本发明涉及一种病毒检测方法，具体是一种食品中禽流感病毒的检测方法。
背景技术：
禽流感(Avianinfluenza，AI)是由A型流感病毒引起的一种严重危害禽类健康的传染性疾病。禽类感染禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)后,症状可表现为非显性感染、亚临诊感染,或轻度呼吸道疾病、产蛋量降低直至急性全身致死性疾病等多种形式。根据AIV对易感鸡致病性的差异,可将AIV分为高致病性AIV和低致病性AIV。高致病性AIV(HPAIV)感染禽类所导致的禽流感对养禽业具有毁灭性的打击,故被国际兽疫局规定为A类疾病;而一些低致病性AIV，如H9AIV的感染虽然对感染禽的致死率低,但可引起产蛋量的减少和淘汰率的上升,并造成免疫抑制,引起其他疫病的发生或混合感染，对养禽业造成的经济损失也相当可观。因此,AI一直是威胁世界养禽业的主要疾病之一，世界各国都十分重视对AIV的研究工作。已有研究表明来自于禽类的H9N2禽流感病毒能偶尔从禽类传染给哺乳动物，包括人和猪。Ck/Bei-like和G1-likeH9N2禽流感病毒在1990底首次从人和猪中分离到。2003年分离到的人H9N2禽流感病毒是一个新的重组体，很可能来源于当地的活禽市场。这种跨种间传播表明目前的H9N2禽流感病毒对人仍有潜在的感染性。AIV存在着广泛的抗原漂移和抗原转变现象,其抗原变异频率很高。因此测定AIV的全基因序列，对于研究禽流感病毒的检测、分布、流行规律以及控制禽流感的流行、蔓延均具有重要的意义。本研究分离鉴定了2002-2008年上海地区活禽市场的H9N2亚型禽流感病毒，经全基因序列测定分为三种基因型，对这三种基因型毒株的8个基因片段进行关键位点的分析以及基因进化关系分析，表明这三种基因型与目前报道的基因型存在差异，为H9N2禽流感病毒Ck/Bei系中的三种新的基因型，分别命名为Y1,Y2,Y3。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种结构简单、使用方便的食品中禽流感病毒的检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种食品中禽流感病毒的检测方法，采用恒温扩增方法，以禽流感病毒HA、AIV基因特异序列为靶序列，SYBER Green I为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：
（1）预处理：
在无菌环境下，将食品通过生理盐水进行清洗，随后转移到鸡胚中进行培养，培养温度为36-38℃，培养时间为6-8h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取总RNA,随后进行反转录，制得DNA；
（2）构建恒温扩增反应体系：
DNA模板 4μL，SYBER Green I荧光染料 0.3μL，10×Buffer 2.0μL，DNA聚合酶 10U，甲酸甲酯溶液 0.5μL，磺酸钠溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 3μL，柠檬酸裂合酶4μL，硬脂酸锌溶液 1μL，其余用dd H2O补足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值为1.7-1.9；
所述SYBER Green I荧光染料为10-20倍稀释；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、松油醇；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述甲酸甲酯溶液的浓度为8-14mmol/L；
所述磺酸钠溶液的浓度为5-10mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值为1.7-1.9；
所述硬脂酸锌溶液的浓度为20-40mmol/L；
（3）荧光定量反应：
将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，95℃变性6min，90-93℃变性0.5-1.5min；60℃退火45s；72℃延伸1min；38个循环，最后72℃延伸15min；
（4）检测分析：
根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。
作为本发明进一步的方案：具体步骤（1）中培养温度为37℃，培养时间为7h。
作为本发明进一步的方案：具体步骤（2）中所述DNA模板的OD260/OD280值为1.8。
作为本发明进一步的方案：具体步骤（2）中所述SYBER Green I荧光染料为15倍稀释。
作为本发明进一步的方案：具体步骤（2）中所述甲酸甲酯溶液的浓度为11mmol/L。
作为本发明进一步的方案：具体步骤（2）中所述磺酸钠溶液的浓度为8mmol/L。
作为本发明进一步的方案：具体步骤（2）中所述DNA引物的OD260/OD280值为1.8。
作为本发明进一步的方案：具体步骤（2）中所述硬脂酸锌溶液的浓度为30mmol/L。
作为本发明进一步的方案：具体步骤（3）中92℃变性1.0min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明检测方法中，实验流程少，操作简便易行，消耗费用低，和其他禽流感病毒检测的方法相比较，本发明的优势在于通过反转录避免了RNA降解带来结果的不稳定性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
一种食品中禽流感病毒的检测方法，采用恒温扩增方法，以禽流感病毒HA、AIV基因特异序列为靶序列，SYBER Green I为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：
（1）预处理：
在无菌环境下，将食品通过生理盐水进行清洗，随后转移到鸡胚中进行培养，培养温度为36℃，培养时间为6h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取总RNA,随后进行反转录，制得DNA；
（2）构建恒温扩增反应体系：
DNA模板 4μL，SYBER Green I荧光染料 0.3μL，10×Buffer 2.0μL，DNA聚合酶 10U，甲酸甲酯溶液 0.5μL，磺酸钠溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 3μL，柠檬酸裂合酶4μL，硬脂酸锌溶液 1μL，其余用dd H2O补足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值为1.7；
所述SYBER Green I荧光染料为10倍稀释；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、松油醇；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述甲酸甲酯溶液的浓度为8mmol/L；
所述磺酸钠溶液的浓度为5mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值为1.7；
所述硬脂酸锌溶液的浓度为20mmol/L；
（3）荧光定量反应：
将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，95℃变性6min，90℃变性0.5min；60℃退火45s；72℃延伸1min；38个循环，最后72℃延伸15min；
（4）检测分析：
根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。
实施例2
一种食品中禽流感病毒的检测方法，采用恒温扩增方法，以禽流感病毒HA、AIV基因特异序列为靶序列，SYBER Green I为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：
（1）预处理：
在无菌环境下，将食品通过生理盐水进行清洗，随后转移到鸡胚中进行培养，培养温度为36℃，培养时间为6h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取总RNA,随后进行反转录，制得DNA；
（2）构建恒温扩增反应体系：
DNA模板 4μL，SYBER Green I荧光染料 0.3μL，10×Buffer 2.0μL，DNA聚合酶 10U，甲酸甲酯溶液 0.5μL，磺酸钠溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 3μL，柠檬酸裂合酶4μL，硬脂酸锌溶液 1μL，其余用dd H2O补足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值为1.7；
所述SYBER Green I荧光染料为13倍稀释；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、松油醇；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述甲酸甲酯溶液的浓度为10mmol/L；
所述磺酸钠溶液的浓度为8mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值为1.7；
所述硬脂酸锌溶液的浓度为25mmol/L；
（3）荧光定量反应：
将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，95℃变性6min，91℃变性0.7min；60℃退火45s；72℃延伸1min；38个循环，最后72℃延伸15min；
（4）检测分析：
根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。
实施例3
一种食品中禽流感病毒的检测方法，采用恒温扩增方法，以禽流感病毒HA、AIV基因特异序列为靶序列，SYBER Green I为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：
（1）预处理：
在无菌环境下，将食品通过生理盐水进行清洗，随后转移到鸡胚中进行培养，培养温度为37℃，培养时间为7h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取总RNA,随后进行反转录，制得DNA；
（2）构建恒温扩增反应体系：
DNA模板 4μL，SYBER Green I荧光染料 0.3μL，10×Buffer 2.0μL，DNA聚合酶 10U，甲酸甲酯溶液 0.5μL，磺酸钠溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 3μL，柠檬酸裂合酶4μL，硬脂酸锌溶液 1μL，其余用dd H2O补足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值为1.8；
所述SYBER Green I荧光染料为15倍稀释；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、松油醇；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述甲酸甲酯溶液的浓度为11mmol/L；
所述磺酸钠溶液的浓度为8mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值为1.8；
所述硬脂酸锌溶液的浓度为30mmol/L；
（3）荧光定量反应：
将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，95℃变性6min，92℃变性1.0min；60℃退火45s；72℃延伸1min；38个循环，最后72℃延伸15min；
（4）检测分析：
根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。
实施例4
一种食品中禽流感病毒的检测方法，采用恒温扩增方法，以禽流感病毒HA、AIV基因特异序列为靶序列，SYBER Green I为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：
（1）预处理：
在无菌环境下，将食品通过生理盐水进行清洗，随后转移到鸡胚中进行培养，培养温度为38℃，培养时间为8h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取总RNA,随后进行反转录，制得DNA；
（2）构建恒温扩增反应体系：
DNA模板 4μL，SYBER Green I荧光染料 0.3μL，10×Buffer 2.0μL，DNA聚合酶 10U，甲酸甲酯溶液 0.5μL，磺酸钠溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 3μL，柠檬酸裂合酶4μL，硬脂酸锌溶液 1μL，其余用dd H2O补足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值为1.9；
所述SYBER Green I荧光染料为18倍稀释；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、松油醇；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述甲酸甲酯溶液的浓度为12mmol/L；
所述磺酸钠溶液的浓度为9mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值为1.9；
所述硬脂酸锌溶液的浓度为36mmol/L；
（3）荧光定量反应：
将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，95℃变性6min，92℃变性1.2min；60℃退火45s；72℃延伸1min；38个循环，最后72℃延伸15min；
（4）检测分析：
根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。
实施例5
一种食品中禽流感病毒的检测方法，采用恒温扩增方法，以禽流感病毒HA、AIV基因特异序列为靶序列，SYBER Green I为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：
（1）预处理：
在无菌环境下，将食品通过生理盐水进行清洗，随后转移到鸡胚中进行培养，培养温度为38℃，培养时间为8h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取总RNA,随后进行反转录，制得DNA；
（2）构建恒温扩增反应体系：
DNA模板 4μL，SYBER Green I荧光染料 0.3μL，10×Buffer 2.0μL，DNA聚合酶 10U，甲酸甲酯溶液 0.5μL，磺酸钠溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 3μL，柠檬酸裂合酶4μL，硬脂酸锌溶液 1μL，其余用dd H2O补足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值为1.9；
所述SYBER Green I荧光染料为20倍稀释；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、松油醇；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述甲酸甲酯溶液的浓度为14mmol/L；
所述磺酸钠溶液的浓度为10mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值为1.9；
所述硬脂酸锌溶液的浓度为40mmol/L；
（3）荧光定量反应：
将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，95℃变性6min，93℃变性1.5min；60℃退火45s；72℃延伸1min；38个循环，最后72℃延伸15min；
（4）检测分析：
根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。