一种识别人血清白蛋白的单域抗体的制作方法

本发明属于抗体技术领域，特别涉及一种识别人血清白蛋白的单域抗体。

背景技术：

目前，以抗体为基础的肿瘤靶向治疗常用的抗体是单链抗体或抗体fab段，与它们相比，单域抗体仅含有抗体重链的一个可变区，是最小的全功能性的抗原结合片段，免疫原性较弱；更易通过血管壁，由于没有fc段，不能与非靶标细胞的fc受体结合，能更集中到达病灶部位，因此容易进行基因工程操作。

蛋白质药物已成功广泛应用于临床治疗，许多蛋白质药物为一些疾病提供了有效和独特的治疗效果。然而大多数蛋白和多肽的的半衰期很短，一是因为蛋白质药物会被体内的蛋白酶降解而快速清除，二是由于肾小球的过滤作用是分子量小于60kd的药物在肾脏代谢中易被清除。为了达到有效的治疗效果，往往采用高剂量或多次、长时间用药，这样一方面会增加其毒副作用，同时也给患者用药带来极大的不便。

为了延长蛋白质药物在体内的半衰期，从而增强其药物的治疗效果，人们希望能延缓机体对蛋白质药物的降解清除作用。首先有人对蛋白质药物分子本身进行修饰，从而改变机体蛋白质降解清除系统对蛋白质药物的识别和蛋白酶分解作用。通过突变体的构建通常可以降低多肽对水解酶的敏感性，有效的延长多肽类生物药物的半衰期，但是很多半衰期较长的突变体会改变药物的活性。peg修饰可以在提高蛋白药物的稳定性的同时，降低其免疫原性，但是有影响多肽类生物药物的生物活性的潜在可能。

通过与具有较长半衰期的人体蛋白直接融合，是一种切实可行的延长药物半衰期的有效办法。人血清白蛋白是人体血液中的主要蛋白，是人体循环系统中含量最多的蛋白，也是人体内半衰期最长的蛋白，半衰期长达19天。它可以与一些药物分子结合，对药物分子提供保护作用，避免被机体过早降解清除掉，因此，它是一种理想的药物载体分子。

将葡萄球菌g蛋白的白蛋白功能结合区(albuminbindingdomain，abd)与fc受体融合在一起组成融合蛋白。该融合蛋白可与血液中的白蛋白特异性结合，并且fc受体在体内的半衰期大大延长。将人表皮生长因子受体2(her2)与abd一起制成融合蛋白也有相同的效果。但是hsa-多肽的融合方式大大增加了多肽类生物药物的分子量，给生产和转化带来了很多问题，分子量的增加也会改变药物的某些药代动力学特性，可能使其难以达到靶点所在位置，进而影响药效。

利用抗原抗体特异性结合的特点，将蛋白药物与人血清白蛋白的特异性抗体的结合功能区融合在一起制成融合蛋白，能够有效提高蛋白和多肽药物的半衰期。本专利利用噬菌体展示技术，在人源单域抗体库中筛选得到多株能够与hsa特异性识别的抗体。单域抗体仅含有抗体重链的一个可变区，是最小的全功能性的抗原结合片段，相较于单链抗体或抗体fab段分子量更小、免疫原性更弱，当其与hsa发生特异性结合就可以起到延长生物药物半衰期的功能。

技术实现要素：

本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种识别人血清白蛋白的单域抗体，可达到通过筛选得到具有高亲和力的单域抗体，能识别特异性的人血清白蛋白，延长生物药物半衰期，有利于生物药在治疗中的有益效果。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种识别人血清白蛋白的免疫球蛋白，所述免疫球蛋白氨基酸序列包括

互补决定区1(cdr1)氨基酸序列seqidno.1，互补决定区2(cdr2)氨基酸序列seqidno.2，和互补决定区3(cdr3)氨基酸序列seqidno.3；

互补决定区1(cdr1)氨基酸序列seqidno.4，互补决定区2(cdr2)氨基酸序列seqidno.5，和互补决定区3(cdr3)氨基酸序列seqidno.6；

互补决定区1(cdr1)氨基酸序列seqidno.7，互补决定区2(cdr2)氨基酸序列seqidno.8，和互补决定区3(cdr3)氨基酸序列seqidno.9。

所述单域抗体为单区抗体、重链变区和轻链变区中的任一种。

所述单域抗体氨基酸序列包括seqidno.10，seqidno.11，seqidno.12。

单域抗体或单域抗体的任一cdr氨基酸序列与fc的融合蛋白。

所述单域抗体包含权利要求1中所述互补决定区(cdr)中的一个或者两个以上的氨基酸序列，且至少与一个氨基酸序列最低具有79％同源性。

所述单域抗体的氨基酸序列包含权利要求3中所述框架(fr)中的一个或者两个以上的氨基酸序列，且至少与一个氨基酸序列最低具有90％同源性。

所述融合蛋白为使用权利要求1中任一所列氨基酸序列与一个或一个以上具治疗功能的多肽分子或片段融合在一起所制备所得。

所述融合蛋白可以由各功能多肽直接融合，也可通过接头肽连接的含1个或者1个以上治疗功能多肽分子融合蛋白。

一种核酸，可编码出上述的任一单域抗体的氨基酸序列。

一种载体，包含上述单域抗体、融合蛋白、多特异或多功能分子所对应的核酸序列，由于遗传密码子具有兼并性，该核酸序列可以根据不同的应用目的而不同。

一种蛋白质或多肽，该蛋白质或多肽可由上述氨基酸序列所对应的核酸序列以及上述核苷酸序列或者少部分序列可以通过合适的表达系统进行表达以得到相；上述表达系统包括细菌，酵母菌，丝状真菌，真核哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，或无细胞表达系统。

一种宿主细胞，其特征在于包含可表达上述的单域抗体、融合蛋白、多特异或多功能分子、核酸序列、载体或蛋白质或多肽的宿主细胞。

与现有技术相比，本发明所具有的有益效果是：本发明通过筛选得到具有高亲和力的单域抗体，能识别特异性的人血清白蛋白，延长生物药物半衰期，有利于对肿瘤的治疗。

附图说明

图1为本发明的三轮淘选后elisa检测及数据分析图；

a：elisa所有孔均包被抗原hsa；每孔中抗体各不相同。

b：数据分析纵坐标为各孔在650nm下的光吸收值，横坐标为96个孔，其中，1-8为a1、b1、c1、d1、e1、f1、g1、h1，9-16为a2、b2、c2、d2、e2、f2、g2、h2，依次类推，89-96为a12、b12、c12、d12、f12、f12、g12、h12。

图2为本发明的hsa单域抗体对hsa及igg特异性亲和力数据分析图；

从图1中选择33个阳性克隆做elisa检测每个单域抗体对hsa以及igg的亲和力，数据整理如图2。其中，纵坐标为650nm下的光吸收值，横坐标为33个单域抗体。每两个相邻的条形图中，左边表示抗原包被的是hsa，右边表示抗原包被的是igg。

图3为本发明的pet22b中表达的融合蛋白hb5-fc的sds-page图；

marker的条带从小到大依次为14，25，30，40，50，70，100，120，160kd。line1为还原态hb5-fc，大约43kd。

图4为本发明的融合蛋白hb5-fc对hsa的特异性识别的数据分析图；

图中纵坐标为650nm下的光吸收值，横坐标为两个纯化后的融合抗体，hb5为hb5-fc抗体，blank为非hsa的一种抗体。

图5为本发明的融合蛋白hf11-fc对不同抗原特异性识别的数据分析图；

图为elisa检测纯化后的hf11-fc融合蛋白对人血清白蛋白(hsa)，牛血清白蛋白(bsa)，山羊血清以及马血清四种抗原的亲和力。纵坐标为650nm下的光吸收值，横坐标为四种抗原，样品hf11-fc(-)表示不加一抗hf11-fc的对照；hf11-fc(+)，即表示加一抗hf11-fc。

图6为本发明的单域抗体在pet22b中融合表达fc的质粒图谱示意图；

单域抗体与fc之间noti酶切位点以及linker(g4s)，fc后使用xhoi限制性酶切。

图7为本发明的单域抗体在pcdna3.1中融合表达fc的质粒图谱示意图。

单域抗体与fc之间引入通过bamhi酶切位点，单域抗体前使用hindiii限制性内切酶，fc后使用xbai限制性酶切。单域抗体前有信号肽以及kozak序列。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施例对本发明作详细说明。

本发明的实施例公开了一种识别人血清白蛋白的单域抗体，通过三轮生物淘选，从噬菌体单域文库中筛选得到亲和力较高的抗体序列；将筛选得到的抗体序列克隆至原核/真核表达载体中，与人源fc融合表达，转染宿主细胞，获得抗体再进行体外亲和力的验证。

一种识别人血清白蛋白的单域抗体，所述抗体序列，其氨基酸序列如序列表所示，包括氨基酸序列seqidno.10，seqidno.11，seqidno.12。

一种蛋白质或多肽，所述框架区中的一个或者两个以上的氨基酸序列，且至少与一个氨基酸序列最低具有90％同源性。

一种蛋白质或多肽，包含所述互补决定区中的一个或者两个以上的氨基酸序列，且至少与一个氨基酸序列最低具有79％同源性。

一种核酸分子，该核酸的一部跟可编码为序列表中各序列，通过遗传密码子可以随时获得该核酸分子的具体序列，由于遗传密码子具有兼并性，该核酸序列可以根据不同的应用目的而不同。

一种蛋白质或多肽，该蛋白质或多肽可由核苷酸序列或者至少部分序列可以通过合适的表达系统进行表达以得到相应的蛋白质或多肽，上述表达系统包括细菌，酵母菌，丝状真菌，动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，或无细胞表达系统。

一种载体，该载体的一部分可为上述核酸序列。

融合蛋白也可以是单域抗体与一个或多个其他具治疗功能或识别功能的多肽融合制备的融合蛋白；融合方式可以直接融合，也可以通过接头肽连接。

核酸分子可以为编码各互补决定区或单域抗体或融合蛋白氨基酸序列的核苷酸序列，由于遗传密码子具有兼并性，该核酸序列可以根据不同的应用目的不同。该核酸分子可以在细菌，酵母菌，丝状真菌，哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，或无细胞表达系统等表达系统中表达出蛋白质。

一种宿主细胞，其特征在于包含可表达上述的单域抗体、融合蛋白、多特异或多功能分子、核酸序列、载体或蛋白质或多肽的宿主细胞。

实施例1筛选hsa的单域抗体

1.1单域抗体噬菌体文库制备

1.1.1辅助噬菌体(bm13)的制备

将m13ke噬菌体(购自neb#n0316s)复制子用alwni和afei(购自neb)双酶切，同时人工合成基因片段也用alwni和afei双酶切，然后用t4连接酶连接在一起。连接后转染tg1得到辅助噬菌体bm13。如此，原复制子中

tctggtggtggttctggtggcggctctgagggtggtggctctgagggtggcggttctgagggtggcggctctgagggaggcggttccggtggtggctct序列被人工合成基因序列所取代，即在噬菌体giii编码区域，添加了胰蛋白酶切割序列，一旦用作辅助噬菌体时，增加胰蛋白酶消化步骤，减少不含融合目的基因蛋白噬菌体的数目。

人工合成基因序列如下：

ccagccggcctttctgaggggtcgactatagaaggacgaggggcccacgaaggaggtggggtacccggttccgagggt

1.1.2噬菌体文库构建

1.1.2.1载体构建

将puc19(购自neb)用hindiii和ndei(购自neb)双酶切，加入基于dp47抗体序列(itomlinsonetal：jmb227：776，1992)的重链人工单域抗体序列。单域抗体表达框架中，单域抗体与giii蛋白融合，中间加入myc和vsv-g标签，用于纯化或鉴定，构建成噬菌体展示载体pbg3。

1.1.2.2ssdna模板制备

大肠杆菌菌株cj236(购自neb)缺乏功能性dutpase和uracil-nglycosylase，可以产生尿嘧啶化单链dna模板。将pbg3质粒转染进入cj236并涂布在含carbenicillin(50μg/ml)和chloramphenicol((15μg/ml)琼脂平板上，培养过夜。挑选平板上筛选出的单个菌落到3ml2×ty肉汤培养基中(含上述同样浓度的双抗)，37℃250rpm条件下培养过夜。次日取0.3ml过夜培养物加入30ml新鲜2×ty肉汤培养基中(carbenicillin50μg/ml)，持续3-4h培养，使od600＝0.4-0.6，加入辅助噬菌体(按细菌∶噬菌体个数比1∶10加入)，37℃150rpm1h，离心，将细菌沉淀重悬于60ml2×ty双抗培养基中，25℃250rpm培养22h，离心弃沉淀。含噬菌体的上清液用5％peg(peg800和300mmnacl调至浓度为5％)沉淀，然后重悬于pbs中，使用qiaprepspinm13试剂盒(购自qiagen)制备出ssdna。

1.1.2.3文库制备

文库制备用kunkel方法制备(kunkelta：pnas82：488，1985)cdr突变寡核苷酸链按下表合成：

olig_cdr1

ctgcgtctctcctgtgcagcctccggakwtansnttancnmtnasdhtrscnnttgggtccgccaggctccagggaa

olig_cdr2

gggtctagagtgggtatcarscnnkrnsvvwcgtagcggtagcacatactacgcagactccgtg

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gacaccgcggtatattattgcgcggrswnvsthtnnknnknnknnknnknnknnknnknnknnknnknnknnknnktggggtcagggaaccctggtcaccgtc

olig_cdr3b

cgaggacaccgcggtatattattgcgcggrswnvsthtnnknnknnknnknnknnknnknnknnktggggtcagggaaccctggtcaccgtcacc

寡核苷酸链的磷酸化

将人工合成的寡核苷酸链加入下列100ul50mmtris-hclph7.5(tris碱购自索莱宝，用盐酸调至ph7.5)含下列成份体系中：5ut4多核苷酸激酶，10mmmgcl2；1mmatp及5mmdtt，37℃1h后，磷酸化好的的寡核苷酸链用pcr纯化试剂盒(购自天根)纯化。

磷酸化寡核苷酸与ssdna退火结合

将磷酸化寡核苷酸和uracilatedssdna(磷酸化寡核苷酸∶ssdna＝3∶1，ssdna为1.1.2.2中制备所得)溶于含10mm，mgcl2的50mmtris-hcl，ph7.5缓冲液中，90℃2分钟后，降至25℃(每分钟降低1℃/min)。

dsdna合成

将下述材料加入退火结合的磷酸化寡核苷酸与ssdna复合物中：0.55mmatp；0.8mmdntps；5mmdtt；15ut4dna合成酶及15ut7dna合成酶，

20℃3h后，用qiaquickpcr纯化试剂盒(购自qiagen)纯化。将纯化后的dna待转化至电转感受态tg1中。

1.2bm13辅助噬菌体以及噬菌体文库的增值

bm13辅助噬菌体的增值

从基本琼脂培养基平板上挑取一个大肠杆菌tg1(购自武汉淼灵)的新鲜单菌落，接种到20ml2×ty培养基中，温和摇动，37℃培养至od600约为0.8备用。将1.1.1中制备的原始bm13辅助噬菌体用2×ty培养基制备一系列10倍稀释的bm13噬菌体。各稀释度分别取10μl与200μltg1(od600＝0.8)菌液混匀，振荡器温和震荡3s，并与上层琼脂培养基混匀，倾倒在预先平衡室温的ty平板上。转动平板以确保菌体和上层琼脂分布均匀。待上层培养基凝固后，于37℃生化培养箱倒置培养过夜。

次日挑选分离良好的单个噬菌体接种于装有2～3ml含25μg/ml卡那霉素的2×ty培养基的15ml培养管中。37℃，250rpm震荡培养12～16h。将感染上清液转移至1.5ml无菌微量离心管，在微量离心机上，以最大转速，4℃离心2min。上清液转移至新管中4℃保存。

噬菌体文库的增值

将制备好的噬菌体文库接种至100ml含60μg/ml氨苄青霉素的2×ty培养基中，37℃，250rpm震荡培养至od600为0.8时，加入bm13至浓度为2×107pfu/ml。37℃，300rpm培养1h，加入25μg/ml卡那霉素，37℃继续培养14～18h。将菌液离心，上清液用5％peg沉淀，然后重悬于5％mpbs中备用。

1.3筛选hsa的单域抗体

1.3.1生物淘选

将hsa直接包被免疫管，室温2h。pbst及pbs洗2～3次。mpbs封闭2h，pbst及pbs洗2～3次。将噬菌体文库加入免疫管中，室温孵育2h。

移走未结合文库，用pbst及pbs各洗免疫管10次。向免疫管中加入0.01％胰酶溶液，室温孵育1h。得胰酶洗脱液。

将胰酶洗脱液加入到30mltg1(od600＝0.5)中，按1.2中方法增值第一次洗脱文库。

如此进行第二轮、第三轮淘选。挑取三轮淘选后所得的单菌落至96孔板中。按1.2中文库增值方法制备出培养物上清液。

1.3.2elisa鉴定

取一定量上清液做elisa鉴定。见图1a。

elisa步骤如下：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜；次日洗涤3次；加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1h，洗涤；加入新鲜稀释的酶标二抗(辣根过氧化物酶hrp标记的抗噬菌体的二抗，1∶5000)0.1ml，37℃孵育60min，洗涤；最后一遍用ddw洗涤。于各反应孔中加入临时配制的tmb底物溶液0.1ml，37℃10～30min。用高级读板机在650nm波长下读板。

各孔光吸收值如图1b。

其中，a：elisa所有孔均包被抗原hsa；每孔中抗体各不相同。b：数据分析纵坐标为各孔在650nm下的光吸收值，横坐标为96个孔，其中，1-8为a1、b1、c1、d1、e1、f1、g1、h1，9-16为a2、b2、c2、d2、e2、f2、g2、h2，依次类推，89-96为a12、b12、c12、d12、e12、f12、g12、h12。

从图1中选择33个阳性克隆做elisa，检测每个单域抗体对hsa以及igg的亲和力，数据整理如图2。其中，纵坐标为650nm下的光吸收值，横坐标为33个单域抗体。蓝色条形抗原包被的是hsa，绿色条形抗原包被的是igg。

选择图2中对hsa亲和力较高，且对igg亲和力低(a650≤0.3)的克隆进行测序，得到多个不同的氨基酸序列，seqidno.10(hb5)，seqidno.11(he9)，seqidno.12(hf11)。

实施例2、融合蛋白hb5-fc的表达

将单域抗体基因通过noti和linker(g4s)与人源fc连接在一起，前后分别用ncoi和xhoi限制性内切酶克隆到pet22b上，质粒图谱见图6。

将构建好的载体转化至e.coli/de3中，第二天挑单克隆，37℃220rpm震荡培养至od600约0.5时，加入iptg(工作浓度为1mm)后，18℃220rpm诱导表达20h。收集菌体后，用pbs(ph7.4)重悬均匀后超声破碎。超声破碎条件：600w，超声2sec，间隔6sec，共10min，16℃。超声后4℃12000rpm离心10min。

其中，hb5-fc的超声清液用proteina纯化后跑sds-pag，见图3。marker的条带从小到大依次为14，25，30，40，50，70，100，120，160kd。line1为还原态的hb5-fc，大约43kd。

将纯化后的hb5-fc做elisa检测其对hsa的结合能力。其中，elisa抗原均包被hsa，一抗样品分别选hb5-fc以及一种非hsa抗体(blank)，二抗用山羊抗人igg1∶5000。酶标板加入tmb20min后用高级读板机在650nm波长下读板，数据整理如图4。纵坐标为650nm下的光吸收值，横坐标为两个样品。

结果显示，pet22b表达的融合抗体hb5-fc能结合hsa。

实施例3融合蛋白hf11-fc识别hsa的特异性检测

为了制备出稳定的抗体，单域抗体基因融合人源fc，并在抗体前面引入kozak序列以及信号肽后克隆到pcdna3.1上，质粒图谱见图7。单域抗体与fc之间引入通过bamhi酶切位点，单域抗体前使用hindiii限制性内切酶，fc后使用xbai限制性酶切。

将该重组质粒瞬时转染到293f中，培养4天后离心，收集上清液，并用proteina纯化。

elisa检测纯化后的hf11-fc融合蛋白对人血清白蛋白(hsa)，牛血清白蛋白(bsa)，山羊血清(含山羊血清白蛋白)以及马血清(含马血清白蛋白)的亲和力。elisa数据整理如图5。其中，hf11-fc(-)表示不加一抗，只加二抗；hf11-fc(+)表示加一抗hf11-fc融合蛋白，加二抗。

结果显示，pcdna3.1中表达的融合抗体hf11-fc能特异性结合hsa，且不结合bsa，对山羊血清也不结合，对马血清具有微弱程度的结合。

本发明所叙述的一些术语具有如下含义：

同源性：描述两个或更多氨基酸序列相似程度，第一个氨基酸序列和第二个氨基酸序列之间同源性的百分比可以通过公式：(第一个氨基酸序列中与第二个氨基酸序列中相应位置处的氨基酸序列相同的氨基酸残基的数量)/(第一个氨基酸序列中氨基酸总数)*100％来计算，其中第二个氨基酸序列只能够的某个氨基酸的缺失、插入、替换或添加(与第一个氨基酸相比)被认为是有差别。同源性百分比也可以利用已知的用于序列匹配的计算机运算程序如ncbiblast获得。密码子，又称三联体密码子，指对应于某种氨基酸的核苷酸三联体。在转译过程中决定该种氨基酸插入生长中多肽链的位置。

以上通过实施例对本发明进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的示例性实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。本发明的保护范围由权利要求书限定。凡利用本发明所述的技术方案，或本领域的技术人员在本发明技术方案的启发下，在本发明的实质和保护范围内，设计出类似的技术方案而达到上述技术效果的，或者对申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖保护范围之内。

sequencelisting

<110>天津天锐生物科技有限公司

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