本发明涉及核酸检测领域，尤其涉及一种人类免疫性缺陷病毒2型核酸检测试剂盒。
背景技术：
：人类获得性免疫缺陷综合症(AIDS，英文全称：acquiredimmunodeficiencysyndrome)，又称艾滋病，其病原是人类免疫缺陷病毒(HIV，英文全称：humanimmunodeficiencyvirus)，属于逆转录病毒科(Retroviridae)的慢病毒亚科(Lentivirinae)。根据其基因型差异分为HIV-1和HIV-2两个大型，各大型包括多种亚型。目前世界上大部分地区流行的是HIV-1，而HIV-2只在西非、西欧区域性流行。HIV基因组由两条单链正链RNA组成，包含gag、pol、env三个结构基因，以及tat、rev、nef、vif、vpu、vpr、vpx等调控基因，并在基因组的5′端和3′端各含长末端重复序列(LTR，英文全称：longterminalrepeat)。HIV的LTR区含顺式调控序列，包含启动子和增强子并含负调控区，控制病毒基因的表达。各基因的功能如下：(1)gag基因能编码约500个氨基酸组成的聚合前体蛋白(P55)，经蛋白酶水解形成P17，P24核蛋白，使RNA不受外界核酸酶破坏。(2)pol基因编码聚合酶前体蛋白(P34)，经切割形成蛋白酶、整合酶、逆转录酶、核糖核酸酶H，均为病毒增殖所必需。(3)env基因编码约863个氨基酸的前体蛋白并糖基化成gp160，gp120和gp41。gp120含有中和抗原决定簇，已证明HIV中和抗原表位，在gp120V3环上，V3环区是包膜蛋白的重要功能区，在病毒与细胞融合中起重要作用。gp120与跨膜蛋白gp41以非共价键相连。gp41与靶细胞融合，促使病毒进入细胞内。实验表明gp41亦有较强抗原性，能诱导产生抗体反应。(4)tat基因编码蛋白(P14)可与LTR结合，以增加病毒所有基因转录率，也能在转录后促进病毒mRNA的翻译。(5)rev基因产物是一种顺式激活因子，能对env和gag中顺式作用抑制序列(Crs，英文全称：Cis-Actingrepressionsequance)去抑制作用，增强gag和env基因的表达，以合成相应的病毒结构蛋白。(6)nef基因编码蛋白P27对HIV基因的表达有负调控作用，以推迟病毒复制。该蛋白作用于HIVcDNA的LTR，抑制整合的病毒转录。可能是HIV在体内维持持续感染所必需。(7)vif基因对HIV并非必不可少，但可能影响游离HIV感染性、病毒体的产生和体内传播。(8)vpu基因为HIV-1所特有，对HIV的有效复制及病毒体的装配与成熟不可少。(9)vpr基因编码蛋白是一种弱的转录激活物，在体内繁殖周期中起一定作用。HIV-2基因结构与HIV-1存在有差别，两者之间同源性仅为40～60％，HIV-2不含vpu基因，但有一功能不明vpx基因。HIV因为其反转录酶无校正功能，错配性高，导致基因变异性很强，尤以env基因变异率最高。根据env基因区的突变，HIV-2又可分为7个亚型。荧光定量PCR(聚合酶链式反应，英文全称：PolymeraseChainReaction)是在普通PCR的基础上在PCR反应体系中加入荧光基团，在把序列扩增过程中，随着PCR反应产物不断累积,荧光信号强度也等比例增加，荧光信号不断增强，并逐渐累积形成一条扩增曲线，通过荧光积累曲线实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定性及定量分析的方法。目前real-timeQ-PCR所使用的荧光化学方法主要有五种，分别是：DNA结合染色，水解探针，分子信标，荧光标记引物，杂交探针。它们又可分为扩增序列特异和非特异的检测两大类。(1)扩增序列非特异性检测。此方法基于与DNA结合的荧光分子，如SYBRgreen1等荧光染料。通过在PCR反应体系中加入过量SYBRgreen1荧光染料，此染料能渗入DNA双链，并发出荧光信号，但不能与单链DNA或RNA结合。在模板扩增过程中，随着双链DNA数量的积累，荧光信号强度也等比增强。荧光染料的优势在于它能监测任何dsDNA序列的扩增，不需要探针的设计，使检测方法变得简便，同时也降低了检测的成本。然而正是由于荧光染料能和任何dsDNA结合，因此它也能与非特异的dsDNA(如引物二聚体)结合，使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲线分析的软件加以解决。(2)扩增序列特异性检测。上世纪90年代，TaqDNA多聚酶的5’核酸外切酶活性的发现和双荧光标记探针的运用使得在一密闭PCR反应管中间接地检测PCR产物成为可能，此后，相应的仪器和试剂的商品化发展导致real-timeQ-PCR方法在研究工作中正式投入使用。扩增序列特异性检测又分为直接法和间接法。直接的方法指的是标记荧光的探针与扩增产物结合后即直接产生荧光，如分子信标、荧光标记引物及分子探针探针。分子信标探针是一种标记荧光的发夹探针，当探针分子呈发夹结构时，结合在其两端的荧光基团距离上接近，使得产生能量转移效应，而不发生荧光。当有与环序列互补的模板存序列存在时，环序列将与模板配对，分子信标将成链状，荧光基团与淬灭剂分开，发出荧光信号。荧光标记引物是从分子信标的概念变化而产生的一种联合分子探针系统，它把荧光基团标记的发夹结构的序列直接与PCR引物相结合，从而使荧光标记基团直接掺入PCR扩增产物中。目前主要有两种：日出引物和蝎子引物。杂交探针使用两个特异的探针，其中上游的探针的3′端标记有供体荧光素，而下游的探针的5′端标记有受体荧光素。在PCR中模板退火阶段，两探针同时与扩增产物杂交，并形成头尾结合的形式，使供体和受体荧光素距离非常接近，两者产生荧光共振能量转移(FRET，此作用与上述水解探针的方式相反)，使得受体荧光基团发出荧光；当两探针处于游离状态时，无荧光产生。由于反应中运用了两个探针，因此增加了方法的特异性，另外也可利用荧光寡核苷酸熔解曲线对与寡核苷酸探针结合的序列进行分析，从中获取有用的信息。间接的方法就是利用水解探针的策略。目前在real-timeQ-PCR中最广泛使用的TaqMan系统就是运用了这个原理。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，此时5′端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3′端荧光淬灭基团(发生荧光共振能量转移，FRET)，因此探针完整时，检测不到该探针5′端荧光基团发出的荧光。但在PCR扩增中，溶液中的模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换，Taq酶的5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)将探针5′端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。HIV-2虽然只是区域性感染，以西非和西欧地区为主，但近年来随着人口流动加强，在其它地区亦出现了感染病例。HIV-2攻击性与HIV-1相比较弱，发展为艾滋病的潜伏期较长，但后期症状类似，危害性相当。传统的血清学检测如ELISA法，免疫荧光法，凝集试验，免疫印迹法(WB，英文全称：Westernblot)并不能在感染窗口期检测出HIV-2，且HIV-2与HIV-1在血清学上存在一定的交叉反应，易造成漏检或误检，给后期治疗和用药带来不便。而普通PCR虽然耗时较少，但由于HIV-2变异性强，亚型较多，导致特异性较差，且其后期的结果分析需开盖进行，易造成污染和非特异性扩增造成假阳性，增加了检测的难度。因此，亟需一种灵敏度高，特异性强，覆盖面广，检测窗口期短的HIV-2检测方法。技术实现要素：本发明提供一种人类免疫性缺陷病毒2型核酸检测试剂盒，以解决现有技术中试剂盒灵敏度低，特异性差的技术问题。本发明提供一种人类免疫性缺陷病毒2型核酸检测试剂盒，所述人类免疫性缺陷病毒2型核酸检测试剂盒包括：人类免疫性缺陷病毒2型核酸PCR反应液，所述PCR反应液包括反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的上下游引物以及用于靶多核苷酸检测的探针，其中，所述用于靶多核苷酸检测的探针序列为SEQIDNO：3。优选的，所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物的序列分别为SEQIDNO：1和2。优选的，所述人类免疫性缺陷病毒2型核酸检测试剂盒还包括内标，所述内标的序列为SEQIDNO：7。优选的，所述人类免疫性缺陷病毒2型核酸检测试剂盒还包括：用于内标片段扩增的上下游引物和用于检测内标的探针，所述探针的序列为SEQIDNO：6。优选的，所述用于内标片段扩增的上下游引物序列分别为SEQIDNO：4和5。优选的，所述检测试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。优选的，所述检测试剂盒中还包括酶混合液，所述酶混合液中包括耐热DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶，同时在所述PCR反应液中还包括dUTP。本发明中的核苷酸序列如表1所示：本发明的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：本发明提供一种人类免疫性缺陷病毒2型核酸检测试剂盒，包括：人类免疫性缺陷病毒2型核酸PCR反应液，所述PCR反应液包括反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的上下游引物以及用于靶多核苷酸检测的探针，其中，所述用于靶多核苷酸检测的探针序列为SEQIDNO：3。本发明提供一种操作快速、方法简便、检测特异性好、灵敏度高、检测范围宽的人类免疫性缺陷病毒2型核酸检测试剂盒，本试剂盒提供的用于靶多核苷酸检测的探针特异性较高，应用该试剂盒，可以对未知样本中的人类免疫性缺陷病毒2型核酸进行快速检测，为诊断人类免疫性缺陷病毒2型核酸提供可靠的实验依据，可以解决现有技术中试剂盒检测效率低、特异性差以及灵敏度低的问题。应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明。具体实施方式本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处。实施例一本发明提供一种人类免疫性缺陷病毒2型核酸检测试剂盒，所述人类免疫性缺陷病毒2型核酸检测试剂盒包括：人类免疫性缺陷病毒2型核酸PCR反应液，所述PCR反应液包括：30μl反应缓冲液、100mM的脱氧核糖核苷三磷酸1.5μl、0.5μl用于靶多核苷酸检测的探针，其核苷酸序列为SEQIDNO：3以及用于靶多核苷酸扩增的上下游引物，其核苷酸序列分别为SEQIDNO：1和2。HIV-2与HIV-1的基因组同源性较低，仅为40％-60％，且突变性强。针对HIV-2基因组5’和3’的LTR基因高保守区设计一对上下游引物及TaqMan探针(SEQIDNO:1、2、3)，探针5’和3’分别标记FAM和BHQ1，能实现对HIV-2各亚型的高覆盖面检测，同时能将其和HIV-1及其它病毒区分开来，具有较高的特异性。本发明提供一种操作快速、方法简便、检测特异性好、灵敏度高、检测范围宽的人类免疫性缺陷病毒2型核酸检测试剂盒，本试剂盒提供的用于靶多核苷酸检测的探针特异性较高，应用该试剂盒，可以对未知样本中的人类免疫性缺陷病毒2型核酸进行快速检测，为诊断人类免疫性缺陷病毒2型核酸提供可靠的实验依据，可以解决现有技术中试剂盒检测效率低、特异性差以及灵敏度低的问题。实施例二本发明提供一种人类免疫性缺陷病毒2型核酸检测试剂盒，所述人类免疫性缺陷病毒2型核酸检测试剂盒包括：人类免疫性缺陷病毒2型核酸PCR反应液，所述PCR反应液包括：30μl反应缓冲液、100mM的脱氧核糖核苷三磷酸1.5μl、0.5μl用于靶多核苷酸检测的探针，其核苷酸序列为SEQIDNO：3、用于靶多核苷酸扩增的上下游引物，其核苷酸序列分别为SEQIDNO：1和2、内标，其序列为SEQIDNO：7、用于内标片段扩增的上下游引物和用于检测内标的探针，其序列分别为SEQIDNO：4、5和6。设计一种人工合成的由外壳蛋白包裹的含特定RNA序列(SEQIDNO：7)的慢病毒作为内标质控，另设计一对检测内标质控序列的引物(SEQIDNO：4、5)及一条TaqMan探针(SEQIDNO：6)，探针5’和3’分别标记HEX和BHQ1，对靶序列的提取及扩增过程进行监控，避免假阴性。此外，本实施例中还包括Tth酶、Taq酶以及催化DNA聚合酶所需要的金属阳离子，本实施例中PCR反应体系的配比如表2所示：表2：PCR反应体系的配比组份每一个反应中的体积反应缓冲液30uldNTPs(100mM)1.5μlTth酶(5U/μl)2.0μlTaq酶(5U/μl)2.0μlMn(OAc)2(30mM)1.5μlSEQIDNO:10.5μlSEQIDNO:20.5μlSEQIDNO:30.25μlSEQIDNO:40.3μlSEQIDNO:50.3μlSEQIDNO:60.15μl灭菌纯化水Upto50μl此外，本发明其他实施例中，还包括阴性对照和阳性对照。本发明采用阴性血清作为阴性对照，采用人工合成的一定浓度(1×103copies/ml)的假病毒作为阳性对照。本发明中所提供的方法为一种实时荧光逆转录PCR(RealtimeRT-PCR)，更具体地说为一种扩增序列特异性检测的实时荧光逆转录PCR。在普通PCR体系中引入了一段两端带有荧光化学基团(报告荧光基团和淬灭荧光基团)的与核酸模板互补的TaqMan探针。本发明检测HIV-2所用的引物为用作HIV-2核酸序列中核酸合成起始点的寡核苷酸(SEQIDNO:1、2)。检测HIV-2内标质控所用的引物为能用作内标质控核酸序列中核酸合成起始点的寡核苷酸(SEQIDNO:4、5)。可利用常规方法从限制性消化物中纯化得到上述引物，或者可通过合成方法生产上述引物。引物优选为在扩增中效率最高的单链，但引物也可以是双链。双链引物首先被变性(如采用加热方法使其变性)，即处理以分离各链。在本发明中，针对HIV-2靶核苷酸和内标RNA各设计了一条荧光标记的TaqMan探针(SEQIDNO：3、6)，其中，寡核苷酸探针SEQIDNO：3两端均分别标记为FAM和BHQ1，寡核苷酸探针SEQIDNO：6两端分别标记为HEX和BHQ1。扩增开始时，探针与HIV-2靶核酸序列互补性决定的特定位置或内标质控核酸序列互补性决定的特定位置上与模板序列杂交，在聚合酶5’-3’外切酶活性下被水解，释放出荧光信号。首先，HIV-2核酸序列经过逆转录酶的催化，完成RNA指导下的cDNA合成，随后DNA经过加热变性(变性温度一般范围约为90-105℃，时间一般进行约30秒或更久)成为cDNA。在扩增开始时，探针与模板结合，随后，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。随着反应的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图。荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，指数期时，产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，因此可以在反应处于指数期的某一点上来检测产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。本发明的检测方法为RealtimeRT-PCR，将RNA逆转录和DNA扩增结合起来。一般的RealtimeRT-PCR反应过程为：1)cDNA合成；2)cDNA预变性，时间和长度取决于靶核苷酸长度及碱基组成，预变性的温度一般为90℃-105℃，时间一般为1-10min，预变性的目的为使双链核苷酸序列彻底分离为单链；3)变性，温度一般为90℃-105℃，时间一般为10s-30s；4)退火，使各引物退火至HIV-2或内标质控核酸的靶序列上。退火的温度通常为40℃-60℃，退火的时间可以是10s-60s；5)延伸，引物与模板结合，开始合成新的双链DNA，延伸温度一般为40℃-80℃，延伸时间可以是10s-5min。荧光检测通道选择：1)选择FAM通道(Reporter:FAM,Quencher:none)检测人类免疫性缺陷病毒2型核酸；2)选择HEX通道(Reporter:ROX,Quencher:none)检测内标；4)参比荧光(PassiveReference)设置为none。荧光定量实时PCR反应条件如表3所示。表3：荧光定量实时PCR反应条件结果分析：反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样本Ct值和定值结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct(即cyclethreshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)。具体测试结果分析如下：1)当FAM通道无CT值，且HEX通道CT值≦40(一般为28-32)时，可报告检测结果为阴性；2)当FAM通道CT值≦40，且HEX通道CT值≦40，可报告检测结果为阳性；3)当FAM通道CT值≧40，且HEX通道CT值≦40，可报告样本浓度低于检测下线，结果仅供参考；4)当HEX通道CT值≧40，该检测结果无效，应查找并排除原因，并重复试验；5)当出现阴性对照有CT值或呈典型S型扩增曲线、阳性对照无CT值或无扩增曲线两种情况中的任一种时，该检测结果无效，应查找并排除原因，并重复试验。为证明该发明方法的可行性，进行如下测试：(1)最低检测限(LOD)试验通过对各浓度梯度的样本进行检测，表明本检测方法的检测灵敏度(LOD)为15IU/mL。(2)特异性实验—与其它疾病的交叉反应情况通过用本发明中的检测方法对HIV-2以外的其它病原体进行检测，结果表明本发明中的方法对HIV-1的O、M、N3个组型、HBVA-H8型、HCV1-6型、EB病毒等病原体感染样本无交叉反应，表明其具有高特意性。(3)对潜在内源物质的抗干扰性试验表明，当血浆样本中甘油三脂≦3000mg/dL、非结合性胆红素≦40mg/dL、血红蛋白≦500mg/dL、血蛋白≦9g/dL时，本检测方法的灵敏度不受干扰。当血浆样本中血细胞体积比≧2.5时，可能会出现内标失败的现象。(4)对潜在外源物质的抗干扰性试验表明，当样本中含有齐多夫定、替诺福韦、拉米夫定、洛匹那韦立托那韦、阿德福韦酯，替比夫定，恩替卡韦，替诺福韦酯、扑热息痛、扎那米韦(200μg/ml)等常见的抗病毒药物时，对本试剂盒的检测灵敏度不会受到明显干扰。本发明中的检测方法基于实时荧光逆转录PCR，把PCR、荧光探针融为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行，能对反应过程进行实时监测。实时荧光定量技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映的每个循环的扩增水平，根据扩增曲线及CT值可以判断检测结果的阴阳性。同时，通过设计不同浓度的假阳性样本作为定量参考品，可通过标准曲线计算出样本的绝对浓度。本发明中的用实时荧光PCR技术检测HIV-2与其它检测技术相比具有以下优势：(1)采用实时荧光PCR技术检测HIV-2与传统的血清免疫学检测比较，具有更高的灵敏度，从理论上讲只要有一个基因拷贝就可以检测出来，同时避免了交叉反应，缩短了检测窗口期。(2)根据HIV-2基因组独特的保守基因序列设计引物和探针，能够保证PCR反应的高度特异性。HIV-2与HIV-1的基因组同源性较低，仅为40％-60％，且突变性强，而位于基因组中间区域的env基因更甚。本发明在引物设计上避开高突变区域，针对HIV-2基因组的5’LTR及3’LTR高保守区设计一对引物探针，能实现对HIV-2各亚型的高覆盖面检测，同时能将其和HIV-1及其它病毒区分开来，具有较高的特异性。(3)采用人工合成的慢病毒作为内标质控，确保检测结果的准确度。本发明中采用一种由蛋白质外壳包裹的，含特定RNA序列的慢病毒颗粒作为内标质控，内标质控可参与HIV-2核酸的提取和PCR反应，监控实验操作过程和PCR反应过程，避免出现假阴性，增加了检测结果的可信度。(4)集PCR的高灵敏性与TaqMan探针的高特异性两大优点于一身，在很大程度上改变了传统PCR的缺陷，缩短了检测时间，简化检测步骤，提高了检测效率。(5)检测全过程均在单管封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阳性和环境污染。(6)可连续不断的检测PCR过程中实时信号的变化，避免了传统PCR的“平台期效应”，并且模板的定量不通过终产物，而由Ct值算出，准确性和灵敏性都有提高。以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。SEQUENCELISTING<110>湖南圣湘生物科技有限公司<120>一种人类免疫性缺陷病毒2型核酸检测试剂盒<130>2016<160>7<170>PatentInversion3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>引物<400>1gcaggtagagcctgggtgttc21<210>2<211>22<212>DNA<213>引物<400>2gaagagggctttaagcaagcaa22<210>3<211>27<212>DNA<213>探针<400>3tgctagactctcaccagyrcttggccg27<210>4<211>22<212>DNA<213>引物<400>4taggaggtagagcctgggtgtt22<210>5<211>17<212>DNA<213>引物<400>5ccagcaccggccaagtg17<210>6<211>28<212>DNA<213>探针<400>6agcctgggtgttccctgctagactctca28<210>7<211>154<212>DNA<213>内标<400>7tagattaggaggtagagcctgggtgttgtcacaacatttgtgttgtaagtgtaataatca60acttcagctagtagtagaaacctcgcaagacagcctgggtgttccctgctagactctcat120ggacacactacacttggccggtgctggtgtgttt154当前第1页1 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