本发明涉及一种鼠李糖乳杆菌冻干粉及其制备方法，属于生物菌制品的生产领域。
背景技术：
鼠李糖乳杆菌是目前最受全球关注的益生菌之一。该菌能够耐受动物消化道环境,具有能够在人和动物肠道内定植,起到调节肠道菌群、预防和治疗腹泻、排除毒素、预防龋齿和提高机体免疫力等功能特性。
菌粉便于储藏和运输，并有利于后期产品的加工，乳酸菌的生产多以菌粉的形式呈现。目前真空冷冻干燥是生产菌粉最有效的干燥技术，其可以很好的保持菌体的生理生化特性和生物活性。乳酸菌预冻成固体后，水分不经过液相，在真空和低温条件下直接升华。但是不加任何保护的菌体直接冻干，必然引起机械损伤，细胞膜的流动性和通透性变化，动态平衡的破坏，细胞会被杀死。因此，冻干乳酸菌时会添加冻干保护剂提高菌体的存活率。但是不同的蛋白因其性质不同，保护效果亦不同，筛选保护效果好的蛋白质是提高冻干存活率的先决条件。糖类被认为具有通过氢键替代稳定脂质膜和蛋白的效果，同时也可以通过玻璃化过程形成无定形的非晶结构。脱脂乳、蔗糖和海藻糖因其较好的保护效果，是经常被使用的冻干保护剂。
虽然目前广泛使用的保护剂在冻干乳酸菌时已具有较好效果，但是目前文献报道的鼠李糖乳杆菌冻干粉的菌株存活率均较低。大量研究也表明不同的菌株需要的保护剂不同，保护剂的使用量也不同。这与菌株的特异性和菌体的大小有关系。因此一种更有效的保护鼠李糖乳杆菌的保护剂配方及制备策略是提高鼠李糖乳杆菌生产的关键技术。
技术实现要素：
本发明的第一个目的在于提供一种冻干保护剂，成分包括乳清蛋白80～120g/L，海藻糖40～60g/L，菊粉40～60g/L，谷胱甘肽3～6g/L，咖啡酸0.5～2g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述的鼠李糖乳杆菌冻干保护剂的组成为：乳清蛋白90g/L，海藻糖40g/L，菊粉40g/L，谷胱甘肽5g/L，咖啡酸1.5g/L。
本发明的第二个目的是提供一种鼠李糖乳杆菌冻干粉，是由所述冻干保护剂和鼠李糖乳杆菌活性成分制成。
在本发明的一种实施方式中，所述冻干粉含有鼠李糖乳杆菌CGMCC1.549。
本发明的第三个目的是提供所述鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，包括收集菌体、配制保护剂、冻干和保藏。
在本发明的一种实施方式中，收集湿菌体是收集培养至对数生长期末期的鼠李糖乳杆菌，离心获得菌泥。
在本发明的一种实施方式中，所述配制保护剂是配乳清蛋白，海藻糖，菊粉，谷胱甘肽，和咖啡酸溶液，分别灭菌并按终浓度乳清蛋白80～120g/L，海藻糖40～60g/L，菊粉40～60g/L，谷胱甘肽3～6g/L，咖啡酸0.5～2g/L进行混匀，制备成冻干保护剂。
在本发明的一种实施方式中，所述冻干是将收集的湿菌体与冻干保护剂溶液以0.5～2g:10mL的比例充分混匀，预冻，一次干燥，二次干燥。
在本发明的一种实施方式中，所述鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法为：
(1)收集菌体：收集培养至对数生长期末期的鼠李糖乳杆菌，在4000～6000rpm，4℃离心，用无菌生理盐水洗涤菌体，然后在相同的条件下离心，得到菌泥。
(2)配制保护剂：配制乳清蛋白、海藻糖、菊粉、谷胱甘肽、咖啡酸溶液，将乳清蛋白、海藻糖、菊粉溶液115℃灭菌15min，谷胱甘肽、咖啡酸溶液过滤除菌；以终浓度乳清蛋白80～120g/L，海藻糖40～60g/L，菊粉40～60g/L，谷胱甘肽3～6g/L，咖啡酸0.5～2g/L将上述溶液在无菌环境下混匀。
(3)冻干：将收集的鼠李糖乳杆菌菌泥与冻干保护剂溶液以0.5～2g:10mL的比例充分混匀，菌悬液倒入冻干容器中，液面厚度0.5～1.0cm，在真空冷冻干燥机冻干箱进行真空冷冻干燥，具体步骤为：
(a)预冻：将产品温度降至4℃，保持30～60分钟，再降温至-40℃，保持4～6小时。
(b)一次干燥：预冻完成后，将温度降至-40℃以下，以0.5℃/min的升温速率将产品温度升至-20℃，保持-20℃20～30h。
(c)二次干燥：将产品温度升至20℃，保持10～20小时，产品无水分挥发后结束冻干过程。
(4)菌粉的收集和保藏：冻干结束后，收集菌粉并进行真空封装。
本发明还要求保护所述冻干保护剂在发酵食品、化工生产领域中的应用。
有益效果：本发明的冻干保护剂较常规保护剂能够显著提高鼠李糖乳杆菌的冻干存活率，制备的鼠李糖乳杆菌冻干粉中，鼠李糖乳杆菌活菌含量达到2.8～6.0×1011cfu/g，冻干存活率达到98％以上，且不会产生发酵性能减弱的现象。
具体实施方式
菌体发酵性能检测：将菌体在MRS固体培养基上划线，挑取单菌落，接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧活化培养至OD＝0.8，按体积比以5％的接种量转接至MRS液体培养基中，37℃厌氧发酵48h，测定乳酸产量Y0；将冻干粉中的菌体按上述相同方法活化、培养、发酵，测定乳酸产量Y1；发酵性能＝100％×Y1/Y0。
实施例1
称取乳清蛋白、海藻糖、菊粉、谷胱甘肽、咖啡酸分别配制成溶液，将乳清蛋白、海藻糖、菊粉溶液115℃灭菌15min，谷胱甘肽、咖啡酸溶液过滤除菌；以终浓度乳清蛋白80～120g/L，海藻糖40～60g/L，菊粉40～60g/L，谷胱甘肽3～6g/L，咖啡酸0.5～2g/L将上述溶液在无菌环境下混匀，制备获得冻干保护剂。
实施例2
以鼠李糖乳杆菌CGMCC 1.549为例，评价冻干菌粉的效果。
(1)收集菌体：收集培养至对数生长期末期的鼠李糖乳杆菌，在4000～6000rpm，4℃离心，用无菌生理盐水洗涤菌体，然后在相同的条件下离心，得到菌泥。
(2)配制保护剂：配制乳清蛋白、海藻糖、菊粉、谷胱甘肽、咖啡酸溶液，将乳清蛋白、海藻糖、菊粉溶液115℃灭菌15min，谷胱甘肽、咖啡酸溶液过滤除菌；以终浓度乳清蛋白90g/L，海藻糖40g/L，菊粉40g/L，谷胱甘肽5g/L，咖啡酸1.5g/L将上述溶液在无菌环境下混匀。
(3)冻干：将收集的鼠李糖乳杆菌菌泥与冻干保护剂溶液以0.5～2g:10mL的比例充分混匀，菌悬液倒入冻干容器中，液面厚度0.5～1.0cm，在真空冷冻干燥机冻干箱进行真空冷冻干燥，具体步骤为：将产品温度降至4℃，保持30～60分钟，再降温至-40℃，保持4～6小时；预冻完成后，将温度降至-40℃以下，以0.5℃/min的升温速率将产品温度升至-20℃，保持-20℃20～30h；将产品温度升至20℃，保持10～20小时，产品无水分挥发后结束冻干过程。
(4)菌粉的收集和保藏：冻干结束后，收集菌粉并进行真空封装。
(5)冻干完成后，冻干菌粉用无菌蒸馏水复溶至冻干前体积，测定活菌浓度、菌体发酵性能，计算冻干存活率，结果如表1所示。
表1 鼠李糖乳杆菌CGMCC 1.549在两种保护剂中的冻干存活率
冻干完成后，常规保护剂的保护效果显著低于本发明保护剂，鼠李糖乳杆菌CGMCC1.549在常规保护剂的中冻干存活率均低于75％，发酵性能下降10～26％，而本发明保护剂显著提高冻干存活率，活菌含量达到2.8～6.0×1011cfu/g，菌泥添加量低于1.0g/10mL保护剂时，冻干存活率达到100％，菌泥含量为2g/10mL时，存活率仍接近100％。
实施例3
称取乳清蛋白、海藻糖、菊粉、谷胱甘肽、咖啡酸分别配制成溶液，将乳清蛋白、海藻糖、菊粉溶液115℃灭菌15min，谷胱甘肽、咖啡酸溶液过滤除菌；以终浓度乳清蛋白90g/L，海藻糖60g/L，菊粉40g/L，谷胱甘肽5g/L，咖啡酸1.5g/L将上述溶液在无菌环境下混匀，制备获得冻干保护剂。
实施例4
称取乳清蛋白、海藻糖、菊粉、谷胱甘肽、咖啡酸分别配制成溶液，将乳清蛋白、海藻糖、菊粉溶液115℃灭菌15min，谷胱甘肽、咖啡酸溶液过滤除菌；以终浓度乳清蛋白乳清蛋白90g/L，海藻糖40g/L，菊粉60g/L，谷胱甘肽5g/L，咖啡酸1.5g/L将上述溶液在无菌环境下混匀，制备获得冻干保护剂。
实施例5
称取乳清蛋白、海藻糖、菊粉、谷胱甘肽、咖啡酸分别配制成溶液，将乳清蛋白、海藻糖、菊粉溶液115℃灭菌15min，谷胱甘肽、咖啡酸溶液过滤除菌；以终浓度乳清蛋白90g/L，海藻糖40g/L，菊粉40g/L，谷胱甘肽4g/L，咖啡酸1.0g/L。将上述溶液在无菌环境下混匀，制备获得冻干保护剂。
实施例6
称取乳清蛋白、海藻糖、菊粉、谷胱甘肽、咖啡酸分别配制成溶液，将乳清蛋白、海藻糖、菊粉溶液115℃灭菌15min，谷胱甘肽、咖啡酸溶液过滤除菌；以终浓度乳清蛋白120g/L，海藻糖60g/L，菊粉60g/L，谷胱甘肽6g/L，咖啡酸2g/L将上述溶液在无菌环境下混匀，制备获得冻干保护剂。
按实施例2的方法制备冻干粉，其区别在于，将菌体和实施例3～6制备的冻干保护剂以1g:10mL的比例充分混匀，结果如表2所示。
表2 鼠李糖乳杆菌CGMCC 1.549在不同保护剂中的冻干存活率
结果显示，本发明的方法制备的冻干保护剂具有理想的效果，可以使鼠李糖乳杆菌CGMCC 1.549冻干存活率接近100％，且保证冻干后的菌体发酵性能不降低。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。