本发明属于生命科学与生物
技术领域：
：，涉及一种联合检测H5亚型禽流感病毒与新城疫强毒的一步法实时荧光定量PCR的试剂盒。适用于H5亚型禽流感病毒和新城疫强毒的定量检测和流行病学实时监测。
背景技术：
：：流感病毒属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)，分节段基因组的单股负链RNA病毒。流感病毒分为A、B、C三型。A型流感病毒抗原变异性最强，感染人和动物，常引起世界性大流行，多种禽类均可感染(YoonSW,WebbyRJ,WebsterRG:EvolutionandEcologyofInfluenzaAViruses.MicrobiologicalReviews1992,56(1):152-179.)。根据其包膜表面血凝素(Hemagglutinin)和神经氨酸酶(Neuraminidase)的抗原性分为若干亚型。其中H5N1亚型禽流感病毒自1996年分离以来，呈世界流行并给养禽业造成巨大经济损失，给人类公共卫生构成了巨大威胁。2014年以来我国H5N1亚型禽流感病毒以clade2.3.2.1c、clade2.3.4.4和clade7.2为流行分支(GuM,LiuW,CaoY,PengD,WangX,WanH,ZhaoG,XuQ,ZhangW,SongQ:Novelreassortanthighlypathogenicavianinfluenza(H5N5)virusesindomesticducks,China.EmergingInfectiousDiseases2011,17(6):1060-1063.)。截至2016年5月，经实验室确认的人感染H5N1病毒的病例已达到850例，其中449例死亡(WHO,CumulativenumberofconfirmedhumancasesforavianinfluenzaA(H5N1)reportedtoWHO,http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/H5N1_cumulative_table_archives/en/.)。因此防控H5亚型禽流感病毒有重要的公共卫生意义。同H5亚型禽流感一样，新城疫(NewcastleDisease,ND)强毒也是严重危害禽类的病毒性疾病，常以单独或混合感染的方式感染家禽，发病率和死亡率都很高。新城疫是由新城疫病毒(NewcastleDiseasevirus,NDV)引起的一种烈性传染病，被OIE列为必须通报的重要疫病，在至少六个大洲都有分布(RajmaniRS,SinghPK,RaviKumarG,SaxenaS,SinghLV,KumarR,SahooAP,GuptaSK,ChaturvediU,TiwariAK:In-vitrocharacterizationandevaluationofapoptoticpotentialofbicistronicplasmidencodingHNgeneofNewcastlediseasevirusandhumanTNF-alpha.Animalbiotechnology2015,26(2):112-119.)。新城疫对200多种禽类和其他动物都有感染能力，是危害世界禽类养殖业的重要疾病之一。NDVClassII病毒宿主范围广，临床样品来源多元化，ClassII分支中III-X亚型均为强毒。H5亚型与新城疫强毒的发生均可导致禽类出现呼吸系统疾病症状，在临床症状和病理变化等方面有许多相似处，给临床鉴别诊断带来较大的困难。当这两种病毒混合感染禽类时，使用传统的病原分离及血清学方法时诊断操作繁琐，往往需要数天完成，且无法实现对两病的同步检测。现在虽有学者建立多重PCR方法同时检测H5禽流感病毒和新城疫强毒，但仅依赖普通凝胶电泳还达不到高通量集成化诊断的层次，因而需要研究一种能够对两种病毒进行高通量快速排查、准确鉴别的集成化诊断技术。有效防控H5禽流感和新城疫强毒，关键在于早期快速、敏感和特异的鉴别诊断，本发明根据两种病毒特有的保守基因序列，设计引物然后利用荧光定量PCR技术进行检测，一次可以同时分析数十个样本，从而达到快速高通量检测H5禽流感和新城疫强毒的目的。多数现有的检测流感病毒和新城疫病毒的分子诊断技术采用二步法，包括随机引物介导的反转录(第一步)和随后特异性引物的PCR(第二步)。二步法使用随机引物，会产生大量的背景核酸，降低反转录的效率，而且产生的背景核酸也会降低PCR的效率。一步法是基于特异引物的反转录体系，效率高，易操作，减低污染，从而大大提高了PCR的扩增效率。BHQ1、MGB基团是新一代猝灭基团，本身不产生荧光，与TAMARA等传统猝灭基团相比，背景低，灵敏度高。Taqman-MGB探针是在TaqMan探针的3’端偶联结了小沟结合物(Minorgroovebinding,MGB)，它可以缩短探针长度，降低荧光本底，增强探针与模板的结合，并实现分辨一个碱基的差异(SahaR,DonofrioRS,BagleyST:Quantitativereal-timePCRdetectionofPseudomonasoleovoranssubsp.lubricantisusingTaqMan-MGBassayincontaminatedmetalworkingfluids.InternationalBiodeterioration&Biodegradation2011,65(3):460-464)，在检测多种病原方面都有应用。MGB小沟结合物能提高探针Tm值，使探针更短，信号本底更低，还能帮助引物与目标基因结合(MaM,LiuJ,SongY,LiL,LiY:TaqManMGBProbeFluorescenceReal-TimeQuantitativePCRforRapidDetectionofChineseSacbroodVirus.PlosOne2013,8(2):e52670-e52670.)。MGB与BHQ1探针3′端的猝灭基团取代传统的TAMRA后自身不发光，荧光本底降低，改善了荧光光谱分辨率(MingxiaoM,JinhuaL,YingjinS,LiL,YongfeiL:TaqManMGBprobefluorescencereal-timequantitativePCRforrapiddetectionofChineseSacbroodvirus.PlosOne2013,8(2):e52670-e52670.)。因此本方法有较高的灵敏性、特异性和重复性，在早期快速检测H5亚型禽流感与新城疫强毒方面具有很好的应用价值。我国于2004年颁布H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法的国家标准，于2011年颁布对所有亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法的国家标准。其中H5检测方法可能不能与近年禽流感H5亚型的流行分支的变化情况相适应。本发明针对近5年来实验室分离到的H5亚型禽流感病毒的变化情况设计针对HA基因的引物和探针，能够检测clade2.3.4.4,clade2.3.2.1c以及早期clade0等分支的H5禽流感病毒。临床实验表明本方法能够检测泄殖腔棉拭子、组织病料、尿囊液中的多种clade的H5亚型禽流感病毒与新城疫强毒，敏感性高，无漏检现象。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种一步法实时荧光定量PCR试剂盒，用于同时检测H5亚型禽流感病毒RNA与新城疫强毒RNA。由于是直接检测病原体核酸，因此具有高敏感、高特异和短检测窗口期等优点，能为疫病早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间，为H5亚型禽流感病毒与新城疫强毒的监测提供技术支撑。本发明联合检测H5亚型禽流感病毒与新城疫强毒的一步法实时荧光定量PCR的引物组和探针如下：a.针对禽流感HA基因的引物及探针：HA-FP：CTTGCGACTGGGCTCAGAAAT(SEQIDNO：1)HA-RP:TTTGGGTGGATTCTYTGTCTGC(SEQIDNO：2)HA-probe:VIC-CATTCCYTGCCATCC-MGB(SEQIDNO：3)b.针对新城疫强毒F基因的引物及探针：F-FP:GGTCAATCATAGTCAAGTTGCTCC(SEQIDNO：4)F-RP:AACCCCAAGAGCTACACTGCC(SEQIDNO：5)F-probe:FAM-AAGCGTTTYTGTCTCCTTCCTCC-BHQ1(SEQIDNO：6)探针HA-probe的5’端标记有报告荧光染料VIC，3’端标记有猝灭荧光染料MGB；所述探针F-probe的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有猝灭荧光染料BHQ1。本发明还提供了包括上述引物组和探针的荧光定量PCR检测试剂盒。所述试剂盒的具体组成为：(1)A液：12.5x酶Mix：包括1U/uL的热启动TaqDNA聚合酶、7.5U/uL的RNase抑制剂、95U/uL的反转录酶；(2)50xROXI/ROXIIreferencedye；(3)B液：2.5xPCR缓冲液：包括2.5mMdNTP、6.25mMMgCl2、TaqBuffer等；(4)C液：10x引物Mix：包括3.5uMHA-FP、3.5uMHA-RP、3.5uMF-FP、3uMF-RP、3.5uMHA-Probe、3uMF-Probe；(5)阳性对照：H5-HA与NDV-F模板质粒混合液作为反应的阳性对照；(6)阴性对照：RNase-freeH2O作为反应的阴性对照。本发明中另一个目的是提供一种联合检测H5亚型禽流感与新城疫强毒的一步法荧光定量PCR的方法，适用于H5亚型禽流感病毒和新城疫强毒的定量检测和流行病学实时监测。为了实现上述目的，通过用于联合检测H5亚型禽流感与新城疫强毒的一步法实时荧光定量PCR试剂盒进行检测，该试剂盒包括20uL的PCR扩增检测体系：A液：12.5x酶Mix1.6uL；50xROXI/ROXIIreferencedye：0.4uL；B液：2.5xPCR缓冲液8uL；C液：10x引物Mix2uL；模板样品：5-8uL或对照品3uL；加RNase-freeH2O补至20uL体系。用一步法实时荧光定量PCR反应程序进行扩增：在孔板中加入试剂，加样完毕后，将孔板放入ABI7500或ABI7300仪器中，设置反应条件为：55℃15min反转录；95℃5min预变性；95℃10sec，60℃31sec40个循环。本发明中引物和探针的特异性：本发明选择病毒的保守区设计引物和探针组，可以特异性检测H5亚型AIV与NDV强毒，对其他亚型禽流感病毒、新城疫弱毒、其他禽类病毒均无明显扩增曲线。用于联合检测H5亚型禽流感与新城疫强毒的一步法荧光定量PCR试剂盒的敏感性：本方法单个反应系统可以同时检测出最低5拷贝含NDV基因片段的质粒与5拷贝含H5基因片段的质粒，比常规PCR灵敏度高至少100倍。标准曲线的线性关系、反应效率均较佳，且重复性试验中批内与批间重复性均良好。附图说明图1是本发明的HA-FP上游引物的示意图；图2是本发明的HA-RP下游引物的示意图；图3是本发明的HA-probe探针的示意图；图4是本发明的F-FP上游引物的示意图；图5是本发明的F-RP下游引物的示意图；图6是本发明的F-probe探针的示意图；图7是棉拭子样品RNA扩增曲线示意图；图8是尿囊液样品RNA扩增曲线示意图。具体实施方式以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用材料、试剂若无特殊说明，均可从商业途径得到。所用的材料和试剂如下：ABI7500荧光定量PCR仪、96孔荧光定量反应板、8联排管均购自ABI公司。反转录酶HiScriptIIReverseTranscriptase、热启动TaqDNA聚合酶ChampagneTaqDNAPolymerase及Taqbuffer均购自诺唯赞生物科技有限公司，RNase抑制剂RecombinantRNaseInhibitor购自大连宝生物公司。病毒DNA/RNA提取试剂购自Roche公司。1.引物与探针的设计：联合检测用引物与Taqman探针的设计均根据本实验室及GenBank中H5-Ha以及强毒NDV-F的保守序列。本发明采用PrimerExpress3.0以及Oligo7软件设计多套引物与探针，通过分析其引物之间的二聚体，选定如图1—图6所示的两组特异性引物对应的两条Taqman探针(序列在GenBank中下载)，并通过棋盘法探究反应体系中引物与探针的最佳浓度组合。结果显示，不同引物和探针终浓度组合对实验结果影响较大，在终浓度如下时灵敏度最佳：引物HA-FP0.35uM、引物HA-RP0.35uM、引物F-FP0.3uM、引物F-RP0.3uM；探针HA-Probe0.35uM、探针F-Probe0.3uM。2.一步法实时荧光定量PCR试剂盒检测方法的建立：(1)核酸抽提按试剂盒说明书进行，具体步骤如下：a.PolyACarrierRNA与BindingBuffer1:50混匀，称为MIXA；b.每个样品取100-200ul上清，加入200uLMIXA与50uL蛋白酶K，混匀；c.72℃孵育15min；d.装好吸附柱，将混合液转移至柱内，12000rpm离心1min，弃去下层液体，更换下层收集管；e.加入500ulInhibitorRemovalBuffer，12000rpm离心1min，弃去下层液体，更换下层收集管；f.加入450uLWashBuffer，12000rpm离心1min，弃去下层液体，更换下层收集管，并重复此步骤一次；g.12000rpm离心1min，弃去下层收集管，换1.5mL离心管；h.在柱内加入30uLElutionBuffer，室温放置1min，12000rpm离心1min洗脱RNA后弃柱。(2)一步法实时荧光定量PCR试剂盒检测体系：通过不同荧光标记的两条探针，完成一例样本在一管反应体系中同时检测AIV及其H5亚型。具体操作步骤如下：a.使用2对引物和对应探针在单管PCR反应体系中对步骤(1)得到的RNA进行实时荧光定量PCR检测，一个样品做两个重复。b.RRT-PCR检测体系为20uL，包括：A液：12.5x酶Mix1.6uL；50xROXI/ROXIIreferencedye：0.4uL；B液：2.5xPCR缓冲液8uL；C液：10x引物Mix2uL；模板样品：5-8uL或对照品3uL；加RNase-freeH2O补至20uL体系。c.RRT-PCR反应程序：(ABI7500等60℃34s，ABI7300等60℃31s)55℃15min反转录；95℃5min预变性；95℃10sec，60℃34sec，40个循环结束反应，耗时共约80分钟。(3)判断结果的方法：根据一步法实时荧光定量PCR检测结果，可以对检测样本是否感染AIV或其H5亚型进行鉴定。其中FAM在521nm激发光下发出荧光，检测新城疫强毒；VIC在554nm激发光下发出荧光，检测H5亚型禽流感病毒。具体方法为：a.每次检测，H5阳性质粒及F的阳性质粒均应有扩增曲线且Ct值≤38，阴性对照Ct>38，否则本次结果无效。b.在a的前提下，如果FAM标记的F探针在一个样品的两个孔内均有扩增，且Ct≤38，则判定为新城疫强毒阳性，否则判为新城疫强毒阴性。c.在a的前提下，如果VIC标记的HA探针在一个样品的两个孔内均有扩增，且Ct≤38，则判定为H5亚型AIV阳性，否则判定样品为H5亚型禽流感阴性。d.如果F、HA同时为阳性，则样品是H5亚型禽流感病毒、新城疫强毒共感染；如果F为阳性，HA为阴性，则样品含新城疫强毒不含H5亚型禽流感病毒；如果F、HA均为阴性，则样品无禽流感病毒也无新城疫病毒；如果如果F为阴性，HA为阳性，则样品含H5亚型禽流感病毒。最后应说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明。尽管参照前述优选实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述记载的技术方案进行修改，或对其中部分技术特征进行同等替换。凡在本发明的精神和原则以内所做的修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。3.实例(1)特异性实验：利用优化好的一步法实时荧光定量PCR反应体系，对各亚型AIV、常见禽病毒、新城疫弱毒提取RNA/DNA后进行扩增，以RNase-freeH2O为模板作为阴性对照，每个样品做两个重复，各孔收集FAM、VIC两种荧光信号。其中，使用的H5亚型禽流感病毒标准毒株如表1：表1.H5亚型禽流感病毒标准毒株*:董梅,顾敏,曹军平,等.1株对小鼠呈高致病性H5N1亚型禽流感病毒的遴选[J].免疫学杂志,2010(2):132-135.使用的新城疫标准强毒株如表2：表2.新城疫标准强毒株使用的新城疫弱毒、其他亚型禽流感病毒以及其他常见禽病毒如表3：表3其他其他亚型禽流感病毒以及其他常见禽病毒1.疫苗株购自乾元浩生物股份有限公司2.疫苗株购自青岛易邦生物工程有限公司如表1至表3的数据结果显示，H5亚型禽流感病毒在VIC通道中均有扩增曲线，新城疫强毒在FAM通道中均有扩增曲线。而新城疫弱毒、其他亚型的禽流感病毒、其他常见禽病毒在VIC、FAM通道中均无扩增，因此本方法有较强的特异性。(2)棉拭子临床样品检测：采鸡喉拭、肛拭后每支棉拭浸入1ml4抗PBS，挤棉拭样品后8000rpm离心5min，取200uL上清提取RNA后做一步法荧光定量PCR。检测结果曲线如图7所示。2015-2016年活禽市场临床棉拭样品中，检出感染H5亚型禽流感样品6份(阳性率7.69％)，与鸡胚分离法比较，无漏检且符合率为90％。检出感染新城疫强毒样品0份，用新城疫强毒ZJ1攻毒制作临床样品结果与鸡胚分离法比较，符合率为89％。(3)尿囊液临床样品检测：装尿囊液样品用1.5mLEppendorftube收集后，8000rpm离心5min，取200uL上清提取RNA后做一步法荧光定量PCR。检测结果曲线如图8所示。2013-2016年送检本实验室的尿囊液样品中，共分离到新城疫强毒6株，H5亚型AIV共11株，与鸡胚分离法比较并无漏检。SEQUENCELISTING<110>扬州大学<120>一种联合检测H5亚型禽流感病毒与新城疫强毒的一步法实时荧光定量PCR试剂盒<130><160>6<170>PatentInversion3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1cttgcgactgggctcagaaat21<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2tttgggtggattctytgtctgc22<210>3<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>3cattccytgccatcc15<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>4ggtcaatcatagtcaagttgctcc24<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>5aaccccaagagctacactgcc21<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>6aagcgtttytgtctccttcctcc23当前第1页1 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