一种猪源抗菌肽cecropin P1突变体及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种新型猪源抗菌肽cecropin P1突变体及其制备方法和应用。本发明通过生物软件对猪源抗菌肽cecropin P1的氨基酸序列进行空间结构分析，将其31个氨基酸中的2处氨基酸进行突变(R10L、K12N)，并在C末端添加天冬酰胺以利于C末端的酰胺化，获得一种新型猪源抗菌肽突变体，使其抗菌效力获得显著提高。在此基础上，选用毕赤酵母偏爱密码子，人工合成新型猪源抗菌肽cecropin P1突变体基因，克隆于毕赤酵母中表达，获得新型抗菌肽重组酵母菌株，并将发酵规模放大到发酵罐水平，实现抗菌肽产品的高密度发酵和高效表达。发酵液进一步纯化后可制成粉剂、液体等抗菌肽制剂用于畜禽疾病的预防和治疗。
【专利说明】-种猪源抗菌化cecropin P1突变体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于功能多肤筛选【技术领域】，具体设及一种新型猪源抗菌肤cecropin P1 突变体及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 抗生素的滥用不仅导致了药物残留等公共卫生问题，而且由于耐药菌株和新的致 病亚型菌株的出现，使得细菌性疾病的防治再次成为困扰人类的难题。所W开发新的抗菌 药物成为一个越来越重大的研究课题。抗菌肤（Antibacterial peptide,AB巧又叫抗微生 物肤（Antimicrobial peptide)、抗生素肤（Antibiotics peptide),是生物体经诱导产生 的一类具有多种生物活性的小分子多肤，是宿主免疫防御系统的一个重要组成部分，具有 广谱抗菌、无耐药性及毒副作用等优点。目前为止，已经有千余种抗菌肤被分离，它们广泛 分布于哺乳动物、鱼类、昆虫、两栖动物、鸟类、植物和细菌等生物体内。
[0003] 抗菌肤cecropin P1是Lee等（1989)首先从猪小肠分离出得到的，其含有31个 氨基酸残基，分子量是333抓a,不含半脱氨酸，不能形成分子内二硫键，有强碱性的N端和 强疏水性的C端，其中酷胺化的C端对其广谱抗菌作用极为重要。cecropin P1氨基酸序 列与昆虫cecropin A有64%相似性，与cecropin B有75%的相似性。对其二级结构的理 论预测及CD谱和二维核磁共振数据表明，其分子内含有两亲水性a-螺旋和疏水性a-螺 旋，中间是形成柔性弯曲的谷氨酸-甘氨酸佑lu-Gly)卷曲序列。研究表明，其螺旋-卷 曲-螺旋结构对保持高抗菌活性具有特殊的重要性。cecropin P1对革兰氏阴性菌和一部 分革兰氏阳性菌都有抗菌活性。
[0004] 与传统抗生素相比，抗菌肤虽有较多优势，并可能成为抗生素的替代品，但仅有少 数抗菌肤进入临床试验，其他均由于各种原因停止于各期临床试验阶段，而且失败的原因 尚不清楚据推测可能是由于全身或局部毒性、不稳定性W及耐药性有关。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种新型猪源抗菌肤突变体，使其抗菌效力获得显著提高， 从而弥补现有技术的不足。
[0006] 本发明首先提供一种新型猪源抗菌肤，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID N0:1 ;
[0007] 上述蛋白的一种核巧酸序列为SEQ ID NO:2 ;
[000引本发明的抗菌肤用于制备饲料添加剂。
[0009] 本发明还提供一种猪源抗菌肤的重组毕赤酵母的制备方法，其制备步骤如下：
[0010] 1)根据猪源抗菌肤的氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肤基因序 列，连入重组酵母表达载体中，构建成表达重组质粒；
[0011] 2)将构建的表达重组质粒电转化宿主酵母菌，构建能表达猪源抗菌肤cecropin P1突变体的重组基因工程酵母菌；用该重组基因工程菌高密度发酵表达出猪源抗菌肤 cecropin P1 突变体。
[0012] 本发明利用基因工程技术构建了能表达一种新型猪源抗菌肤cecropin PI突变体 的重组酵母菌株。将重组猪源抗菌肤cecropin P1突变体制备成抗菌肤制剂，其抑菌效价 高、抑菌谱广，具有广阔的市场前景和开发价值。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合【具体实施方式】来进一步描述本发明，但本领域技术人员应该理解的是， 在不偏离本发明的技术方案的情况下可W对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或 替换，该些修改和替换均落入本发明保护范围内。
[0014] 实施例1新型猪源抗菌肤cecropin P1突变体及其基因的获得
[0015] 1、猪源抗菌肤cecropin P1 (GenBank登录号；AB186032)是由31个氨基酸组成的 具有双亲性a螺旋的抗菌肤，对细菌有很强的抑菌活性。为了进一步提高其抑菌活性，通 过生物软件对猪源抗菌肤AB186032的氨基酸序列进行空间结构分析，选择亲水端a螺旋 的两个氨基酸（1化、12脚）用亲水性更强的精氨酸（时和赖氨酸（K)进行替换，目的是为了 进一步提高亲水性和其与细胞膜的结合能力，同时在抗菌肤的C末端增加天冬酷胺W促进 C末端的酷胺化，最后获得一种新型猪源抗菌肤cecropin P1突变体，其氨基酸序列为SEQ ID N0:1。
[0016] 2、根据获得的新型猪源抗菌肤cecropin PI突变体的氨基酸序列SEQ ID NO: 1， 按照毕赤酵母基因密码子偏好性进行重新设计，获得编码新型猪源抗菌肤cecropin PI突 变体的核巧酸序列SEQ ID NO: 2。并在其N端引入Kex2酶切位点。两端引入化〇1和甜al 酶切位点，W便于克隆入毕赤酵母表达载体中。
[0017] 实施例2基因工程猪源抗菌肤cecropin P1突变体表达载体的构建与工程菌的获 得
[001引 1、将含抗菌肤基因的载体和酵母表达载体均用化01和甜al双酶切，酶切产物回 收并连接，进行PCR鉴定、测序。
[0019] 2、阳性质粒经SacI单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中。电转化后 均匀涂布于含100 y g/mL Zeocin的YPDS选择平板上，30°C解育3-5天。待YPDS平板上的 阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin 200 y g/mL、500 y g/mL、1000 y g/ 血的YPDS选择平板，W在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株。
[0020] 3、将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100 y g/mL Zeocin的YTO培养液中， 28 °C振摇培养18个小时。取此菌液按4 %体积比转接于5ml BMGY培养基中，28 °C摇振培养 18-2化左右，0D600值约为5-6。培养物直接转接于25ml BMMY培养基中，28°C继续摇振培 养。为了维持诱导表达，每隔2化补加100%甲醇使终浓度达1%。4她后，4°C 50(K)r/min 离屯、lOmin，收集上清，进行抑菌活性测定。能产生抑菌活性的重组酵母菌株即为能产生新 型猪源抗菌肤cecropin P1突变体的阳性菌株。
[0021] 实施例3发酵、纯化新型猪源抗菌肤cecropin P1突变体的制备
[0022] 1、发酵工艺
[0023] 1)将筛选得到的阳性重组子活化后按1% -10%接种量接种于S角瓶，28-30。 20化/111111摇床培养16-2化后^5%-20%接种量接入1化发酵罐（实装培养基化)，温度 28-30°C，转速 500-1500r/min，培养基抑值 5. 0-6. 0,通气量 0. 1-1. 0VVM(1L 发酵液 Imin 通入的氧气量），溶氧>20 %情况下进行发酵，在培养18-2化后流加50 %甘油化，待溶氧突 然升至100 %时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续48-7化。
[0024] 2)发酵结束后原罐蒸汽100°C灭菌10-20min，放料，5000r/min离屯、lOmin，收集发 酵上清即为抗菌肤半成品。
[002引如新型抗菌肤制剂
[0026] 抗菌肤半成品经微滤、超滤、喷雾干燥、冻干等生产的粉剂和W生化方法精制、纯 化后得到液体制剂。
[0027] 上述基因工程抗菌肤可做成畜禽饲料添加剂或畜禽疾病的预防和治疗制剂。
[002引实施例4新型猪源抗菌肤cecropin P1突变体的最小抑菌浓度测定（MIC)
[0029] 1、试验菌株：金黄色葡萄球菌（Cowan I)、猪金黄色葡萄球菌肠毒素75-1、大肠杆 菌K12D31、猪大肠杆菌078、猪大肠杆菌0157-H71和猪副伤寒沙口氏菌口82
[0030] 2、菌株处理；将菌种复苏，在固体LB培养基中划线，在培养箱中37°C过夜培养。将 过夜培养的细菌挑单菌落于含有25ml液体M皿培养基的=角瓶中，将=角瓶放于摇床37°C 培养12-1她。将培养后的菌液在0D600的条件下测其吸光度值，用M皿培养基调节菌液浓 度，使其处于0. 6-0. 8之间。之后将菌液稀释成浓度为5 X 105CFU/mU依次取90 y 1加入到 96孔板的各孔内。
[0031] 3、抗菌肤定量后用M皿培养基依次做倍比稀释。将稀释好的抗菌肤各取10 y 1依 次加入到96孔板的各个孔中，此时每个孔的反应体系为100 y 1。96孔板盖盖后，37°C振 荡培养2化后，观察并用酶标仪在600nm处测量并记录实验结果。抗菌肤样品经过二倍稀 释后，成一系列浓度，W抑制细菌生长的最小浓度来定义最小抑菌浓度（MIC)。利用菌液和 M皿培养基分别用来做阴性和阳性对照，各自代表抑菌率为0和100%。同时设立猪源抗菌 肤cecropin P1标准品试验组作为对照，用于观察抗菌肤改造前后的抑菌活性变化。
[0032] 4、用微量稀释法测定重组新型猪源抗菌肤cecropin P1突变体对多种细菌的最低 抑菌浓度，结果表明其对革兰氏阳性菌和阴性菌均有显著的抑制效果，改造后的新型猪源 抗菌肤cecropin P1突变体与猪源抗菌肤cecropin P1标准品相比，对革兰氏阴性菌的抑 菌能力得到大大提高，也提高了对革兰氏阳性菌的抑菌活性。
[0033] 表1抗菌肤对多种细菌的最低抑菌浓度
[0034]
【权利要求】
1. 一种新型猪源抗菌肽cecropin P1突变体，其特征在于，所述的新型猪源抗菌肽 cecropin P1突变体的氨基酸序列为SEQ ID N0:1。
2. -种核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段用于编码权利要求1所述的猪源 抗菌肽cecropin P1突变体。
3. 如权利要求2所述的核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段的序列为SEQ ID N0:2〇
4. 权利要求1所述的猪源抗菌肽cecropin P1突变体在制备畜禽饲料添加剂或免疫增 强剂中的应用。
【文档编号】C12R1/84GK104447976SQ201410771789
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月13日 优先权日:2014年12月13日
【发明者】王宏华 申请人:青岛宏昊生物科技有限公司