本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种兜兰质粒子房注射法转基因方法。
背景技术：
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兜兰(Paphiopedilum)由于其独特的花朵造型、绚丽的花朵色彩、持久的观赏花期而具有极高的观赏价值，是国际花卉市场上十分流行的高档花卉。但由于人们对兜兰的过度采挖和生境的破坏，兜兰已成为世界上最濒危的植物物种之一，所有野生种类均被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附录I而被禁止贸易。通过各种育种方法能选育出在国际市场上自由交易、观赏价值高的兰花新品种来满足市场需要。兰科植物的转基因的方法有农杆菌介导法和基因枪法等，主要种类包括石斛兰、蝴蝶兰、文心兰和兰属植物等，但农杆菌介导法和基因枪法等均需建立在有效的再生体系的基础上。然而，兜兰属植物的再生体系难以建立，国内外还没有兜兰农杆菌介导法和基因枪法转基因方法的报道。利用质粒子房注射法能有效地解决这个问题。
兰科植物种子数量巨大，一般一个果荚中种子量在数万至数十万个以上，应用质粒子房注射法进行活体遗传转化时，即使转化效率较低，也能获得较多的转化植株。但兰科植物从授粉到受精过程一般需要几十天，而在受精前的短暂时期，由于生殖细胞或者受精卵没有细胞壁或者细胞壁比较薄弱，处于较为敏感的感受态，较容易被转化，因此选择合适的注射时间是子房注射法转基因成功的关键。
技术实现要素：
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本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种兜兰质粒子房注射法转基因方法。
本发明的兜兰质粒子房注射法转基因方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)质粒子房注射：对兜兰进行人工授粉，选择授粉后45～70天的子房进行表面消毒，然后沿子房纵向垂直将质粒注射液注射到子房内部，注射量为20～30μL，注射后对注射部位进行密封；所述的质粒注射液含有200～400μg/mL的携带目的基因的植物表达载体和体积分数1％～3％的二甲基亚砜，其余为水；所述的植物表达载体携带有抗性基因；
2)抗性植株筛选和检测：摘取授粉后180～210天的注射有质粒注射液的蒴果进行无菌播种，将蒴果进行消毒处理，无菌条件下剖开蒴果，取出种子并进行消毒，然后将种子悬浮于无菌水中制成种子悬浮液播种到改良H26号培养基上，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，种子萌发形成原球茎，将原球茎转接至含有与植物表达载体携带的抗性基因相对应的抗生素的改良H26号培养基上进行连续筛选，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，获得抗性原球茎，将抗性原球茎转接到改良H26号培养基上，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，培养至形成小苗，经分子检测获得转基因兜兰植株；
所述的改良H26号培养基为：每升培养基含有花宝1号1～2g、蔗糖10～20g、蛋白胨1～3g、酪氨酸1～3g、琼脂5～6g、活性炭1.0～2.0g、维生素B1 10mg、维生素B6 1mg、烟酸1mg、甘氨酸2mg、肌醇0.1mg、磷酸二氢钠150～200mg、萘乙酸0.5～1mg和椰子汁50～100mL，余量为水。
所述的抗性基因优选为潮霉素抗性基因。
所述的植物表达载体优选为pCAMBIA1301。
所述的兜兰为梦想兜兰(Paphiopedilum SCBG Dream)。
所述的目的基因优选为建兰CeFT基因。
所述的将蒴果进行消毒处理具体为将蒴果用体积分数70％～80％的酒精浸泡1～2分钟，再用质量分数0.1％～0.2％的升汞溶液浸泡消毒10～20min，无菌水冲洗3～5次。
所述的将原球茎转接至含有与植物表达载体携带的抗性基因相对应的抗生素的改良H26号培养基上进行连续筛选，培养温度26～30℃，光照时间16h/d，光照强度1600～2000lx，获得抗性原球茎具体为：将原球茎转接至含30～50mg/L潮霉素的改良H26号培养基上，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，培养50～65d时将存活的原球茎转接至含40～60mg/L潮霉素的改良H26号培养基上，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，培养50～65d时将存活的原球茎转接至新的含40～60mg/L潮霉素的改良H26号培养基上，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，培养50～65d后将存活的原球茎转接至含30～50mg/L潮霉素的改良H26号培养基上，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，培养50～65d天后获得抗性原球茎。
本发明采用标准型兜兰(Complex standard hybrids of Paphiopedilum)品种梦想兜兰(Paphiopedilum SCBG Dream)为材料进行质粒子房注射法转基因，由于梦想兜兰从种植到开花需4年时间，希望通过转入建兰开花整合基因(CeFT基因)使梦想兜兰提早开花。
本发明的兜兰质粒子房注射法转基因方法，通过将含有携带有目的基因的植物表达载体的质粒注射液注射到兜兰授粉后且完成双受精前的子房内，然后将发育成的种子作为外植体进行无菌播种，经原球茎的诱导、抗性原球茎的筛选及分子检测获得转基因兜兰植株。本发明的兜兰质粒子房注射法转基因方法具有操作简单、结果率高和转化率高的优点，有利于兜兰的分子育种及加速兜兰的育种进程。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
1.质粒注射液制备
含目的基因表达载体的构建：以建兰开花整合基因(CeFT)(GenBank登录号：HM803115)为目的基因，设计引物：CeFT-F：5’-TCTAGAATGAATAGAGAGAGAGACTC-3’(下划线部分为Xba I酶切位点)，CeFT-R：5’-GGATCCTCAATCCTGCATCCTTCTTC-3’(下划线部分为BamH I酶切位点)，以建兰花芽的cDNA作为模板，以CeFT-F和CeFT-R作为引物扩增带酶切位点Xba I和BamH I的建兰CeFT基因，连接到Takara的PMD18-T载体上，再根据J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》进行转化和鉴定。将鉴定的阳性质粒利用酶切位点Xba I和BamH I从T载体上切下CeFT基因，与带有35s启动子的植物表达载体pCAMBIA1301(GenBank登录号：AF234297)同样用Xba I和BamH I酶切后连接，构建表达载体pCAMBIA1301-CeFT，经测序验证，CeFT基因插入了植物表达载体pCAMBIA1301。pCAMBIA1301上携带有β-葡萄糖酸甘酶基因(Gus A)、潮霉素抗性基因(Hpt)和卡那霉素抗性基因(kan)。
质粒注射液的制备：将含重组质粒pCAMBIA1301-CeFT的工程菌在含有50mg/L Kan的LB液体培养基中振荡培养，37℃振荡培养至OD600值为0.6。然后再根据《分子克隆实验指南》采用碱裂解法提取重组质粒pCAMBIA1301-CeFT，将质粒用体积分数1％的二甲基亚砜(DMSO)水溶液溶解，使质粒的浓度为200μg/mL，即为质粒注射液。
2.质粒子房注射
在温室中对梦想兜兰(Paphiopedilum SCBG Dream)进行人工授粉，在完成授粉后的45天(完成双受精前)进行子房注射，每个子房的注射量为20μL。注射时，先用酒精棉(70％酒精)擦拭子房表面以去除附着在子房表面的杂物，再用已灭菌的微量注射器缓慢吸取质粒注射液沿子房纵向垂直注射入发育良好、长势一致的子房内部后，抽出针管用酒精棉擦拭注射处并用已消毒的纸胶布封住注射处，结果率65％。在授粉后210天摘取果实进行无菌播种。
3.抗性植株筛选
摘取授粉后210天的注射有质粒注射液的蒴果进行无菌播种。播种时，先将蒴果放在自来水下冲洗以去除粘附在蒴果表皮上的杂物，然后用体积分数70％酒精浸泡蒴果1分钟，再用质量分数0.1％的升汞溶液浸泡消毒20min后取出蒴果，无菌水冲洗3次后，吸干蒴果表面水分，在无菌操作台上用消毒后的手术刀沿着蒴果中缝线纵向剖开，取出种子并将其放入灭菌的三角瓶中，加入现配的质量分数0.5％的次氯酸钠(NaClO)溶液浸泡消毒40min，无菌水冲洗过滤3次后，将种子置于无菌水中制成悬浮液播种到改良H26号培养基上，培养温度26℃，光照时间14h/d，光照强度1600lx，种子萌发形成原球茎，将原球茎转接至含30mg/L潮霉素(Hyg)的改良H26号培养基上培养，每瓶接种50个，培养温度26℃，光照时间14h/d，光照强度1600lx，培养50d时将存活的原球茎转接到含40mg/L潮霉素(Hyg)的改良H26号培养基上，培养温度26℃，光照时间14h/d，光照强度1600lx，培养50d时将存活的原球茎转接到含40mg/L潮霉素的改良H26号培养基上培养，培养温度26℃，光照时间14h/d，光照强度1600lx，培养50d时将存活的原球茎转接到含30mg/L潮霉素(Hyg)的改良H26号培养基上进行恢复培养，培养温度26℃，光照时间14h/d，光照强度1600lx，培养50d筛选获得潮霉素抗性原球茎，经过4轮筛选出的潮霉素抗性原球茎再转入改良H26号培养基上，培养温度26℃，光照时间14h/d，光照强度1600lx，培养90d天后形成小苗。按如下公式计算转化率：转化率＝(小苗个数/用于筛选的原球茎个数)×100％。转化率为0.30％。
改良H26号培养基为：每升培养基含有花宝1号(Hyponex I)1g、蔗糖(sugar)10g、蛋白胨(peptone)1g、酪氨酸(tyrosine)1g、琼脂(agar)5.0g、活性炭(AC)1.0g、维生素B110mg、维生素B6 1mg、烟酸1mg、甘氨酸2mg、肌醇0.1mg、磷酸二氢钠(NaH2PO4)150mg、萘乙酸(NAA)0.5mg和椰子汁50mL，余量为水。
改良H26号培养基的配制方法是将1g花宝1号、10g蔗糖、1g蛋白胨、1g酪氨酸、5.0g琼脂、1.0g活性炭、10mg维生素B1、1mg维生素B6、1mg烟酸、2mg甘氨酸、0.1mg肌醇、150mg磷酸二氢钠、0.5mg萘乙酸和50mL椰子汁，加到少量水中，然后用水补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
4.抗性植株检测
对获得的小苗进行GUS染色、PCR检测和Southern blot检测。GUS染色均呈蓝色，PCR检测和Southern blot检测同时存在Gus A基因和CeFT基因，确定获得的小苗即为转基因兜兰植株。
实施例2：
1.质粒注射液制备
含目的基因表达载体的构建：以建兰开花整合基因(CeFT)(GenBank登录号：HM803115)为目的基因，设计引物：CeFT-F：5’-TCTAGAATGAATAGAGAGAGAGACTC-3’(下划线部分为Xba I酶切位点)，CeFT-R：5’-GGATCCTCAATCCTGCATCCTTCTTC-3’(下划线部分为BamH I酶切位点)，以建兰花芽的cDNA作为模板，以CeFT-F和CeFT-R作为引物扩增带酶切位点Xba I和BamH I的建兰CeFT基因，连接到Takara的PMD18-T载体上，再根据J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》进行转化和鉴定。将鉴定的阳性质粒利用酶切位点Xba I和BamH I从T载体上切下CeFT基因，与带有35s启动子的植物表达载体pCAMBIA1301(GenBank登录号：AF234297)同样用Xba I和BamH I酶切后连接，构建表达载体pCAMBIA1301-CeFT，经测序验证，CeFT基因插入了植物表达载体pCAMBIA1301。pCAMBIA1301上携带有β-葡萄糖酸甘酶基因(Gus A)、潮霉素抗性基因(Hpt)和卡那霉素抗性基因(kan)。
质粒注射液的制备：将含重组质粒pCAMBIA1301-CeFT的工程菌在含有50mg/L Kan的LB液体培养基中振荡培养，37℃振荡培养至OD600值为0.6。然后再根据《分子克隆实验指南》采用碱裂解法提取重组质粒pCAMBIA1301-CeFT，将质粒用体积分数2％的二甲基亚砜(DMSO)水溶液溶解，使质粒的浓度为300μg/mL，即为质粒注射液。
2.质粒子房注射
在温室中对梦想兜兰(Paphiopedilum SCBG Dream)进行人工授粉，在完成授粉后的60天(完成双受精前)进行子房注射，每个子房的注射量为25μL。注射时，先用酒精棉(75％酒精)擦拭子房表面以去除附着在子房表面的杂物，再用已灭菌的微量注射器缓慢吸取质粒注射液沿子房纵向垂直注射入发育良好、长势一致的子房内部后，抽出针管用酒精棉擦拭注射处并用已消毒的纸胶布封住注射处，结果率70％。在授粉后195天摘取果实进行无菌播种。
3.抗性植株筛选
摘取授粉后195天的注射有质粒注射液的蒴果进行无菌播种。播种时，先将蒴果放在自来水下冲洗以去除粘附在蒴果表皮上的杂物，然后用体积分数75％酒精浸泡果荚1.5分钟，再用质量分数0.15％的升汞溶液浸泡消毒15min后取出蒴果，无菌水冲洗4次后，吸干蒴果表面水分，在无菌操作台上用消毒后的手术刀沿着蒴果中缝线纵向剖开，取出种子并将其放入灭菌的三角瓶中，加入现配的质量分数1.0％的次氯酸钠(NaClO)溶液浸泡消毒30min，无菌水冲洗过滤4次后，将种子置于无菌水中制成悬浮液播种到改良H26号培养基上，培养温度28℃，光照时间16h/d，光照强度1800lx，种子萌发形成原球茎，将原球茎转接至含40mg/L潮霉素(Hyg)的改良H26号培养基上，每瓶接种50个，培养温度28℃，光照时间16h/d，光照强度1800lx，培养60d时将存活的原球茎转接到含50mg/L潮霉素(Hyg)的改良H26号培养基上，培养温度28℃，光照时间16h/d，光照强度1800lx，培养60d时将存活的原球茎转接到含50mg/L潮霉素的改良H26号培养基上，培养温度28℃，光照时间16h/d，光照强度1800lx，培养60d时将存活的原球茎转接到含40mg/L潮霉素(Hyg)的改良H26号培养基上进行恢复培养，培养温度28℃，光照时间16h/d，光照强度1800lx，培养60d获得潮霉素抗性原球茎，经过4轮筛选出的潮霉素抗性原球茎再转入改良H26号培养基上，培养温度28℃，光照时间16h/d，光照强度1800lx，培养75d天后形成小苗。按如下公式计算转化率：转化率＝(小苗个数/用于筛选的原球茎个数)×100％。转化率为1.0％。
改良H26号培养基为：每升培养基含有花宝1号(Hyponex I)1.5g、蔗糖(sugar)15g、蛋白胨(peptone)2g、酪氨酸(tyrosine)2g、琼脂(agar)5.5g、活性炭(AC)1.5g、维生素B1 10mg、维生素B6 1mg、烟酸1mg、甘氨酸2mg、肌醇0.1mg、磷酸二氢钠(NaH2PO4)170mg、萘乙酸(NAA)0.75mg和椰子汁75mL，余量为水。
改良H26号培养基的配制方法是将1.5g花宝1号、15g蔗糖、2g蛋白胨、2g酪氨酸、5.5g琼脂、1.5g活性炭(AC)、10mg维生素B1、1mg维生素B6、1mg烟酸、2mg甘氨酸、0.1mg肌醇、170mg磷酸二氢钠、0.75mg萘乙酸和75mL椰子汁，加到少量水中，然后用水补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
4.抗性植株检测
对获得的小苗进行GUS染色、PCR检测和Southern blot检测。GUS染色均呈蓝色，PCR检测和Southern blot检测同时存在Gus A基因和CeFT基因，确定获得的小苗即为转基因兜兰植株。
实施例3：
1.质粒注射液制备
含目的基因表达载体的构建：以建兰开花整合基因(CeFT)(GenBank登录号：HM803115)为目的基因，设计引物：CeFT-F：5’-TCTAGAATGAATAGAGAGAGAGACTC-3’(下划线部分为Xba I酶切位点)，CeFT-R：5’-GGATCCTCAATCCTGCATCCTTCTTC-3’(下划线部分为BamH I酶切位点)以建兰花芽的cDNA作为模板，以CeFT-F和CeFT-R作为引物扩增带酶切位点Xba I和BamH I的建兰CeFT基因，连接到Takara的PMD18-T载体上，再根据J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》进行转化和鉴定。将鉴定的阳性质粒利用酶切位点Xba I和BamH I从T载体上切下CeFT基因，与带有35s启动子的植物表达载体pCAMBIA1301(GenBank登录号：AF234297)同样用Xba I和BamH I酶切后连接，构建表达载体pCAMBIA1301-CeFT，经测序验证，CeFT基因插入了植物表达载体pCAMBIA1301。pCAMBIA1301上携带有β-葡萄糖酸甘酶基因(Gus A)、潮霉素抗性基因(Hpt)和卡那霉素抗性基因(kan)。
质粒注射液的制备：将含重组质粒pCAMBIA1301-CeFT的工程菌在含有50mg/L Kan的LB液体培养基中振荡培养，37℃振荡培养至OD600值为0.6。然后再根据《分子克隆实验指南》采用碱裂解法提取重组质粒pCAMBIA1301-CeFT，将质粒用体积分数3％的二甲基亚砜(DMSO)水溶液溶解，使质粒的浓度为400μg/mL，即为质粒注射液。
2.质粒子房注射
在温室中对梦想兜兰(Paphiopedilum SCBG Dream)进行人工授粉，在完成授粉后的70天(完成双受精前)进行子房注射，每个子房的注射量为30μL。注射时，先用酒精棉(80％酒精)擦拭子房表面以去除附着在子房表面的杂物，再用已灭菌的微量注射器缓慢吸取质粒注射液沿子房纵向垂直注射入发育良好、长势一致的子房内部后，抽出针管用酒精棉擦拭注射处并用已消毒的纸胶布封住注射处，结果率75％。在授粉后180天摘取果实进行无菌播种。
3.抗性植株筛选
摘取授粉后180天的注射有质粒注射液的注射的蒴果进行无菌播种。播种时，先将蒴果放在自来水下冲洗以去除粘附在蒴果表皮上的杂物，然后用体积分数80％酒精浸泡蒴果2分钟，再用质量分数0.2％的升汞溶液浸泡消毒10min后取出蒴果，无菌水冲洗5次后，吸干蒴果表面水分，在无菌操作台上用消毒后的手术刀沿着蒴果中缝线纵向剖开，取出种子并将其放入灭菌的三角瓶中，加入现配的质量分数2.0％的次氯酸钠(NaClO)溶液浸泡消毒20min，无菌水冲洗过滤5次后，将种子置于无菌水中制成悬浮液播种到改良H26号培养基上，培养温度30℃，光照时间18h/d，光照强度2000lx，种子萌发形成原球茎，将原球茎转接至含50mg/L潮霉素(Hyg)的改良H26号培养基上，每瓶接种50个，培养温度30℃，光照时间18h/d，光照强度2000lx，培养65d时将存活的原球茎转接到含60mg/L潮霉素(Hyg)的改良H26号培养基上，培养温度30℃，光照时间18h/d，光照强度2000lx，培养65d时将存活的原球茎转接到含60mg/L潮霉素的改良H26号培养基上，培养温度30℃，光照时间18h/d，光照强度2000lx，培养65d时将存活的原球茎转接到含50mg/L潮霉素(Hyg)的改良H26号培养基上进行恢复培养，培养温度30℃，光照时间18h/d，光照强度2000lx，培养65d筛选获得潮霉素抗性原球茎，经过4轮筛选出的潮霉素抗性原球茎再转入改良H26号培养基上，培养温度30℃，光照时间18h/天，光照强度2000lx，培养60d天后形成小苗。按如下公式计算转化率：转化率＝(小苗个数/用于筛选的原球茎个数)×100％。转化率为1.50％。
改良H26号培养基为：每升培养基含有花宝1号(Hyponex I)2g、蔗糖(sugar)20g、蛋白胨(peptone)3g、酪氨酸(tyrosine)3g、琼脂(agar)6g、活性炭(AC)2g、维生素B1 10mg、维生素B6 1mg、烟酸1mg、甘氨酸2mg、肌醇0.1mg、磷酸二氢钠(NaH2PO4)200mg、萘乙酸(NAA)1mg和椰子汁100mL，余量为水。
改良H26号培养基的配制方法是将2g花宝1号、20g蔗糖、3g蛋白胨、3g酪氨酸、6g琼脂、2g活性炭、10mg维生素B1、1mg维生素B6、1mg烟酸、2mg甘氨酸、0.1mg肌醇、200mg磷酸二氢钠、1mg萘乙酸和100mL椰子汁，加到少量水中，然后用水补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
4.抗性植株检测
对获得的小苗进行GUS染色、PCR检测和Southern blot检测。GUS染色均呈蓝色，PCR检测和Southern blot检测同时存在Gus A基因和CeFT基因，确定获得的小苗即为转基因兜兰植株。