵母中表达雌激素受体β基因为将所述雌激素受体β基因以重组载体的方式导入所述酵母中进行表达；

或，所述在酵母中表达雌激素受体β基因、抗性筛选基因表达盒和含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒为将同源重组片段整合到所述酵母基因组中进行表达；

所述同源重组片段包括所述抗性筛选基因表达盒和所述含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒的片段。

上述重组菌中，所述重组载体为将所述雌激素受体β基因插入表达载体中，且表达所述雌激素受体β基因的载体；

所述重组载体中，驱动所述雌激素受体β基因表达的启动子为序列表中序列2或序列4所示的DNA分子；

或所述整合均采用基因组定点编辑或同源重组的方式进行；

或所述基因组定点编辑具体为ZFN编辑、TALEN编辑或CRISPR/Cas9编辑；

或所述同源重组具体为λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或整合质粒介导的同源重组。

上述重组菌中，所述雌激素受体β基因的核苷酸序列为序列1第7-1599位；

或所述抗性筛选基因表达盒的抗性筛选基因为卡那霉素抗性基因；

或所述抗性筛选基因表达盒的核苷酸序列为序列4第540‐1853位；

或所述含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒的报告基因为GFP基因，所述含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒的核苷酸序列为序列4第1815‐3242位；

或所述表达载体为p426GDP载体或p416GDP载体；

或所述同源重组片段的核苷酸序列为序列4第33‐3748位；

或所述同源重组片段通过整合质粒介导的同源重组整合；

或所述整合质粒的核苷酸序列为序列4；

或所述酵母为酿酒酵母。

本发明另一个目的是提供一种构建重组菌的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将雌激素受体β基因和含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒导入所述酵母，得到重组菌。

上述方法中，所述方法还包括将抗性筛选基因表达盒导入所述酵母；

或，所述雌激素受体β基因以重组载体的方式导入所述酵母中进行表达；

或，所述抗性筛选基因表达盒和所述含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒通过同源重组片段整合到所述酵母基因组中进行表达；所述同源重组片段包括抗性筛选基因表达盒和所述含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒。

上述方法中，所述重组载体为将所述雌激素受体β基因插入表达载体中，且表达所述雌激素受体β基因的载体；

所述重组载体中，驱动所述雌激素受体β基因表达的启动子为序列表中序列2或序列4所示的DNA分子；

或所述整合均采用基因组定点编辑或同源重组的方式进行；

或所述基因组定点编辑具体为ZFN编辑、TALEN编辑或CRISPR/Cas9编辑；

或所述同源重组具体为λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或整合质粒介导的同源重组。

上述方法中，所述雌激素受体β基因的核苷酸序列为序列1第7-1599位；

或所述抗性筛选基因表达盒的抗性筛选基因为卡那霉素抗性基因；

或所述抗性筛选基因表达盒的核苷酸序列为序列4第540‐1853位；

或所述含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒的报告基因为GFP基因，所述含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒的核苷酸序列为序列4第1815‐3242位；

或所述表达载体为p426GDP载体或p416GDP载体；

或所述同源重组片段的核苷酸序列为序列4第33‐3748位；

或所述同源重组片段通过整合质粒介导的同源重组整合；

或所述整合质粒的核苷酸序列为序列4；

或所述酵母为酿酒酵母。

上述重组菌在检测雌激素化合物中的应用也是本发明保护的范围；

或上述重组菌在制备检测雌激素化合物产品中的应用也是本发明保护的范围。

本发明第三个目的是提供检测雌激素化合物产品。

本发明的产品，包括上述重组菌。

上述酿酒酵母为BY4742。

上述雌激素化合物为17‐β雌二醇、17‐a雌二醇或4‐羟基雌二醇。

本发明利用合成生物学和代谢工程手段将抗性基因表达盒、3个串联的ERE和启动子为ADH的GFP基因表达盒整合到酵母宿主染色体中，然后再转入含有雌激素受体表达载体，获得重组酵母。结果显示，重组酵母在雌激素类化合物存在时，可稳定高效合成GFP，GFP的表达量与雌激素类化合物的浓度呈正比，17β雌二醇的EC₅₀为3.25pM，比现有文献报道提高约20倍。本发明为快速、灵敏地检测环境中雌激素类化合物奠定基础。

附图说明

图1为表达ERβ的不同载体得到的重组菌在检测雌激素化合物的效果比较。

图2为p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)检测不同浓度的不同雌激素化合物的效果比较。

图3为p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)在检测雌激素的稳定性测定结果。

图4为不同GFP启动子构建的重组菌在检测雌激素化合物的效果比较。

图5为不同个数ERE构建的重组菌在检测雌激素化合物的效果比较。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、构建用于检测雌激素化合物的重组酵母

雌激素的生物学效应大致受到三种雌激素受体的调节，即雌激素受体α(ERα)、雌激素受体β(ERβ)、G蛋白偶联的雌激素受体(GPER)。经典的雌激素受体ERα、ERβ大部分存在于细胞核，在细胞内作为配基激活的转录因子。这两种受体发挥作用的方式主要通过经典调节途径，即雌激素与雌激素受体(ER)在细胞核结合形成二聚体，再结合位于目标基因启动子的雌激素反应元件(EREs)，从而发挥作用。其中雌激素受体ERβ比ERα对大部分雌激素类化合物反应比较敏感，因此选用ERβ作为雌激素检测系统中的雌激素受体。

为了增强雌激素经典调控途径的灵敏度，本发明的发明人选用3个串联雌激素反应元件(EREs)及缺失ADH启动子。绿色荧光蛋白(GFP)对细胞无毒无害，是生物标记中常用的信号，因此选用GFP为雌激素检测系统的报告基因。

一、重组表达载体p416GDP‐ERβ和p426GDP‐ERβ的构建

载体p416GDP与p426GDP启动子一样，但是质粒拷贝数不同，在宿主中p416GDP为低拷贝，p426GDP为高拷贝。

1、重组表达载体p416GDP‐ERβ的构建

(1)以在金斯瑞公司进行合成序列1所示的核苷酸为模板，采用引物ERβ‐Fwd(SpeI)和ERβ‐Rev(SalI)进行PCR扩增，将所得PCR产物采用限制性内切酶SpeI和SalI进行双酶切。

ERβ‐Fwd(SpeI)：5’‐GCGCGCACTAGTATGGATATTAAAAATTCTCCATC‐3’(下划线部分为SpeI的识别序列)；

ERβ‐Rev(Sall)：5’‐GCGCGCGTCGACTTATTGTGATTGTGGATTTTG‐3’(下划线部分为SalI的识别序列)。

(2)采用限制性内切酶SpeI和SalI双酶切p416GDP载体(87360^TM)。

(3)将步骤(1)所得酶切产物与步骤(2)所得的p416GDP载体载体骨架大片段进行连接，得到重组质粒，将经测序验证正确的质粒命名为p416GDP‐ERβ。

重组表达载体p416GDP‐ERβ的结构描述如下：将p416GDP载体的酶切位点SpeI和SalI之间的小片段替换为序列表中序列1的第7‐1599位所示的人源雌激素受体β(ERβ)基因后得到的重组质粒。

在重组表达载体p416GDP‐ERβ中，启动人源雌激素受体β(ERβ)基因转录的启动子为强启动子GDP启动子，其序列具体如序列表中序列2所示；终止人源雌激素受体β(ERβ)基因转录的终止子为CYC1终止子，其序列具体如序列表中序列3所示。

2、重组表达载体p426GDP‐ERβ的构建

(1)以质粒p416GDP‐ERβ模板，采用引物ERβ‐Fwd(SpeI)和ERβ‐Rev(SalI)进行PCR扩增，将所得PCR产物采用限制性内切酶SpeI和SalI进行双酶切。

ERβ‐Fwd(SpeI)：5’‐GCGCGCactagtatggatattaaaaattctccatc‐3’(下划线部分为SpeI的识别序列)；

ERβ‐Rev(Sall)：5’‐GCGCGCGTCGACTTATTGTGATTGTGGATTTTG‐3’(下划线部分为SalI的识别序列)。

(2)采用限制性内切酶SpeI和SalI双酶切p426GDP载体(87361^TM)。

(3)将步骤(1)所得酶切产物与步骤(2)所得的p426GDP载体载体骨架大片段进行连接，得到重组质粒，将经测序验证正确的质粒命名为p426GDP‐ERβ。

重组表达载体p426GDP‐ERβ的结构描述如下：将p426GDP载体的酶切位点SpeI和SalI之间的小片段替换为序列表中序列1的第7‐1599位所示的人源雌激素受体β(ERβ)基因后得到的重组质粒。

在重组表达载体p426GDP‐ERβ中，启动人源雌激素受体β(ERβ)基因转录的启动子为强启动子GDP启动子，其序列具体如序列表中序列2所示；终止人源雌激素受体β(ERβ)基因转录的终止子为CYC1终止子，其序列具体如序列表中序列3所示。

二、重组表达载体pETM6‐rDNA‐GFP的构建

重组表达载体pETM6‐rDNA‐GFP的核苷酸序列为序列4，该载体包括同源重组片段，该同源重组片段的核苷酸序列为序列4第33‐3748位；该片段包括KanMx表达盒和含有3个串联ERE的GFP表达盒；该片段各组成的序列如下：序列4第33‐533位为上游rDNA，序列4第540‐1794为KanMx表达盒(序列4第540‐748位为KanMx的启动子TRP1、序列4第位为KanMx、序列4第1560‐1794位为KanMx的终止子TEF1)，序列第1815‐3242位为含有3个串联ERE的GFP表达盒(序列4第1815‐1853位为3个串联的ERE，序列4第1860‐2269位为GFP的启动子部分ADH1、序列4第2270‐2983位为GFP、序列4第2990‐3242位为GFP的终止子CYC1)，序列4第3248‐3748位为下游rDNA。

其构建方法如下：

重组表达载体pETM6-rDNA-GFP为将序列4第33-3748位所示的同源重组片段插入pETM6载体(该载体记载在如下文献中：Xu,P.,Vansiri,A.,Bhan,N.,&Koffas,M.A.(2012).ePathBrick:a synthetic biology platform for engineERing metabolic pathways in E.coli.ACS Synth Biol,1(7),256-266.doi:10.1021/sb300016b)的XbaI和SalI酶切位点间得到的载体。

三、重组酵母的构建

选用酿酒酵母BY4742(记载在如下文献中：PLoS One.2014Dec 17；9(12):e113869.doi:10.1371/journal.pone.0113869.eCollection 2014.Formation of hydrogen sulfide from cysteine in Saccharomyces cERevisiae BY4742:genome wide screen reveals a central role of the vacuole.)作为待转化的受体酵母细胞。

1、将上述二制备的重组表达载体pETM6-rDNA-GFP转化受体酵母细胞BY4742的感受态细胞，挑选能在含有200μg/mL的G418的YPD固体培养基平板上生长的菌落，使其在上述培养基平板上连续转接三代，能在含有G418平板上那个生长的酵母中必含有整合序列，得到遗传稳定的重组子gDNA(ERE‐ADH‐GFP)。

其中，YPD液体培养基：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖10g/L，溶于双蒸水中，pH调至6.5，高压灭菌。YPD固体培养基：在YPD液体培养基中加入2％(2g/100ml)琼脂粉，高压灭菌。

2、将上述一制备的重组表达载体p416GDP‐ERβ和p426GDP‐ERβ分别转化步骤1得到的gDNA(ERE‐ADH‐GFP)，挑选能在含有200μg/mL的G418的SD/‐Ura固体培养基平板上生长的菌落，使其在上述培养基平板上连续转接三代，得到遗传稳定的重组酵母p416GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)和p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)。

其中，SD/‐Ura固体培养基：无氨基酸酵母氮源6.7g/L，葡萄糖20g/L，CSM‐Ura0.76g/L，溶于双蒸水中，pH调至6.5，2％(2g/100ml)琼脂粉，高压灭菌。

经过测序验证，

重组酵母p416GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)为将p416GDP‐ERβ质粒导入酿酒酵母BY4742，且将序列4第33‐3748位所示同源重组片段整合到酿酒酵母BY4742的基因组的rDNA处得到的菌。

重组酵母p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)为将p426GDP‐ERβ质粒导入酿酒酵母BY4742，且将序列4第33‐3748位所示同源重组片段整合到酿酒酵母BY4742的基因组的rDNA处得到的菌。

构建重组酵母gDNA(ERE‐ADH‐GFP)，其为将序列4第33‐3748位所示同源重组片段整合到酿酒酵母BY4742的基因组的rDNA处得到的菌。

实施例2、重组酵母在检测雌激素化合物中的应用

一、对不同菌株对雌激素类化合物的检测效果

培养实施例1得到的重组酵母p416GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)和p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)，在培养体系中加入雌激素类化合物(17‐β雌二醇)，使其终浓度为5nM。震荡4hr后，用酶标仪(infiniteM200PRO)测定荧光强度(激发波长485nm，发射波长525nm)。每个样品重复3次。以不加入雌激素类化合物(17‐β雌二醇)为对照。

结果如图1所示，由图可见，与重组酵母p416GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)相比，重组菌p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)的荧光强度较高，表明该菌作为检测雌激素化合物的效果较好。

二、对不同浓度的各种雌激素类化合物的检测效果

培养重组酵母p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)，在培养体系中加入不同终浓度的雌激素类化合物(17‐β雌二醇、17‐a雌二醇、4‐羟基雌二醇)，震荡4hr后，用酶标仪(infiniteM200PRO)测定荧光强度(激发波长485nm，发射波长525nm)。每个样品重复3次。

结果如图2所示，由图可见，荧光强度与雌激素类化合物存在较明显的剂量关系，在所测三种雌激素类化合物中重组酵母p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)对17‐β雌二醇最为灵敏，通过软件Origin 8.0拟合得到对17‐β雌二醇的EC₅₀为3.25pm。

三、测定雌激素检测系统随时间的稳定性

为了测定重组酵母细胞p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)随时间的稳定性，培养该菌，在培养体系中加入不同浓度17‐β雌二醇，震荡不同时间(2、4、25、48、72hr)，用酶标仪(infiniteM200PRO)测定荧光强度(激发波长485nm，发射波长525nm)。每个样品重复3次。

结果如图3所示，由图可见，震荡4小时荧光强度最高，且在48小时内，荧光稳定性较好。

对比例1、不同GFP启动子的重组酵母菌构建及其检测雌二醇的效果

ERβ对启动子的激活活性具有特异性，为此测试了不同的启动子，如部分CYC1,部分TRP1,部分GAL1，实验中发现在相同条件下ERβ对部分ADH1启动子激活能力最强，GFP表达量最高，因此ERβ对部分ADH1启动子序列具有最强的特异性。

一、不同GFP启动子的重组酵母菌的构建

重组酵母p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)为将p426GDP‐ERβ质粒导入酿酒酵母BY4742，且将序列4第33‐3748位所示同源重组片段整合到酿酒酵母BY4742的基因组的rDNA处得到的菌。

重组酵母p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐CYC‐GFP)为将p416GDP‐ERβ质粒导入酿酒酵母BY4742，且将序列A所示片段A整合到酿酒酵母BY4742的基因组的rDNA处得到的菌；

序列A为将序列4第1860‐2269位的GFP启动子部分ADH1替换为序列5部分CYC1启动子，序列4其余核苷酸序列不变。

重组酵母p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐GAL‐GFP)为将p426GDP‐ERβ质粒导入酿酒酵母BY4742，且将序列B所示片段B整合到酿酒酵母BY4742的基因组的rDNA处得到的菌；

序列B为将序列4第1860‐2269位的GFP启动子部分ADH1替换为序列6部分GAL1启动子，序列4其余核苷酸序列不变。

重组酵母p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐TRP‐GFP)为将p416GDP‐ERβ质粒导入酿酒酵母BY4742，且将序列C所示片段C整合到酿酒酵母BY4742的基因组的rDNA处得到的菌。

序列C为将序列4第1860‐2269位的GFP启动子部分ADH1替换为序列7部分TRP启动子，序列4其余核苷酸序列不变。

二、重组酵母菌在检测雌激素化合物中的应用

将上述一构建的重组菌按照实施例2的二所示的方法，以不加入雌激素类化合物(17‐β雌二醇)为对照。

结果如图4所示，可以看出，GFP启动子为部分ADH1的重组酵母p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)高于其它菌株，为最优启动子。

对比例2、不同个数ERE的对照

片段D的核苷酸序列为序列D，序列D为将序列4第1815‐1853位的3个串联的ERE序列替换为序列8(两个保守的ERE序列)，序列4其余核苷酸序列不变。

重组酵母p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE2‐GAL‐GFP)为将p426GDP‐ERβ质粒导入酿酒酵母BY4742，且将序列D所示片段D整合到酿酒酵母BY4742的基因组的rDNA处得到的菌；

将上述一构建的重组菌按照实施例2的二所示的方法，以不加入雌激素类化合物(17‐β雌二醇)为对照。

结果如图5所示，可以看出，3个串联的ERE序列的重组酵母p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)高于2个串联的ERE序列的重组酵母p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)，为最适的ERE序列。

序列表

<110> 中国农业科学院研究生院

<120>用于检测雌激素化合物的重组酵母及其构建方法

<160> 8

<170> PatentIn vERsion 3.5

<210> 1

<211> 1605

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

actagtatgg atattaaaaa ttctccatct tctttaaatt ctccatcttc atacaactgt 60

tctcaatcaa tcttgccatt agaacatggt tctatctata ttccatcttc atacgttgat 120

tcacatcatg aatatccagc tatgactttt tactctccag cagttatgaa ctactctatc 180

ccatcaaacg ttacaaattt ggaaggtggt ccaggtagac aaactacatc accaaatgtt 240

ttatggccaa ctccaggtca tttgtctcca ttagttgttc atagacaatt gtcacatttg 300

tatgctgaac cacaaaaatc tccatggtgt gaagcaagat cattggaaca tactttgcca 360

gttaacagag aaacattgaa gagaaaagtt tctggtaaca gatgtgcttc accagttaca 420

ggtccaggtt ctaaaagaga tgctcatttt tgtgcagttt gttctgatta tgcttcaggt 480

tatcattacg gtgtttggtc ttgtgaaggt tgtaaagcat ttttcaagag atcaatccaa 540

ggtcataatg attacatttg tccagctact aatcaatgta caatcgataa gaacagaaga 600

aagtcttgtc aagcatgtag attaagaaag tgttacgaag ttggtatggt taaatgtggt 660

tcaagaagag aaagatgtgg ttacagattg gttagaagac aaagatcagc tgatgaacaa 720

ttacattgtg ctggtaaagc aaaaagatca ggtggtcatg ctccaagagt tagagaattg 780

ttattggatg cattgtctcc agaacaattg gttttaacat tattggaagc tgaaccacca 840

catgttttga tttcaagacc atcagctcct tttactgaag catctatgat gatgtcattg 900

acaaaattag ctgataagga attggttcac atgatttctt gggctaagaa aattccaggt 960

ttcgttgaat tgtctttatt cgatcaagtt agattattgg aatcatgttg gatggaagtt 1020

ttgatgatgg gtttaatgtg gagatcaatc gatcatcctg gtaaattgat cttcgctcca 1080

gatttggttt tagatagaga tgagggtaaa tgtgttgaag gtattttaga aatttttgat 1140

atgttattgg ctactacttc aagattcaga gaattgaaat tgcaacataa ggaatatttg 1200

tgtgttaagg caatgatctt gttaaattct tctatgtacc cattagttac tgctacacaa 1260

gatgcagatt cttcaagaaa attggctcat ttgttgaatg ctgttactga tgcattagtt 1320

tgggttattg caaaatctgg tatttcttca caacaacaat caatgagatt agctaatttg 1380

ttgatgttgt tgtctcatgt tagacatgca tcaaataagg gtatggaaca tttgttgaac 1440

atgaagtgta agaacgttgt tccagtttac gatttgttgt tagaaatgtt gaacgctcat 1500

gttttgagag gttgtaagtc ttcaatcaca ggttctgaat gttcaccagc agaagattct 1560

aagtcaaagg aaggttctca aaatccacaa tcacaataag tcgac 1605

<210> 2

<211> 655

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

agtttatcat tatcaatact cgccatttca aagaatacgt aaataattaa tagtagtgat 60

tttcctaact ttatttagtc aaaaaattag ccttttaatt ctgctgtaac ccgtacatgc 120

ccaaaatagg gggcgggtta cacagaatat ataacatcgt aggtgtctgg gtgaacagtt 180

tattcctggc atccactaaa tataatggag cccgcttttt aagctggcat ccagaaaaaa 240

aaagaatccc agcaccaaaa tattgttttc ttcaccaacc atcagttcat aggtccattc 300

tcttagcgca actacagaga acaggggcac aaacaggcaa aaaacgggca caacctcaat 360

ggagtgatgc aacctgcctg gagtaaatga tgacacaagg caattgaccc acgcatgtat 420

ctatctcatt ttcttacacc ttctattacc ttctgctctc tctgatttgg aaaaagctga 480

aaaaaaaggt tgaaaccagt tccctgaaat tattccccta cttgactaat aagtatataa 540

agacggtagg tattgattgt aattctgtaa atctatttct taaacttctt aaattctact 600

tttatagtta gtcttttttt tagttttaaa acaccagaac ttagtttcga cggat 655

<210> 3

<211> 252

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc ccccacatcc gctctaaccg 60

aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt atagttatgt 120

tagtattaag aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt 180

acgcatgtaa cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt 240

taatttgcgg cc 252

<210> 4

<211> 8654

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaagtac ctcccaacta cttttcctca 60

cacttgtact ccatgactaa accccccctc ccattacaaa ctaaaatctt acttttattt 120

tcttttgccc tctctgtcgc tctgccttaa ctacgtattt ctcgccgaga aaaacttcaa 180

tttaagctat tctccaaaaa tcttagcgta tatttttttt ccaaagtgac aggtgccccg 240

ggtaacccag ttcctcacta ttttttactg cggaagcgga agcggaaaat acggaaacgc 300

gcgggaacat acaaaacata caaaatatac ctttctcaca caagaaatat atgctacttg 360

caaaatatca taccaaaaaa cttttcacaa ccgaaaccaa aaccaacgga tatcatacat 420

tacactacca ccattcaaac tttactacta tcctcccttc agtttccctt tttctgcctt 480

tttcggtgac ggaaatacgc ttcagagacc ctaaagggaa atccatgcca taacctagga 540

cagttatgac gccagatggc agtagtggaa gatattcttt attgaaaaat agcttgtcac 600

cttacgtaca atcttgatcc ggagcttttc tttttttgcc gattaagaat tcggtcgaaa 660

aaagaaaagg agagggccaa gagggagggc attggtgact attgagcacg tgagtatacg 720

tgattaagca cacaaaggca gcttggagta tgggtaagga aaagactcac gtttcgaggc 780

cgcgattaaa ttccaacatg gatgctgatt tatatgggta taaatgggct cgagataatg 840

tcgggcaatc aggtgcgaca atctatcgat tgtatgggaa gcccgatgcg ccagagttgt 900

ttctgaaaca tggcaaaggt agcgttgcca atgatgttac agatgagatg gtcagactaa 960

actggctgac ggaatttatg cctcttccga ccatcaagca ttttatccgt actcctgatg 1020

atgcatggtt actcaccact gcgatccccg gcaaaacagc attccaggta ttagaagaat 1080

atcctgattc aggtgaaaat attgttgatg cgctggcagt gttcctgcgc cggttgcatt 1140

cgattcctgt ttgtaattgt ccttttaaca gcgatcgcgt atttcgtctc gctcaggcgc 1200

aatcacgaat gaataacggt ttggttgatg cgagtgattt tgatgacgag cgtaatggct 1260

ggcctgttga acaagtctgg aaagaaatgc ataagctttt gccattctca ccggattcag 1320

tcgtcactca tggtgatttc tcacttgata accttatttt tgacgagggg aaattaatag 1380

gttgtattga tgttggacga gtcggaatcg cagaccgata ccaggatctt gccatcctat 1440

ggaactgcct cggtgagttt tctccttcat tacagaaacg gctttttcaa aaatatggta 1500

ttgataatcc tgatatgaat aaattgcagt ttcatttgat gctcgatgag tttttctaat 1560

cagtactgac aataaaaaga ttcttgtttt caagaacttg tcatttgtat agttttttta 1620

tattgtagtt gttctatttt aatcaaatgt tagcgtgatt tatatttttt ttcgcctcga 1680

catcatctgc ccagatgcga agttaagtgc gcagaaagta atatcatgcg tcaatcgtat 1740

gtgaatgctg gtcgctatac tgctgtcgat tcgatactaa cgccgccatc cagtgctagg 1800

ttgcggccga attcggtcac agtgaccggt cacagtgacc ggtcacagtg accgctagcg 1860

caacttcttt tctttttttt tcttttctct ctcccccgtt gttgtctcac catatccgca 1920

atgacaaaaa aatgatggaa gacactaaag gaaaaaatta acgacaaaga cagcaccaac 1980

agatgtcgtt gttccagagc tgatgagggg tatctcgaag cacacgaaac tttttccttc 2040

cttcattcac gcacactact ctctaatgag caacggtata cggccttcct tccagttact 2100

tgaatttgaa ataaaaaaaa gtttgctgtc ttgctatcaa gtataaatag acctgcaatt 2160

attaatcttt tgtttcctcg tcattgttct cgttcccttt cttccttgtt tctttttctg 2220

cacaatattt caagctatac caagcataca atcaactatc tcatatacaa tgaccgccct 2280

gacagaaggc gccaaattgt ttgagaaaga gatcccatat atcactgaat tggaaggtga 2340

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tattaaagct aaatacatct gtaccacagg tgacttgcca gtgccatggg ccactttggt 2460

ttctactttg tcttacggcg tccaatgctt cgcaaagtac ccatctcaca tcaaggattt 2520

ctttaagtct gcaatgccag aaggctatac tcaggagagg actatctctt tcgaaggtga 2580

cggtgtttac aagacaaggg cgatggtcac ttacgaaaga ggcagcatct acaacagggt 2640

gacattgacc ggcgagaatt ttaagaaaga cggccacatt ttgaggaaga atgtcgcctt 2700

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cgagttcaat caagcttacg atattgaagg cgttactgaa aaattggtca ctaaatgttc 2820

tcagatgaac aggccactgg ctggtagtgc tgccgttcat atcccaaggt atcatcacat 2880

tacttaccac actaaattgt ctaaagacag agacgagaga agggatcaca tgtgcttggt 2940

agaggtggtt aaagctgtcg atttggacac atatcagtaa tgactcgagt catgtaatta 3000

gttatgtcac gcttacattc acgccctccc cccacatccg ctctaaccga aaaggaagga 3060

gttagacaac ctgaagtcta ggtccctatt tattttttta tagttatgtt agtattaaga 3120

acgttattta tatttcaaat ttttcttttt tttctgtaca gacgcgtgta cgcatgtaac 3180

attatactga aaaccttgct tgagaaggtt ttgggacgct cgaaggcttt aatttgcggc 3240

cgagctcaca ggaaagtaac atcccaatgc ggactatacc accccaccac actcctacca 3300

ataacggtaa ctattctatg ttttcttact cctatgtcta ttcatctttc atctgactac 3360

ctaatactat gcaaaaatgt aaaatcatca cacaaaacat aaacaatcaa aatcagccat 3420

ttccgcacct tttcctctgt ccactttcaa ccgtccctcc aaatgtaaaa tggcctatcg 3480

gaatacattt tctacatcct aactactata aaacaacctt tagacttacg tttgctactc 3540

tcatggtctc aatactgccg ccgacattct gtcccacata ctaaatctct tcccgtcatt 3600

atcgcccgca tccggtgccg taaatgcaaa acaaatacca tctatgtctt ccacaccatc 3660

attttactat gcctgccacc atccatttgt cttttgcacc atatcttcat aacctgtcac 3720

cttgaaacta cctctgcatg ccacctacgt cgactatatc cggattggcg aatgggacgc 3780

gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac 3840

acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt 3900

cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc 3960

tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc 4020

gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact 4080

cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg 4140

gattttgccg atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc 4200

gaattttaac aaaatattaa cgtttacaat ttctggcggc acgatggcat gagattatca 4260

aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt 4320

atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca 4380

gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg 4440

atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca 4500

ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt 4560

cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt 4620

agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca 4680

cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca 4740

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agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact 4860

gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga 4920

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ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc 5040

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tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat 5160

gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt 5220

caatcatgat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg 5280

tatttagaaa aataaacaaa taggtcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc 5340

actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc 5400

gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg 5460

atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa 5520

atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc 5580

ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt 5640

gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa 5700

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tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc 5820

cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct 5880

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gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc 6000

tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg 6060

ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc 6120

gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc 6180

atctgtgcgg tatttcacac cgcatatatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc 6240

cgcatagtta agccagtata cactccgcta tcgctacgtg actgggtcat ggctgcgccc 6300

cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct 6360

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ccgaaacgcg cgaggcagct gcggtaaagc tcatcagcgt ggtcgtgaag cgattcacag 6480

atgtctgcct gttcatccgc gtccagctcg ttgagtttct ccagaagcgt taatgtctgg 6540

cttctgataa agcgggccat gttaagggcg gttttttcct gtttggtcac tgatgcctcc 6600

gtgtaagggg gatttctgtt catgggggta atgataccga tgaaacgaga gaggatgctc 6660

acgatacggg ttactgatga tgaacatgcc cggttactgg aacgttgtga gggtaaacaa 6720

ctggcggtat ggatgcggcg ggaccagaga aaaatcactc agggtcaatg ccagcgcttc 6780

gttaatacag atgtaggtgt tccacagggt agccagcagc atcctgcgat gcagatccgg 6840

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ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgccagggt 7260

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ggtggttaac ggcgggatat aacatgagct gtcttcggta tcgtcgtatc ccactaccga 7440

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ctgatcgttg gcaaccagca tcgcagtggg aacgatgccc tcattcagca tttgcatggt 7560

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gctggcctgg ttcaccacgc gggaaacggt ctgataagag acaccggcat actctgcgac 8220

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tcatgccata ccgcgaaagg ttttgcgcca ttcgatggtg tccgggatct cgacgctctc 8340

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ctgccaccat acccacgccg aaacaagcgc tcatgagccc gaagtggcga gcccgatctt 8520

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<220>

<223>

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catacaggca tatatatatg tgtgcgacga cacatgatca tatggcatgc atgtgctctg 120

tatgtatata aaactcttgt tttcttcttt tctctaaata ttctttcctt atacattagg 180

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attaata 247

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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tgctccgaac aataaagatt ctacaatact agcttttatg gttatgaaga ggaaaaattg 60

gcagtaacct ggccccacaa accttcaaat taacgaatca aattaacaac cataggatga 120

taatgcgatt agttttttag ccttatttct ggggtaatta atcagcgaag cgatgatttt 180

tgatctatta acagatatat aaatggaaaa gctgcataac cactttaact aatactttca 240

acattttcag tttgtattac ttcttattca aatgtcataa aagtatcaac aaaaaattgt 300

taatatacct ctatacttta acgtcaagga gaaaaaacta ta 342

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<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 8

ggtcacagtg accggtcaca gtgaccggtc acagtgacc 39