一种动物细胞培养中卫星罐DO100%校准方法与流程

本发明涉及一种DO100％校准方法，尤其涉及一种动物细胞培养中卫星罐DO100％校准方法。

背景技术：

在大规模细胞培养过程中，当细胞培养至最后一阶段，即接种至生产反应器时，从该反应器中取样至小型玻璃反应器并与生产同步进行细胞培养，这样的玻璃反应器称为卫星罐。动物细胞培养是指在体外人工条件下对离散的动物活细胞进行培养和繁殖过程，由于大规模细胞培养成本较高、工艺过程控制较复杂等诸多原因，一旦大规模生产出现问题，调查原因极为不便，需要花费大量时间、人力、物力和财力。因此，在这种情况下，为了更加方便、快速、准确地调查出生产中出现问题的原因，需要卫星罐提供数据支持，来协助调查原因。

动物细胞培养对工艺参数的控制有很高的要求，尤其是培养液的溶氧水平对细胞的生长有着极大的影响，对卫星罐进行溶氧100％校准(以下简称DO100％校准)制定了以下校准方式：

一是效仿传统的生产中使用的反应器，提前注入培养基至卫星罐中，待培养基溶氧达到饱和后进行DO100％校准；

二是使用与培养基体系相似的缓冲液，提前注入至卫星罐中，待缓冲液溶氧达到饱和后进行DO100％校准；

三是在卫星罐未接入细胞悬液之前直接在空气中进行DO100％校准。

前两种方法需要事先注入培养基或者缓冲液，在接种前又需倒出罐中的液体清空卫星罐，不仅操作繁琐，还增加了生产成本，提高了染菌风险，不是简便而安全的选择。第三种方式为直接在空气中进行DO100％校准的方法，但是没有经过验证不能说明其可行性，而且空气和细胞液温度不同，或许对DO100％校准的准确性产生影响。

技术实现要素：

发明目的：针对上述问题，本发明的目的是验证在空气中进行DO100％校准的方法的可行性，分析空气和细胞液的温度对DO100％校准的影响，建立一种操作简便、生产成本低、准确、安全的卫星罐DO100％校准方法。

技术方案：

一种动物细胞培养中卫星罐DO100％校准方法,其特征在于包括方法的建立与方法的验证，其中方法的建立包括以下几个步骤：

步骤1、组装卫星罐反应器及控制器，准备DO电极、温度电极、pH电极并将其安装至反应器中，DO电极进行零点校准后，对反应器进行灭菌处理，将DO电极连接至控制器进行DO100％校准；

步骤2、分析DO电极在常温空气中与饱和溶液培养基中校准DO100％的差异；

步骤3、分析DO电极和温度电极在所处环境相同及不同时对DO测量的影响；

步骤4、分析以上的结果，确定在空气中校准DO100％的必要条件。

其中方法的验证为比较采用传统的在饱和溶液培养基中校准DO100％方法的生产用反应器和采用在空气中校准DO100％方法的卫星罐内细胞的生产代谢情况，对卫星罐在空气中校准DO100％方法进行实际、可行、准确性验证。

其中，步骤1中的灭菌处理包括对反应器灭菌，然后连接Sparger通气后，冷却。

步骤1中，DO电极连接至控制器时应确保DO电极上无水珠附着，冷却间隔8-12h。

步骤1中，DO电极连接至控制器后还包括DO电极与Vessel Temp相关联，即允许DO校准时温度补偿。

步骤2具体为：设计两组实验，第一组实验为不同的DO电极在常温空气中进行DO100％校准，然后分别在不同的饱和溶液培养基中进行测量，第二组实验为不同的DO电极分别在饱和溶液培养基、常温空气进行DO100％校准，然后在同一饱和溶液培养基中进行测量比较差值。

步骤3具体为：不同的DO电极分别在饱和溶液培养基、常温空气进行DO100％校准，然后将DO电极洗净、吹干置于空气中，再将DO电极所连控制器的温度电极分别置于饱和溶液培养基和常温空气中，比较DO显示值的区别。

步骤4中所述的必要条件为DO电极在进行校准或者测量时，DO电极与温度电极必须处于同一温度。

其中，方法的验证中所述的细胞的生产代谢情况具体包括活细胞密度变化、细胞活率变化、乳酸浓度变化、葡萄糖浓度变化、谷氨酸浓度变化、谷氨酸胺浓度变化。

有益效果：与现有技术相比，本发明通过实验得出在常温空气中准确进行DO100％校准的必要条件，即DO电极在进行校准或者测量时，DO电极与温度电极必须处于同一温度，并且在常温空气中进行DO100％校准的卫星罐内与采用传统方式进行DO100％校准的production反应器内的细胞生长代谢情况基本相同，即在空气中校准DO100％对细胞的生长代谢没有明显的影响，验证了卫星罐在常温空气中进行DO100％校准方法的可行性，本发明操作简便、成本较低、染菌风险较小，准确可行。

附图说明

图1为CHO/NSO活细胞密度变化曲线图；

图2为CHO/NSO细胞活率变化曲线图；

图3为CHO/NSO培养过程中乳酸浓度变化曲线图；

图4为CHO/NSO培养过程中葡萄糖浓度变化曲线图；

图5为CHO/NSO培养过程中谷氨酸浓度变化曲线图；

图6为CHO/NSO培养过程中谷氨酰胺浓度变化曲线图；

其中，CHO为中国仓鼠卵巢细胞，NSO为小鼠骨髓瘤细胞；

CHO Cell_2000L Run1为CHO细胞在2000L生产反应器培养的第一组，CHO Cell_2000L Run2为CHO细胞在2000L生产反应器培养的第二组，CHO Cell_satelite1 15L为CHO细胞在15L卫星罐中培养的第一组，CHO Cell_satelite2 15L为CHO细胞在15L卫星罐中培养的第二组；

NSO Cell_2000L Run1为NSO细胞在2000L生产反应器培养的第一组，NSO Cell_2000L Run2为NSO细胞在2000L生产反应器培养的第二组，NSO Cell_satelite1 3L为NSO细胞在3L卫星罐中培养的第一组，NSO Cell_satelite2 3L为NSO细胞在15L卫星罐中培养的第二组。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

一、动物细胞培养中卫星罐DO100％校准方法的建立包括以下几个步骤：

步骤1、组装卫星罐反应器及控制器，准备DO电极、温度电极、pH电极并将其安装至卫星罐反应器中，DO电极进行零点校准后，对反应器进行灭菌处理，将DO电极连接至控制器进行DO100％校准，具体包括：

1、组装反应器及控制器：首先清洗玻璃反应器，然后进行管路组装，组装的管路包括harvest管、取样管、补料管、糖/碱/消泡剂添加管、进气管、出气管，连接控制器；

2、pH电极、温度电极准备：pH电极采用pH4.0、pH7.0两点校准，并使用标准液回测；

3、DO电极准备：首先检查DO电极的电极膜是否完好，其次更换电解液，然后进行灵敏度检测，即通过充入N₂，在5min以内，电流值显示在5nA以下则通过，灵敏度检测通过后将pH电极和DO电极安装至反应器；

3、DO电极零点校准：断开反应器控制器的电极线，将此时的状态作为零点；

4、反应器灭菌处理：气密性检查合格后，对反应器灭菌，然后连接Sparger通气后，冷却；

5、DO100％校准：将DO电极连接至反应器控制器，应确保DO电极上无水珠附着，冷却间隔8-12h，打开控制器中相应的DO校准页面，DO电极与Vessel Temp相关联，选择罐温补偿模式，即允许DO校准时温度补偿，手动输入校准压力值，进行DO100％校准。

步骤2、使用模拟培养基buffer，buffer为高纯水中添加1.6g/L NaHCO3,1g/L PF68，分析DO电极在常温空气中与37℃饱和溶氧培养基中校准100％的差异，具体包括：

a、DO电极准备：DO电极Mettler-1连接Finesse-5控制器，DO电极Mettler-2连接Finesse-6控制器，DO电极Applikon连接Applikon-1控制器，检查完整性、灵敏性良好，三支DO电极分别连通电极线极化18-24h。

b、反应器准备：在Finesse-6反应器和Applikon-1反应器中灌注buffer后设置培养基温度为37℃，过夜通气0.2vvm，18-24h后直至溶氧稳定。

c、将DO电极Mettler-2(F6)和DO电极Applikon(A1)在常温空气中校准DO100％并记录相应控制器的温度示数，然后将DO电极Mettler-2(F6)插入Finesse-6反应器中的buffer中，将DO电极Applikon(A1)插入Applikon-1反应器的buffer中，待数值稳定后读取温度示数及DO显示值，计算DO显示值与100％的差值。

d、将DO电极Mettler-1(F5)插入Finesse-6反应器的buffer中，在饱和buffer中校准DO100％，将DO电极Mettler-2(F6)置于常温空气中校准DO100％，记录相应控制器的温度示数，然后将DO电极Mettler-2(F6)也插入Finesse-6反应器的buffer中，两电极处于同一buffer中。待稳定30min后，向Finesse-6反应器罐内通入适量N₂，控制DO电极Mettler-1(F5)的DO显示值分别下降至60％、50％、40％，记录Finesse-6控制器此时相对应的DO显示值并比较两者差异，同时记录相应温度示数。

步骤3、分析DO电极和温度电极在所处环境相同及不同时对DO测量的影响；

分别将DO电极Mettler-1(F5)插入Finesse-6反应器的buffer中，DO电极Mettler-2(F6)置于常温空气中，DO电极Applikon(A1)插入Applikon-1反应器的buffer中校准DO100％，记录相应控制器的温度示数，然后将三支DO电极均从罐体内取出，用纯水清洗电极头，用空气吹干DO电极的电极头，将各DO电极所相连控制器的温度电极分别置于buffer和常温空气中，待数值稳定后记录相应温度示数及DO显示值，所得结果如以下表格所示：

步骤4、分析确定在空气中校准DO100％的必要条件。

其中，步骤2、步骤3的实验结果分别为以下表格所示：

表1、DO电极在常温空气中校准DO100％

表1中的实验数据表明，DO电极Mettler-2(F6)和DO电极Applikon(A1)在常温空气中校准DO100％后，在Finesse-6反应器、Applikon-1反应器的buffer中进行DO100％测量，DO显示值与100％的差值较小，测量较准确，证明实验Ⅰ、实验Ⅱ中在空气中进行DO100％校验可行，但是准确性还有待提高。

表2.DO电极在常温空气中与37℃饱和溶氧培养基中校准100％的差异

表2中的数据表明，实验Ⅲ为DO电极在Buffer中校准的标准情况，以在空气中进行DO电极100％校准的实验Ⅳ进行对比，在同一反应器的Buffer所测得的DO显示值没有偏差，说明实验Ⅳ的校准条件是可行的，实验Ⅳ虽然同样是DO电极在空气中校准，因为反应器Mettler-2中未添加Buffer，Mettler-2反应器中的温度电极是处于空气中，也就是DO电极和温度电极均处于空气中校准DO100％时，测量的结果准确，偏差很小。

表3.DO电极在所处环境相同及不同时DO测量的情况

这一组实验中，DO电极和温度电极均处于同样的条件下，进行DO100％校准，得到准确的DO100％校准，在进行DO显示值测量时，使DO电极均处于室温空气中，而温度电极分别置于buffer和空气中，测量的DO显示值与100％越接近，测量越准确。由表3的测量结果可知，实验Ⅵ、实验Ⅷ、实验Ⅹ测量的DO显示值与100％最接近，其中测量Ⅷ的结果最准确，这三组实验在测量中的共同处为，DO电极与温度电极均处于同样的环境，同样的温度中。

分析以上实验结果可知，DO电极在进行校准或者测量时，DO电极与温度电极必须处于同一温度中，才能得到准确的校准或测量结果。

二、动物细胞培养中卫星罐DO100％校准方法的验证，即通过比较采用传统的在饱和溶液培养基中校准DO100％方法的生产用反应器和采用在空气中校准DO100％方法的卫星罐内细胞的生产代谢情况，验证在空气中校准DO100％的可行性，具体为：

a.在分别接种至生产反应器完成时，从该反应器中取样接种至已准备完毕的卫星罐，在相同条件下进行培养；

b.在每天的日常取样中，分别从生产反应器中和卫星罐中取样并对样品进行检测分析；

c.记录检测参数，绘制图表，比较生产中反应器内与卫星罐内细胞的生长代谢情况，分析空气中DO100％校准方法对细胞生长代谢的影响。

以上实验分别采用中国仓鼠卵巢细胞(以下简称CHO)、小鼠骨髓瘤细胞(以下简称NSO)，利用细胞计数仪检测活细胞密度和细胞活率，图1中，CHO在生产反应器和卫星罐中的活细胞密度变化曲线规律基本保持一致，NSO在生产反应器和卫星罐中的活细胞密度变化曲线的变化趋势也保持高度的一致性。图2中，CHO在生产反应器和卫星罐中的细胞活率变化曲线几乎保持重合，均为初期保持平稳，后期出现CHO细胞活率逐渐降低，NSO在生产反应器和卫星罐中的细胞活率变化曲线同样保持相同的发展趋势，逐渐缓慢下降。

利用全自动生化分析仪检测细胞代谢中乳酸、葡萄糖、谷氨酸以及谷氨酰胺含量，综合分析生产反应器和卫星罐内细胞的代谢情况，如图3-6所示，CHO在生产反应器和卫星罐中的乳酸浓度变化曲线、葡萄糖浓度变化曲线、谷氨酸浓度变化曲线、谷氨酰胺浓度变化曲线规律基本保持一致，NSO在生产反应器和卫星罐中的活细胞密度变化曲线变化趋势也保持一致。

综合以上分析可知，对于同一种类的细胞，在空气中进行DO100％校准的卫星罐内的细胞代谢情况与采用传统方式进行DO100％校准的生产反应器内的细胞代谢情况基本相同，证明了在空气中进行DO100％校准方法能获得与传统校准方式同样的效果，校验准确。

本发明设计实验比较在饱和溶氧的缓冲液中与在常温空气中进行DO100％校准的差异，得出在常温空气中进行DO100％校准的必要条件，比较了生产中使用的反应器与在空气中进行DO100％校准的卫星罐内细胞的生长代谢情况基本一致，验证在空气中进行DO100％校准的方法的可行性和准确性，该卫星罐DO100％校准方法明显降低了染菌风险，操作简便、生产成本低、测量准确性高。