用于悬浮细胞的小规模养殖方法与流程

本发明涉及小规模细胞培养系统，其模拟了悬浮细胞的大规模灌注培养物。本发明特别提供了用于养殖细胞的方法，其中使用细胞沉淀从培养介质分离细胞，用于替换部分培养介质。该方法可以用于模拟大规模细胞培养，并用于筛选培养条件和用于大规模细胞培养的细胞克隆。
背景技术：
：重组蛋白质的生产是目前生物技术工业的主要方面。随着市场上需要大量高品质蛋白质的应用数量的增加，重组蛋白质的生产越来越重要。食品生产，特别是药物学是其中对重组蛋白质的需要稳定增加的2个主要领域。获得市售可得的工艺需要更高的生产效率及终产物的更低成本。但是，高的产品品质和与人类应用的相容性是同时必需的。越来越多的应用需要在真核细胞中，特别是在更高级的真核细胞中重组生产蛋白质。特别是当在原核细胞系统(例如大肠杆菌(E.coli))或真核细胞系统(例如特别是人细胞系)中表达携带翻译后修饰(例如糖基化)的蛋白质(糖蛋白)时。在许多情况下，这些差异明显地影响了所生产的蛋白质的生物活性以及免疫原性。然而，许多使用更高级的真核细胞系的表达系统都受困于所需蛋白质的相当低的表达率，导致重组蛋白质的低产率和高成本。为了改善在真核细胞中生产重组蛋白质的产率和品质(包括它们翻译后修饰的特征)，优化了多种培养条件，并测试了大量的细胞克隆。在大规模细胞培养物中操作这种筛选工艺是非常昂贵的并且是繁琐的，其中所述大规模细胞培养物用于重组蛋白质的后期生产。因此，此类筛选工艺通常以小规模培养物实施。但是，这种小规模培养物通常在它们的行为上与它们将要模拟的大规模培养物明显不同。当转变成大规模时，在小规模培养中建立的培养条件和细胞克隆证明不是最佳的。可信赖的按比例缩小的模式对于高效快速的生物工艺研发是重要的。重要的操作(例如介质或工艺的优化和克隆筛选)通常不是在工艺条件下实施的，这是因为诸如操作的高成本或低生产量之类的多种原因。生物处理的主要任务是发现合适的按规模缩小的模型，其尽可能最佳地代表了更大的规模。可利用的按规模缩小的系统必须主要地使重要参数与大规模以及介质与高生产量达到令人满意的可比性。先进的微生物反应器(ambr)系统代表了这种按规模缩小的工具，其具有优于更大规模的生物反应器的再现性(Hsuetal.(2012)Cytotechnology64:667-678)。ambr系统由工作体积为10至15ml的一次性容器、液体处理机器人以及测量氧饱和度(DO)和在线pH的监测仪组成。生产量限于24或48个容器，这取决于装置设备。ambr系统广泛地用作分批和分批供料养殖的按规模缩小的模型。但是，灌注培养是不可行的。1L台式生物反应器被认为是用于灌注培养的最小的按规模缩小单位(Shimonietal.(2014)BioProcessInt12:54-61)。研发更小规模的灌注系统的障碍是细胞保持装置的按规模缩小。典型的细胞保持装置在Voisardetal.(2003)BiotecholBioeng82:751-765中有所讨论，并且基于过滤或离心的机制需要过多的死体积，以至于小体积的生物反应器不能高效地工作。在灌注细胞培养开始时，研究沉淀作为细胞分离方法，并且进一步的研发得到外部装置，例如倾斜沉降器。尽管是强力的并且产生小的剪切应力，但是细胞残留在生物反应器的外部，面对不所需的条件，例如更低的温度或不足的氧供应(Voisardetal.(2003)BiotecholBioeng82:751-765)。因此，本领域需要提供以小规模高效地模拟大规模细胞培养的方法，用于筛选目的，特别是在使用真核表达细胞系时。发明概述如本发明所证明，可以使用搅动的细胞培养物以小规模高效地模拟在悬液中真核细胞的灌注培养物，其中在某段时间间隔后，将部分介质更换成新鲜介质。细胞保留在培养物中是通过细胞沉淀然后除去培养介质而实现的。培养物中的细胞浓度，细胞活力，并且特别是生产的糖蛋白的糖基化模式在小规模细胞培养与其模拟的大规模灌注培养之间高度地相似。因此，在第一个方面中，本发明提供了用于在悬液中养殖细胞的方法，其包括：(a)提供细胞培养物；(b)在细胞培养物中养殖细胞，其中搅动所述细胞培养物；(c)停止对所述细胞培养物的搅动；(d)在所述细胞培养物中细胞至少部分沉淀后，除去所述细胞培养物的部分培养介质；以及(e)向所述细胞培养物中加入新鲜培养介质。在第二个方面中，本发明提供了用于模拟在悬液中细胞的大规模灌注培养的方法，其包括：(a)提供小规模细胞培养物，其培养物体积为所述大规模灌注培养物的10％或更少；(b)使用待模拟的所述大规模灌注培养的一个或多个培养条件，在所述小规模细胞培养物中养殖细胞，其中搅动所述小规模细胞培养物；(c)停止对所述小规模细胞培养物的搅动；(d)在所述小规模细胞培养物中细胞至少部分沉淀后，除去所述小规模细胞培养物的部分培养介质；以及(e)向所述小规模细胞培养物中加入新鲜培养介质。在第三个方面中，本发明提供了用于筛选在悬液中细胞的大规模灌注培养的培养条件和/或细胞克隆的方法，其包括：(a)提供小规模细胞培养物，其培养物体积为所述大规模灌注培养物的10％或更少；(b)在所述小规模细胞培养物中养殖细胞，其中搅动所述小规模细胞培养物；(c)停止对所述小规模细胞培养物的搅动；(d)在所述小规模细胞培养物中所述细胞至少部分沉淀后，除去所述小规模细胞培养物的部分培养介质；以及(e)向所述小规模细胞培养物中加入新鲜培养介质；其中所述单独的小规模细胞培养物在待筛选的培养条件和/或细胞克隆方面是不同的。通过下文的描述和所附的权利要求书，本发明的其他目的、特征、优点和方面对于本领域的那些技术人员而言将显而易见。但是应该理解的是，表明为本申请的优选的实施方案的以下描述、所附的权利要求书和具体的实施例仅以示例的方式给出。在本发明公开的精神和范围内的多种改变和修改通过阅读以下内容对于本领域那些技术人员而言将变得显而易见。发明详述本发明涉及用于以小规模在悬液中养殖细胞的方法。这些养殖方法可以用于模拟在悬液中细胞的大规模灌注培养。此外，用于测定合适的培养条件和细胞克隆的筛选方法可以使用所述养殖方法实施。在第一个方面中，本发明提供了用于在悬液中养殖细胞的方法，其包括：(a)提供细胞培养物；(b)在细胞培养物中养殖细胞，其中搅动所述细胞培养物；(c)停止对所述细胞培养物的搅动；(d)在所述细胞培养物中所述细胞至少部分沉淀后，除去所述细胞培养物的部分培养介质；以及(e)向所述细胞培养物中加入新鲜培养介质。步骤(a)中提供的细胞培养物为悬浮细胞培养物，其优选地在装配有用于搅动细胞培养物的工具的生物反应器中提供。用于搅动细胞培养物的工具可以特别为叶轮，例如斜叶式叶轮。生物反应器可以进一步装配有向细胞培养物提供气体和/或液体的工具，以及测量细胞培养的一个或多个培养条件的工具。所述培养条件可以包括细胞培养物的温度、pH值、氧浓度、营养物浓度和二氧化碳浓度。为了细胞培养的自动化操作，生物反应器进一步装配有能够控制氧和/或营养物的供给、细胞培养的温度和/或pH值的控制单元。控制单元可以根据细胞培养中测量的一个或多个培养条件的值而自动控制这些参数的一个或多个。用于各个培养条件的所需的值或范围可以通过操作仪预设置。用于根据本发明的方法的合适生物反应器为theAdvancedMicrobioreactor(AMBR)seriesTABBiosystems/Sartorius的微生物反应物，特别是AMBR24或AMBR15。在某些实施方案中，可以使用小规模的细胞培养物。根据本发明，小规模的细胞培养物特别具有250ml或更小、特别是100ml或更小、50ml或更小、25ml或更小、或者12.5ml或更小的培养物体积。小规模细胞培养物的体积特别在1ml至200ml、特别是2ml至150ml、3ml至100ml、5ml至75ml、7ml至50ml、8ml至30ml、或者9ml至20ml的范围内。在具体的实施方案中，小规模细胞培养物的体积为10ml至15ml，特别是大约12ml。细胞培养物中的细胞特别为悬浮细胞，即，能够在悬液中生存和/或增殖的细胞。具体而言，细胞不必为了生存和/或增殖而附着在任何固体表面上。在具体的实施方案中，细胞为真核细胞。在某些实施方案中，细胞为永生化人类血细胞，例如髓系白血病来源的永生化人类细胞。髓系白血病来源的具体人类细胞为K562细胞及其衍生的细胞，例如NM-F9、NM-D4、NM-H9D8、NM-H9D8-E6、NMH9D8-E6Q12、GT-2X、GT-5s和它们衍生的细胞。K562是存放于美国典型培养物保藏中心(ATCCCCL-243)的人类髓系白血病细胞系。其他的细胞系衍生自K562细胞，并且针对特定的糖基化特征进行选择。衍生自K562的细胞系可以养殖并保持在适用于K562的公知的条件下。除了K562细胞以外的所有这些细胞系都是根据布达佩斯条约保藏的。关于保藏的信息可以在说明书末尾找到。在另一个实施方案中，细胞为CHO细胞。在具体的实施方案中，细胞培养物中的细胞产生目的生物分子。细胞可以重组地产生目的生物分子。在某些实施方案中，目的生物分子是蛋白质，特别是糖蛋白，例如抗体。在步骤(b)中，在细胞培养物中养殖细胞。细胞培养的培养条件通常加以选择，以便适应于待养殖的细胞。在某些实施方案中，在大约37℃的温度，具体为33℃至40℃、特别是35℃至38℃的范围内养殖细胞。此外，在某些实施方案中，在大约7.1的pH值，具体为6.5至7.7，特别是6.7至7.5范围，具体地是6.9至7.3的pH值养殖细胞。细胞培养物中的细胞密度可以为至少1x104细胞/ml，具体为至少5x104细胞/ml或至少1x105细胞/ml。细胞密度特别是在大约1x105细胞/ml至大约5x105细胞/ml的范围内，具体为大约2x105细胞/ml至大约3x105细胞/ml。在具体的实施方案中，培养介质中的氧浓度为至少10％，具体为至少20％，特别是10％至80％，具体为20％至60％的范围。在某些实施方案中，在细胞养殖过程中，控制培养介质中的pH值和/或氧浓度。如果pH值处于所需范围以外，可以通过加入二氧化碳或NaOH进行pH值的控制。加入二氧化碳以降低pH值，即，在pH值过高的情况下，并且加入NaOH以升高pH值，即，在pH值过低的情况下。可以通过控制通入培养介质中的氧的量进行氧浓度的控制。在特定的实施方案中，对细胞培养物供给氧。在细胞的养殖过程中，搅动细胞培养物。在特定的实施方案中，使用叶轮搅动细胞培养物。可以使用适用于搅动细胞培养物的任何叶轮，特别是斜叶式叶轮。应该根据所用的生物反应器和养殖细胞来调节搅动速度。例如在具有例如大约5ml至50ml体积的小规模细胞培养物中，叶轮的搅动速度在大约500rpm至大约2000rpm，例如750rpm至1500rpm的范围内。在步骤(c)中，停止对细胞培养物的搅动。在某些实施方案中，将细胞在步骤(b)中在搅动下养殖至少1h，然后在步骤(c)中停止搅动。具体而言，将细胞在搅动下养殖至少1.5h、至少2h、至少2.5h或至少3h。在某些实施方案中，将细胞在搅动下养殖至少8h、至少10h、至少11h或至少12h。在停止搅动后，使细胞沉淀。细胞的沉淀可以发生然后在步骤(d)中除去部分培养介质之前至少30min。在某些实施方案中，沉淀发生至少35min，具体为至少40min或至少45min。特别地，可以使细胞沉淀30min至45min的时间，具体为大约40min。在某些实施方案中，根据培养的细胞的行为来调节沉淀时间。具体而言，沉淀时间足够长，从而允许细胞培养物中至少75％、具体为至少90％、至少95％或至少99％的细胞下沉至培养容器的75％以下，具体为培养容器的一半以下，特别地至培养容器的底。在具体的实施方案中，细胞沉淀在不加入或存在诱导或增强细胞的沉淀的任何工具或物质的情况下发生。在具体的实施方案中，停止对pH值的控制和/或对氧浓度的控制，然后停止步骤(c)中对细胞培养物的搅动。具体而言，停止pH值和氧浓度的控制。pH值的控制和/或氧浓度的控制可以停止至少5min，特别是至少10min或者至少15min，然后停止在步骤(c)中对细胞培养物的搅动。在另一个实施方案中，在停止步骤(c)中的搅动之后的细胞沉淀发生35min或更少。使用更短的沉淀时间，在沉淀结束时，并非细胞培养物中所有的细胞都将下沉至底。当在步骤(d)中除去部分培养介质时，在这种实施方案中，除去的培养介质将包含大量的细胞。因此，通过除去部分培养介质实现细胞流失(cellbleeding)。由此，控制细胞密度并将这些细胞保持在增殖期。在这些实施方案中，在步骤(d)中，还可以除去细胞培养物中的部分细胞，以实现细胞流失。具体而言，调节沉淀时间，使得可以使用在步骤(d)中除去的培养介质来除去细胞培养物中大约1％至大约25％，具体为大约2％至大约20％，大约5％至大约15％，大约7.5％至大约12.5％细胞。在具体的实施方案中，在步骤(c)中停止搅动后的细胞沉淀发生30min或更少、25min或更少、或者20min或更少，然后在步骤(d)中除去部分培养介质。具体而言，在步骤(c)中停止搅动后的细胞沉淀发生大约15min至大约35min，特别是大约20min至大约30min，然后在步骤(d)中除去部分培养介质。在步骤(d)中，除去细胞培养物的部分培养介质。在某些实施方案中，除去大约10％至大约75％的培养介质。具体而言，在步骤(d)中，除去大约50％至大约50％，特别是大约20％至大约30％，并且具体为大约25％的培养介质。优选的是，在步骤(d)中从细胞培养物的顶除去培养介质。在其中预计不产生细胞流失的实施方案中，在步骤(d)中除去的培养介质具体包含细胞培养物中低于10％，特别是低于5％，低于2.5％或者具体地低于1％的细胞。在步骤(e)中，将新鲜培养介质加入细胞培养物中。在具体的实施方案中，在步骤(e)中加入的新鲜培养介质的量与在步骤(d)中除去的培养介质的量大致相同。具体而言，在步骤(e)中加入的培养介质的量是在步骤(d)中除去的培养介质的量的75％至125％，特别是90％至110％或者95％至105％，具体为大约100％。在具体的实施方案中，步骤(b)至(e)重复一次或多次。具体而言，将细胞养殖某一段时间，并且在特定的时间间隔后，停止搅拌，使细胞沉淀，除去部分培养介质，加入新鲜培养介质，并再次开始搅动。然后，包含步骤(b)至(e)的这种循环再次开始。在某些实施方案中，在步骤(e)后，将细胞在搅动下养殖至少1h，然后在下一循环的步骤(c)中停止搅动。具体而言，将细胞在搅动下养殖至少1.5h、至少2h、至少2.5h或至少3h。在某些实施方案中，将细胞在搅动下养殖至少8h、至少10h、至少11h或至少12h。本发明所述方法可以包括至少一个循环/天，具体为至少2、至少3或至少4个循环/天，直至例如8个循环/天。在第二个方面中，本发明提供了用于模拟在悬液中细胞的大规模灌注培养的方法，其包括：(a)提供小规模细胞培养物，其培养物体积为所述大规模灌注培养物的10％或更少；(b)使用待模拟的所述大规模灌注培养的一个或多个培养条件，在所述小规模细胞培养物中养殖细胞，其中搅动所述小规模细胞培养物；(c)停止对所述小规模细胞培养物的搅动；(d)在所述小规模细胞培养物中所述细胞至少部分沉淀后，除去所述小规模细胞培养物的部分培养介质；以及(e)向所述小规模细胞培养物中加入新鲜培养介质。待模拟的所述大规模灌注培养的一个或多个培养条件(其用于在小规模细胞培养中养殖细胞)具体可以选自培养介质或具体的培养介质的组分、温度、pH值、氧浓度、细胞密度、细胞营养物的加入(包括加入时间和培养介质中营养物的目标浓度)、培养时间、具体的功率输入、气体供入速度、灌注速度以及培养介质的渗透压。小规模细胞培养不能模拟大规模关注培养的培养物体积。在具体的实施方案中，小规模细胞培养不模拟从在大规模灌注培养中使用的待除去的培养介质中分离细胞的方法。小规模细胞培养模拟大规模灌注培养具体是指在小规模细胞培养中观察到的某些性质和特征相似地存在于大规模灌注培养中。因此，可以在小规模细胞培养中测试特定的培养条件和/或细胞克隆。如果这些培养条件和/或细胞克隆证明是有利的，则它们可以用于大规模培养中。在某些实施方案中，对于选自细胞生长、细胞活力或细胞密度的一个或多个性质和/或特征，通过小规模细胞培养来模拟大规模灌注培养。在其中细胞产生目的生物分子(具体为糖蛋白)的实施方案中，通过小规模细胞培养模拟的大规模灌注培养的性质和/或特征可以进一步包括目的生物分子的产率、细胞的生产率、目的生物分子的生产的稳定性以及目的生物分子的品质，包括具体而言在糖蛋白的情况下，包括生物分子的一个或多个糖基化特征。糖基化特征特别包括糖基化的相对量，即，在糖蛋白中糖基化位点被聚糖结构占据的百分率；聚糖结构的类型的相对量，即，附着至糖蛋白的所有聚糖结构为特定类型的聚糖结构的百分率，所述特定类型的聚糖结构例如复杂型N-聚糖；不同单糖的相对量，即，附着至糖蛋白的聚糖结构中所有单糖为特定种类的单糖的百分率，所述特定种类的单糖例如半乳糖、岩藻糖、唾液酸、N-乙酰基葡萄糖胺和甘露糖；以及特定的糖基化基序的相对量，即，所有聚糖结构展现出特定的糖基化基序的百分率，所述特定的糖基化基序例如核心岩藻糖、二分的N-乙酰基葡萄糖胺、至少一个半乳糖残基、至少两个半乳糖残基、至少一个唾液酸残基、至少两个唾液酸残基以及单触角结构、双触角结构、三触角结构或四触角结构聚糖。在某些实施方案中，用于模拟大规模灌注培养的方法在步骤(e)后包括其他的步骤(g)：(g)使用在步骤(b)中使用的一个或多个培养条件，提供在悬液中细胞的大规模灌注培养。在步骤(g)中提供的所述大规模灌注培养是通过本发明的方法模拟的大规模灌注培养，并且使用在步骤(b)中使用的待模拟的所述大规模灌注培养的一个或多个培养条件。在第三个方面中，本发明提供了筛选用于在悬液中细胞的大规模灌注培养的培养条件和/或细胞克隆的方法，该方法包括：(a)提供小规模细胞培养物，其培养物体积为所述大规模灌注培养物的10％或更少；(b)在所述小规模细胞培养物中养殖细胞，其中搅动所述小规模细胞培养物；(c)停止对所述小规模细胞培养物的搅动；(d)在所述小规模细胞培养物中所述细胞至少部分沉淀后，除去所述小规模细胞培养物的部分培养介质；以及(e)向所述小规模细胞培养物中加入新鲜培养介质；其中所述单独的小规模细胞培养物在待筛选的培养条件和/或细胞克隆方面是不同的。在步骤(a)中，提供了2种或更多种小规模细胞培养物。具体而言，提供了至少3、至少4、至少5、至少8或至少10种小规模细胞培养物。在具体的实施方案中，未筛选的一种或多种，具体为所有的培养条件在小规模细胞培养之间是相似的或相同的。可以筛选的合适的培养条件具体而言包括选自以下的那些：培养介质或具体的培养介质的组分、温度、pH值、氧浓度、细胞密度、细胞营养物的加入(包括加入时间和培养介质中营养物的目标浓度)、培养时间、具体的功率输入、气体供入速度、灌注速度以及培养介质的渗透压。在其中所述方法用于筛选大规模关注培养的细胞克隆的实施方案中，在不同的小规模细胞培养物中使用的不同的细胞克隆具体而言衍生自相同的亲代细胞。在其中所述细胞以重组方式产生目的生物分子的情况下，不同的克隆特定地产生相同的生物分子，并且具体而言可以通过相同的转染试验获得。在具体的实施方案中，筛选用于在悬液中细胞的大规模灌注培养的培养条件和/或细胞克隆的方法在步骤(e)后包括其他的步骤(f)：(f)选择所筛选的培养条件和/或细胞克隆，它们提供了大规模灌注培养的所需的性质和/或特征。大规模灌注培养的所需的性质和/或特征具体而言可以选自细胞生长、细胞活力和细胞密度。在其中细胞产生目的生物分子(具体为糖蛋白)的实施方案中，大规模灌注培养的性质和/或特征可以进一步包括目的生物分子的产率、细胞的生产率、目的生物分子的生产的稳定性以及目的生物分子的品质，包括具体而言在糖蛋白的情况下，生物分子的一个或多个糖基化特征。示例性的糖基化特征如上文所述。在某些实施方案中，筛选用于在悬液中细胞的大规模灌注培养的培养条件和/或细胞克隆的方法在步骤(f)后包括其他的步骤(g)：(g)使用在步骤(f)中选择的培养条件和/或细胞克隆，提供在悬液中细胞的大规模灌注培养。在某些实施方案中，在步骤(g)中提供的大规模灌注培养物的其他培养条件与未筛选的小规模细胞培养物的培养条件相似或相同(在可能的情况下)。在大规模灌注培养和小规模细胞培养之间相似或相同的合适的培养条件具体而言包括选自以下的那些：培养介质或具体的培养介质的组分、温度、pH值、氧浓度、细胞密度、细胞营养物的加入(包括加入时间和培养介质中营养物的目标浓度)、培养时间、具体的功率输入、气体供入速度、灌注速度以及培养介质的渗透压。在某些实施方案中，筛选用于在悬液中细胞的大规模灌注培养的培养条件和/或细胞克隆的方法包括其他的步骤(h)：(h)测定一种或多种小规模细胞培养是否具有大规模灌注培养所需的性质和/或特征。步骤(h)具体而言可以在步骤(e)和(f)之间实施。在步骤(h)中测定的性质和/或特征可以是上文针对步骤(f)所述一种或多种性质和/或特征。用于测定性质和/或特征的工具和方法是本领域任一技术人员已知的。在其中重复一次或多次步骤(b)至(e)的实施方案中，在各循环过程中还可以实施步骤(h)。备选地，在进行了若干次循环后，可以一次或多次实施步骤(h)。在某些实施方案中，大规模灌注培养物的体积为至少1升，优选为至少2升，至少5升或至少10升。在具体的实施方案中，大规模灌注培养物的体积为至少10升或至少100升。在这方面中，灌注具体而言是指在养殖过程中，细胞培养物的部分培养介质被更换成新鲜培养介质。因此，灌注培养不同于分批培养。大规模灌注培养中的灌注可以通过任何已知的工具实施，具体而言，通过使用过滤或离心系统实施。合适的过滤系统是中空纤维过滤器，特别是在交替切向流(ATF)系统中使用的。对于离心系统，具体而言可以使用连续离心机。在具体的实施方案中，小规模细胞培养物的体积为大规模灌注培养物的7.5％或更低，具体而言是为大规模灌注培养物的5％或更低、2.5％或更低、1.5％或更低、或者甚至1％或更低的培养物体积。在某些实施方案中，小规模细胞培养物具有的培养物体积甚至为大规模灌注培养物的0.5％或更低，具体而言为0.25％。本发明所述用于在悬液中养殖细胞的方法的特征和实施方案还类似地应用于模拟在悬液中细胞的大规模灌注培养的方法，以及用于筛选在悬液中细胞的大规模灌注培养的培养条件和/或细胞克隆的方法。在另一个方面中，本发明涉及小规模细胞培养用于模拟在悬液中细胞的大规模灌注培养的用途，其中所述小规模细胞培养的操作包括以下步骤：(a)提供小规模细胞培养物，其培养物体积为所述大规模灌注培养物的10％或更少；(b)使用待模拟的所述大规模灌注培养的一个或多个培养条件，在所述小规模细胞培养物中养殖细胞，其中搅动所述小规模细胞培养物；(c)停止对所述小规模细胞培养物的搅动；(d)在所述小规模细胞培养物中所述细胞至少部分沉淀后，除去所述小规模细胞培养物的部分培养介质；以及(e)向所述小规模细胞培养物中加入新鲜培养介质。在另一个方面中，本发明提供了小规模细胞培养用于筛选在悬液中细胞的大规模灌注培养的培养条件和/或细胞克隆的用途，其中小规模细胞培养的操作包括以下步骤：(a)提供小规模细胞培养物，其培养物体积为所述大规模灌注培养物的10％或更少；(b)在所述小规模细胞培养物中养殖细胞，其中搅动所述小规模细胞培养物；(c)停止对所述小规模细胞培养物的搅动；(d)在所述小规模细胞培养物中所述细胞至少部分沉淀后，除去所述小规模细胞培养物的部分培养介质；以及(e)向所述小规模细胞培养物中加入新鲜培养介质。在某些实施方案中，使用超过一种小规模细胞培养物，并且单独的小规模细胞培养物在待筛选的培养条件和/或细胞克隆是不同的。本发明所述方法的特征和实施方案还类似地适用于小规模细胞培养物的用途。如本文所用，表达“包含”除了其文字含义以外，还包括并且具体是指表达“基本由……组成”和“由……组成”。因此，表达“包含”是指这样的实施方案，其中“包含”具体列举的元素的主题不包含其他的元素以及实施方案，其中“包含”具体列举的元素的主题可以和/或实际上不包含该其他的元素。同样地，表达“具有”应该理解为表达“包含”，还包括并且具体是指表达“基本由……组成”或“由……组成”。本发明所述数字范围包含定义范围的数字。本发明提供的标题不限于本发明的多个方面或实施方案，可以参照整个说明书来阅读本发明。根据一个实施方案，本发明所述主题(在方法的情况下包含某些步骤，或者在组合物的情况下包含某些组分)是指由多个步骤或组分组成的主题。优选的是选择并结合本发明所述具体方面和实施方案，并且由具体实施方案的各种组成形成的具体主题也属于本发明公开。附图简述图1示出在沉淀过程中(直到40min)和培养介质更换并再次开始搅动后(在41min的值)，髓系白血病来源的永生化人类血细胞(A+B)和CHO细胞(C+D)的活细胞浓度(A+C)和活力(B+D)。图2示出对于连续搅动的和不连续搅动的产抗体克隆而言，沉淀对生产率(A)和葡萄糖(B-C)/谷氨酰胺(D-E)代谢的影响。将细胞养殖11小时。对沉淀的细胞停止搅动(方块)，但是对对照细胞(圆形)不停止(误差柱为s.d.,n＝3)。图3示出12mL基于沉淀的ambr养殖物(5轮)、1L灌注培养物(7轮)和重组产生IgG抗体的克隆3(GEX细胞系)的10L一次性生物反应器培养物的活细胞浓度(A)、活力(B)和产物糖基化(C)。示出平均值±SEM(A-B)和平均值±SD(C)。所有规模的培养条件(DO、pH、温度、介质)都是相当的。(D)中示出在10mL基于沉淀的ambr养殖物和1L至1000L标准养殖物中产生不同IgG抗体的不同克隆的产物糖基化。此外，示出12mL基于沉淀的ambr养殖物(2轮)、不锈钢生物反应器中的200Lcentritech灌注培养物和重组地产生IgG抗体的克隆4(GEX细胞系)的1000L一次性灌注生物反应器培养物的活细胞浓度(E)和活力(F)。所有规模的培养条件(DO、pH、温度、介质)都是相当的。图4示出分批模式的12mL规模ambr培养物(白色)、灌注模式的小规模ambr培养物(红色)和1L规模培养物(灰色、黑色)中，由克隆1(A)和克隆2(B)产生的IgG抗体的岩藻糖基化程度。图5示出在ambr系统中利用基于沉淀灌注的CHO细胞培养物的细胞浓度(A)和活力(B)。实施例实施例1：在微生物反应器系统中的养殖在ambrTM(改进的微生物反应器)系统(TAPBiosystems/Sartorius)中实施微生物反应器养殖。ambr系统可以以24位或48位使用。在所述工作中，仅使用24位，其由2个培养站(culturestation)组成，每个培养站都容纳12个容器。每个容器装配有直径为11mm的斜叶式叶轮。每90秒通过每个容器底部的光斑来测量pH和DO。每个容器单独供入氮气(或空气)、氧气(维持DO)、二氧化碳(降低pH)和这些气体的混合物。将容器再次灭菌，并且可以使用或不使用喷射管。对于人类髓系白血病衍生细胞(GEX细胞)的养殖而言，使用非喷射容器。根据应用使用或不使用喷射管养殖CHODG44细胞。对于各培养站(12个容器的组)设定养殖温度和搅动速度。所有的细胞系都在37℃养殖。在830rpm直至1000rpm下搅动GEX细胞，并且在830rpm至1300rpm下搅动CHO细胞，这取决于DO浓度。通过加入0.5MNaOH(在低于pH6.9时引发)并通过供入CO2(在高于pH7.3时引发)保持pH。通过程序性液体处理器，使用最大体积为1mL或5mL的一次性尖端进行取样并加入介质和供料。各容器的工作体积为12mL(10mL最小，15mL最大)。每天取得用于细胞浓度和代谢物测量的样品(250至450μL，取决于细胞密度)。通过离线测量每3-4天校正pH。为了确保无菌操作，将整个系统置于生物学安全工作柜中。对于GEX细胞，使用2x105细胞/ml接种容器，对于CHO细胞，使用3x105细胞/ml接种容器。当活力降低至65％以下时，终止养殖。需要时，供入用于喷射容器的防沫剂。实施例2：在微生物反应器系统中的灌注对于灌注模式，如上文所述接种细胞。使用12mL并且当葡萄糖浓度下降至2.5g/L以下时(通常在72至120h后)，开始灌注。通过沉淀确保细胞保留。为了使细胞下沉，整个培养站停止搅动。在搅动停止之前10分钟，停止使用NaOH的pH控制，以防在搅动停止前刚刚加入碱。与搅动同时停止对DO的控制。使细胞下沉30至45分钟，优选地是40分钟。在这段时间后，通过液体处理器，从液体的顶部除去3mL收获物，并放置于24深孔平板上。改变ambr系统的样品深度，以确保从养殖液体的顶部取得收获物(标准的样品深度设定为在容器的底部附近取得样品)。对各容器，通过多次抽吸操作除去收获物。在除去收获物后，继续搅动，并通过液体处理器，通过加入在深孔平板中供入的新鲜介质，将养殖的体积恢复至12mL。在加入介质后，继续DO和pH控制。所有的步骤都是通过系统自主实施的(没有用户的干预)。所有的步骤一共持续大约1h。每步骤都更换3mL(工作体积的25％)。对于一个反应器体积的灌注速度(Vr/d)，每天需要4个步骤。用户的干预限于每天取样，一次性尖端的再加载，除去收获物和补充供料介质。表1：在ambr系统上实施多个步骤以确保灌注操作次序时间过程[min]指令10停止背景pH加入210停止控制DOpH310停止搅动450得自培养容器的样品液体550开始搅动650将液体加入培养物顶部750开始控制DOpH860开始背景pH加入实施例3：下沉时间的测定使用髓系白血病来源的永生人类血细胞或CHO细胞实施以下实施例。为了细胞生产和产物品质的分析，将细胞转染，从而重组地产生糖基化的抗体。为了测定最佳的下沉时间，停止搅动，并且在下沉之前，在搅动停止后10、15、20、25、30、35和40分钟后，以及在持续搅动和加入新鲜介质后直接取得细胞计数。分离效率(SE)常用于表达灌注培养物中细胞保留的性能，并如下计算(CReactor为生物反应器中培养介质中细胞的浓度，CHarvest为在下沉时间后从生物反应器除去的培养介质中细胞的浓度)：对于2种细胞系而言，在初始细胞密度为大约1x107细胞/ml，40分钟的下沉时间足以得到>95％的分离效率，这意味着几乎无细胞的收获物。甚至在低于90％的分离效率也是令人满意的，并且有时优选地包括自动的细胞流失。可以通过下沉时间来调节流失程度(更短的下沉时间＝更高的流失速度)。在持续搅动后，细胞密度恢复至起始细胞密度，显示灌注步骤可以在未损失细胞的条件下操作(参见图1A)。此外，细胞活力也不受沉淀步骤影响(参见图1B)。为了进一步研究沉淀对生产率和重要代谢物的影响，以典型的工艺细胞密度1x107细胞/ml开始ambr运行。连续搅动对照培养物，而沉淀的容器不连续地混入4次中断，在110分钟内搅拌40分钟。在2个细胞培养步骤中均未更换介质。如图2B、C和E所示，在培养条件以及活细胞浓度和活力之间，葡萄糖、谷氨酰胺和谷氨酸盐的水平没有不同(数据未示出)。对于滴度和乳酸盐水平，可以观察到差异。规则沉淀的细胞比连续搅动的细胞显示更高的乳酸盐水平。当停止搅动和供入气体以便开始沉淀时，氧气转移快速降低，导致低氧条件。这种影响对于在容器底部累积的细胞而言甚至是更急剧的，其中在容器的底部，局部细胞浓度比在良好混合的条件下更高。在低氧条件下，细胞更依赖于厌氧能量的生产，对于癌症来源的哺乳动物细胞而言，其意味着葡萄糖转化成乳酸盐。在CHO细胞中，低氧条件还显示降低蛋白质的生产率，这符合在图2A中显示的减少的IgG累积，其中特异性mAb生产速度由14.7±0.2μg/mLh降低至12.17±0.1μg/mLh。实施例4：细胞生长和产物品质的比较在上述实施例1和2中描述的微生物反应器ambr系统与在灌注生物反应器中1L养殖物之间，比较细胞生长和产物品质。使用2.0x105细胞/ml接种1L养殖物。当葡萄糖降低至2.5g/L以下时(通常4-5天)，通过以灌注速度0.5V/d供入介质而能够进行连续的操作。当葡萄糖浓度保持在低于2.5g/L时但至少每隔一天，增加灌注。最大灌注速度为2个反应器体积/天。通过加入0.5MNaOH或喷射CO2来控制pH。当活力降低至65％以下或者当达到预期运行时间时，终止养殖。在SartoriusBiostatB-DCU2l中实施试验室1L规模的养殖。通过标准电极(分别为MettlerTorledoInPro6800和Mettler-Torledo405-DPAS-SC-K8S,MettlerTorledo,Switzerland)测量溶解氧和pH。通过3桨叶段式叶轮进行搅动。使用ATF2模块或Centritech离心进行灌注。ATF2模块具有60cmPES膜(0.2μm孔径和0.15m2膜面积,Spectrum,USA)。由于ATF2模块内的死体积，随着细胞悬液100-150mL的流失，发生膜变化。单机连续离心机CentritechLabII或LabIII(LabII的后续产品)(BerryWehrmiller,Pneumaticscale)用于不连续工作的间断模式。对于小规模体积，建议这种模式。调节循环之间的等待时间，以控制灌注速度。在各运行循环结束时，所有的管都用上清液冲洗，以反冲洗存留的细胞保持进入生物反应器中。在灌注生物反应器中的1L或10L养殖物和ambr系统中的小规模养殖的生长图谱是高度可比的。培养物达到相同的最大细胞密度。1L灌注培养物的活力稍微低于小规模ambr系统或10L大规模培养物中基于沉淀的灌注，但是具有可比性。在小规模ambr养殖物与甚至高达1000L体积的大规模培养物之间，产物糖基化形式是高度可比的(得自不同运行的平均值，并且在工艺对照中具有不相关的变化)(参见图3)。其他的品质特征列于表2中。表2：其他的产物品质分析图4显示与分批模式的ambr系统相比，灌注模式的小规模ambr系统更适用于在更大规模的养殖过程中预测糖基化形式的变化。特别地，克隆P741-E5显示当将早期收获物(灌注第4天)与晚期收获物(灌注地25天)相比时，随着时间的流失，岩藻糖基化增加(B中的灰色柱)。在ambr灌注中也观察到岩藻糖基化增加，但是在分批模式中未观察到。克隆P915-D3显示在分批模式中的高盐藻糖基化，但是在ambr和1L规模的灌注中是低岩藻糖基化。在小规模ambr系统中基于沉淀的灌注中，CHODG44显示良好的且一致的生长，直至3.5x107细胞/ml，而与气体供入无关(喷射的或非喷射的)。在21天的整个培养过程中，活力保持高(>90％)(参见图5)。使用CHODG44衍生的细胞在1L和12mL规模下产生的单克隆抗体的糖基化是高度可比的。与10天收获物相比，基于ambr的灌注的半乳糖基化稍微降低。表3：在CHODG44中在1L和12mL规模下产生的单克隆抗体的聚糖结构F：岩藻糖基化的N-聚糖；B：二分的N-乙酰基葡萄糖胺；S>0：唾液酸化的N-聚糖；G>0：半乳糖基化的N-聚糖。聚糖结构的相对丰度与N-聚糖的总量有关。实施例5：实验(DoE)研究的设计为了进一步证明本发明研发的系统的优点，进行DoE研究。关于DoE因素，加入浓度范围为0.5％至1.5％的化学分子伴侣(CC5)，补充0.5至1.5倍的GlycoMix，使用标准的浓度和工艺pH(6.8–7,2)。选择具有4个中心点和14个设计运行的CCF(CentralCompositeFace)设计。平均活力、活细胞密度积分(IVCD)和总产物/运行作为应答。模型拟合的概述绘制于表4中。表4：DoE拟合的概述应答R2Q2有效性再生产率产物0.9490.8310.7580.950IVCD0.9720.8450.9500.930活力0.9280.7490.9750.785所有应答的R2值均高并接近于1，表明良好的模型拟合。对于所有3个应答，未来预测精度Q2也高，大约0.8。良好的模型显示Q2值大于0.5。有效性(应该高于0.25)和再生产率(应该高于0.5)也是可接受的。保藏生物材料的鉴定细胞系DSMACC2606和DSMACC2605于2003年8月14日由NemodBiotherapeuticsGmbH&Co.KG,Robert--Str.10,13125Berlin(DE)保藏于DSMZ-德国微生物保藏中心,MascheroderWeg1b,38124Braunschweig(DE)。以Glycotope为标题用于指这些生物材料，因为它们在这期间由NemodBiotherapeuticsGmbH&Co.KG命名为GlycotopeGmbH。细胞系DSMACC2806、DSMACC2807、DSMACC2856、DSMACC2858和DSMACC3078在如下表所示的日期由GlycotopeGmbH,Robert--Str.10,13125Berlin(DE)保藏于DSMZ-德国微生物保藏中心,Inhoffenstraβe7B,38124Braunschweig(DE)。细胞系名称登录号保藏人保藏日期NM-F9DSMACC2606NemodBiotherapeutics2003年8月14日NM-D4DSMACC2605NemodBiotherapeutics2003年8月14日NM-H9D8DSMACC2806GlycotopeGmbH2006年9月15日NM-H9D8-E6DSMACC2807GlycotopeGmbH2006年10月5日NM-H9D8-E6Q12DSMACC2856GlycotopeGmbH2007年8月8日GT-2xDSMACC2858GlycotopeGmbH2007年9月7日GT-5sDSMACC3078GlycotopeGmbH2010年7月28日当前第1页1 2 3