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：：植物昆虫有害生物是农业中的严重问题。植物昆虫有害生物破坏了数百万英亩的主要作物，如玉米、大豆、豌豆和棉花。每年，仅在美国，植物昆虫有害生物就造成了超过1000亿美元的作物损失。在与昆虫有害生物进行的季节性斗争中，农场主们必须施用数十亿加仑的合成杀有害生物剂来对付这些有害生物。过去采用的其他方法通过微生物或在转基因植物中表达来源于微生物的基因来提供杀昆虫活性。例如，已知芽孢杆菌属(bacillus)微生物的某些物种对于广泛范围的昆虫有害生物具有杀有害生物活性，这些昆虫有害生物包括鳞翅目(lepidoptera)、双翅目(diptera)、鞘翅目(coleoptera)、半翅目(hemiptera)等。事实上，微生物杀有害生物剂，特别是从芽孢杆菌菌株获得的那些微生物杀有害生物剂，在农业上作为有害生物化学防治的替代方案起到重要作用。农业科学家通过对作物植物进行遗传工程改造以产生来自芽孢杆菌的杀昆虫蛋白，开发出了昆虫抗性增强的作物。例如，经遗传工程改造而产生cry毒素的玉米和棉花植物(参见例如aronson(2002)cellmol.lifesci.[细胞与分子生命科学]，59(3)：417-425；schnepf等人(1998)microbiol.mol.biol.rev.[微生物学与分子生物学综述]62(3)：775-806)目前在农业中广泛应用，并给农场主提供了传统昆虫防治方法的替代方案。然而，在一些情况下，这些bt杀昆虫蛋白可能仅保护植物免受相对较窄范围的有害生物的侵害。不断演变的昆虫抗性也提出了一个问题(gassmann等人，(2014)pnas[美国国家科学院院刊]111(14)：5141-6)。因此，新颖的昆虫防治组合物仍然是所希望的。技术实现要素：提供了采用沉默元件的方法和组合物，所述沉默元件在被植物昆虫有害生物(例如鞘翅目(coleopteran)、半翅目(hemiptera)或鳞翅目(lepidopteran)植物有害生物，包括叶甲属(diabrotica)、瘦跗叶甲属(leptinotarsa)、条跳甲属(phyllotreta)、无网蚜属(acyrthosiphan)、小粉虱属(bemisia)、茶翅蝽属(halyomorpha)、稻绿蝽属(nezara)或灰翅夜蛾属(spodoptera)植物有害生物)摄取时，能够降低靶标序列在所述有害生物中的表达。在某些实施例中，所述靶标序列的表达降低能控制有害生物繁殖的能力，并且因此这些方法和组合物能够限制昆虫有害生物对植物的损害以及昆虫有害生物的扩散。本文描述了如seqidno.：1-53或107-254中所示的各种靶标多核苷酸、或者其变体或片段、或者其互补序列，以上各项调节涉及有害生物繁殖和产卵力的靶标有害生物rna中的序列中的一个或多个的表达。因此，如seqidno.：1-53或107-254中所示的各种靶标多核苷酸、或者其变体或片段、或者其互补序列在本文所述的方法中是有用的，所述方法通过昆虫不育化和释放不育的靶标有害生物，即昆虫不育技术(“sit”)来防治靶标有害生物。还提供了沉默元件，所述沉默元件在被有害生物摄取时，降低这些靶标多核苷酸中的一种或多种的表达水平。进一步提供了编码沉默元件的构建体和包含编码沉默元件的构建体的宿主细胞。还提供了包含这些沉默元件或者其活性变体或片段的植物、植物部分、植物细胞、细菌和其他宿主细胞。还提供了用于局部施用到有害昆虫或可能存在有害昆虫的基质上的可喷雾沉默剂的制剂。在另一个实施例中，提供了用于防治如下植物昆虫有害生物的方法：例如鞘翅目、半翅目或鳞翅目植物有害生物，包括叶甲属、瘦跗叶甲属、条跳甲属、无网蚜属、小粉虱属、茶翅蝽属、稻绿蝽属或灰翅夜蛾属植物有害生物。所述方法包括向植物昆虫有害生物饲喂包含沉默元件的组合物，其中所述沉默元件在被有害生物摄取时，降低所述有害生物中靶标序列的水平，并且因此防治所述有害生物。进一步提供了保护植物免受植物昆虫有害生物侵害的方法。此类方法包括将所披露的沉默元件引入植物或植物部分中。当表达沉默元件的植物被有害生物摄取时，所述靶标序列的水平得以降低并且所述有害生物受到防治。附图简要说明图1a-1d显示了在摄取包含含有seqidno.：4的靶标核苷酸序列的dsrna构建体的人工饲料之后，关于西方玉米根虫(“wcrw”)成虫的不育化的代表性数据。图1a显示了在13-14天内由处理组和年龄组产生的卵的总数。对于幼龄雌性组，使用了50对雄性和雌性甲虫，并且对于老龄雌性组，使用了50只交配的雌性甲虫。图1b显示了在13-14天产卵期期间，由处理组和年龄组每只雌性/天产生的卵的平均数量。该箱线图由spotfire程序生成，其表示4个四分位数、平均值、和平均数的95％置信区间。图1c显示了各种处理对整体平均卵孵化率的影响，如图中所示。数据代表13-14天的采卵期；n＝6个重复/处理/天；5-45个卵/重复，取决于天数(p＜0.001)。图1d显示了在处理幼龄组雌性和雄性昆虫后8天和处理老龄组雌性昆虫后4天，wcrw甲虫成虫中的基因抑制分析。使用dv-rps10基因作为参照和未处理的老龄甲虫作为正规化子(normalizer)，从每种处理的4只单个昆虫中显示vgr的相对表达。该箱线图显示了处理组和年龄组的4个四分位数、平均值、中值和平均数的95％置信区间。图2a-2b显示了用包含含有seqidno.：4的靶标核苷酸序列的dsrna构建物的人工饲料喂食3龄幼虫之后，关于wcrw的不育化的代表性数据。图2a显示了每只雌性产生的平均数量和有活力的卵。对每种处理计数来自15-42只雌性甲虫成虫的卵。该箱里的数字显示了卵或有活力的卵/雌性的平均数量。该箱线图显示了针对每种处理的4个四分位数、平均值、中值和平均数的95％置信区间。对于暴露于vgrdsrna的组，在整个研究期间有活力的卵的产量一直非常低。用vgrdsrna处理不影响成虫羽化。由于vgrdsrna幼虫暴露引起的甲虫成虫的死亡率可以忽略不计。图2b显示了分别在处理后第40天和第58天，4只10日龄甲虫和超过15只28日龄甲虫中的vgr基因抑制分析。通过qrtpcr的相对表达的箱线图显示了在10天龄和28天龄甲虫中针对每种处理的4个四分位数、平均值、中值和平均数的95％置信区间。将未经处理的3龄幼虫用作正规化子。图3a-3c显示了在暴露于包含含有seqidno.：3的靶标核苷酸序列的dsrna的人工饲料后，有关wcrw不育化和wcrw中的基因抑制的剂量响应的数据。图3a显示了响应于vgrdsrna剂量在18天研究期间产生的卵和卵/雌性的总数量。收集卵并在18天的产卵期时间内进行计数。最后两栏列出了有活力的卵/雌性和产卵力的净降低(％)。使用实例中所述公式估算经vgrdsrna处理的雌性相对于对照(暴露于水的雌性)的产卵力的净降低(nrf)。图3b显示了根据剂量的整体卵孵化率的百分比的箱线图。数据代表18天的采卵期；n＝1-4个重复/处理/天；5-478个卵/重复，取决于天数和卵的可用性。图3c显示了以不同剂量的dsvgr处理后第6天，vgr相对表达的箱线图。将未经处理的甲虫用作正规化子。图4a-4b显示了摄取各种vgrdsrna片段后有关vgr基因抑制的数据。图4a显示了编码vgr的dna序列(“cds”)上的vgr片段和qrtpcr测定的扩增子(由虚线圆圈表示)的示意图。图4b显示了使用5′-qrtpcr测定用dsvgr片段和对照(ddh2o和dsgus)处理后6天的相对vgr表达的箱线图。显示了4个四分位数、平均值(水平实线)、中值(水平虚线)和平均数的95％置信区间。用mid-和3′-qrtpcr测定也得到类似的结果。将数据标准化为从未经处理的3龄幼虫获得的结果。图5a-5d显示了有关使用基因抑制分析的vgr片段筛选的数据。图5a显示了在用于基因抑制分析的筛选中使用的vgr片段的示意图。图5b-5d显示了使用在三个实验中获得的结果针对所指示的vgr片段的代表性基因分析。在每个实验中，包括通过水、gus和vgr片段1(seqidno.：3)的处理作为对照。将数据标准化为用水处理的甲虫。使用两种qrtpcr测定(5′-和mid-qrtpcr测定)来避免vgr片段和pcr扩增子的重叠。图6a-6b显示了摄取表达如图所示的vgrdsrna构建体的转基因植物的甲虫中有关vgr基因抑制的数据。在每个图的底部指示了植物中的vgr表达。图6a显示了在大约v4生长阶段的植物被笼中的至少14只幼龄雌性甲虫侵染的数据。植物类型如图所示，其中“ntg”表示非转基因对照植物；“frag1”表示表达包含vgr-frag1(seqidno.：3)的沉默元件的转基因植物；“frag2”表示表达包含vgr-frag2(seqidno.：4)的沉默元件的转基因植物，以及“frag3”表示表达包含vgr-frag3(seqidno.：5)的沉默元件的转基因植物。饲喂8天后收集甲虫用于基因抑制分析。将数据标准化为来自摄取该ntg对照的甲虫的数据。图6b显示了从被笼中的超过6只幼龄雌性甲虫侵染的单个r1玉米植物获得的数据。饲喂后12天收集甲虫。每个片段和对照由用于饲喂的2个植物和用于基因抑制分析的超过12只昆虫表示。图7显示了关于vgrt1甲虫成虫暴露生物测定的产卵力评估的数据。对于每个构建体，测试2-4个转殖项。每个笼子每天和/或以2-4天的间隔接受产卵盘，并随后进行加工。图8显示了关于vgrt1幼虫暴露生物测定的产卵力评估的数据。针对每个转殖项，安排包含至少8-14对雄性和雌性甲虫的三个重复笼子。每个笼子每5天接收产卵盘，并加工卵。图9a-9b显示了通过dv-boule-frag1(seqidno.：164)dsrna处理的关于wcrw成虫不育化生物测定和基因抑制的数据。图9a显示了每只雌性产生的卵和受精卵的总数；平均卵孵化率与平均数标准误差；相对于水对照，每只雌性总产卵量的减少和雌性甲虫产卵力的净降低。图9b显示了bouledsrna处理后甲虫中的基因表达。通过qrtpcr测定的相对表达描述于之前的实例中。该箱线图显示了四个四分位数、平均值(水平虚线)、中值(水平实线)和平均数的95％置信区间。图10显示了关于来自幼虫暴露于表达boulefrag1(seqidno.：164)dsrna的t1转基因植物的甲虫计数的数据。该箱线图显示了四个四分位数、平均值(水平虚线)、中值(水平实线)和平均数的95％置信区间。使用体外转录(ivt)产物作为对照，在根部样品中测定针对每个转殖项的植物bouledsrna片段的平均表达水平。图11a-11c显示了关于wcrw幼虫暴露于导致成虫不育化的boule转基因t1植物的数据。图11a显示了幼虫暴露于转基因植物(表达dv-boule-frag1，seqidno.：164)对来自羽化的甲虫的每只雌性的平均产卵量和每只雌性产生的平均有活力的卵的影响。每条中的线代表平均数标准误差(±sem)，并且其后跟随相同的大写或小写字母的相同颜色条在统计学上不存在差异。图11b显示了幼虫暴露于转基因植物(表达dv-boule-frag1，seqidno.：164)对从羽化的甲虫获得的卵的孵化率的影响。该箱线图显示了四个四分位数、平均值(水平白线)和平均数的95％置信区间(垂直黑线)。平均值和相应的平均数标准误差(±sem)在该箱线图的底部显示。对于每次处理，对5批卵进行卵孵化试验，并且每个处理评估总共至少1200-1285个卵的生活力。图11c表明了幼虫暴露于转基因植物(表达dv-boule-frag1，seqidno.：164)相对于ntg对照对羽化的甲虫成虫的产卵力的净降低的影响。该箱线图显示了四个四分位数、平均值(水平黑线)和平均数的95％置信区间(垂直黑线)。平均值和相应的平均数标准误差在该箱线图的底部显示。图12显示了关于靶向以1ppm的dv-cul3-frag1、dv-nclb-frag1和dv-mael-frag1dsrna(分别为seqidno.：44、45和46)的dsrna的3龄不育化生物测定的数据。示出了每只雌性产卵的平均总数、每只雌性产生的有活力卵的平均数量、平均卵孵化率；产卵量的平均降低以及产卵力的净降低(均相对于水对照)。对于每个参数，均展示了各自的平均数标准误差。具体实施方式将在下文中参考附图更全面地描述本文的公开内容，其中示出了一些但不是所有的可能的实施例。实际上，公开内容可以以许多不同的形式体现，并且不应被解释为局限于本文所阐述的实施例；而是提供这些实施例，使得本公开能满足适用的法律要求。所披露的组合物和方法所涉及的领域中的技术人员将考虑到，本文所披露的许多修改和其他实施例具有前述描述和相关附图中呈现的教导的益处。因此，应当理解，这些公开内容不限于所披露的特定实施例，并且修改和其他实施例旨在包括在所附权利要求的范围内。尽管本文中采用了具体的术语，但这些术语仅在一般性和描述性意义上使用而并非用于限制目的。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定方面的目的，而不是限制性的。如在说明书和权利要求中所使用的，术语“包括”可以包括“由......组成”的方面。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与所披露的组合物和方法所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在本说明书和下面的权利要求书中，将参考本文中所定义的若干术语。如本文所使用的，单数形式“一种(a)”、“一种(an)”以及“该”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。因此，例如，提及“细胞”包括多个这样的细胞，并且提及“蛋白质”包括本领域技术人员已知的一种或多种蛋白质及其等效物等。本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义，除非另有明确说明。i.概述提供了采用一种或多种沉默元件的方法和组合物，所述沉默元件在被植物昆虫有害生物(例如鞘翅目、半翅目或鳞翅目植物有害生物，包括叶甲属、瘦跗叶甲属、条跳甲属、无网蚜属、小粉虱属、茶翅蝽属、稻绿蝽属或灰翅夜蛾属植物有害生物)摄取时，能够降低靶标序列在所述有害生物中的表达。在某些实施例中，所述靶标序列的表达降低能控制有害生物繁殖的能力，并且因此这些方法和组合物能够限制昆虫有害生物对植物的损害以及昆虫有害生物的扩散。本文披露了如seqidno.：1-53或107-254中所示的靶标多核苷酸、或其变体和片段、及其互补序列。提供了包含这些靶标多核苷酸的序列、互补序列、活性片段或变体的沉默元件，当所述沉默元件被有害生物摄取或与有害生物接触时降低所述靶标序列中的一者或多者的表达，并且从而通过例如昆虫不育化或通过应用昆虫不育技术(sit；即，这些沉默元件与不育化活性相关)来防治有害生物群体。在一些实施例中，提供了包含编码沉默元件的多核苷酸的转基因植物，当所述转基因植物被有害生物摄取或与有害生物接触时降低所述靶标序列中的一者或多者的表达，并且从而通过例如昆虫不育化或通过应用sit来防治有害生物群体。在一个实施例中，方法涉及生产不育昆虫；以非常大的数量(天然昆虫数量的约10到100倍)将不育昆虫释放到环境中，以便与存在于该环境中的天然昆虫交配，其中与不育雄性交配的天然雌性产生未受精卵。在另外的实施例中，重复释放不育昆虫一次或多次，其中天然昆虫的数量减少，并且不育昆虫与天然昆虫的比例增加，使天然群体规模减小。据了解，靶标有害生物rna可能涉及雄性和/或雌性不育、精子数量减少、产卵量(产卵力)、性别比例、受精率(能育性)、性器官成熟、以及精子或卵生活力中的一种或多种。sit已被用于通过释放一种或两种性别的不育昆虫来通过基于交配的方法来防治昆虫群体。在一个实施例中，sit包括释放大量搜索野生雌性并与野生雌性交配的不育雄性昆虫，从而防止产生后代。已经报道了使用不同方案产生不育昆虫的sit能防治蚊子群体，例如疟蚊(anopheles)或伊蚊(aedes)(例如，参见whyard等人，(2015)parasit.vectors[寄生虫和载体]，8：96；benedict，m.q.和a.s.robinson(2003)trendsparasitol.[寄生虫学趋势]19(8)：349；以及nolan等人，(2011)genetica139∶33)。已经在巴西实地评估了sit对埃及伊蚊(aedesaegypti)群体的防治(carvalho，d.o.(2015)，plos.9(7)：e0003864)。登革热、基孔肯雅热和现在的寨卡病毒都通过埃及伊蚊进行传播，埃及伊蚊是地球上分布最广泛的疾病携带载体之一。在一个实施例中，方法涉及生产不育昆虫；以天然昆虫数量的约0.5、1、5、10、20、30、50、60、70、90、至100倍将不育昆虫释放到环境中，其中所述不育昆虫与存在于该环境中的天然昆虫交配，其中与不育雄性交配的天然雌性产生未受精卵。在另外的实施例中，重复释放不育昆虫一次或多次，其中天然昆虫的数量减少，并且不育昆虫与天然昆虫的比例增加，使天然群体规模减小。在一个实施例中，提供了采用包含至少一个双链rna区域的核糖核酸构建体的组合物和方法，所述双链rna区域的至少一条链包含与以下互补的多核苷酸：(a)包含在靶标有害生物中表达的rna转录物的序列的核苷酸序列，其中所述rna转录物的下调导致所述靶标的不育增加；或其变体和片段，以及所述核苷酸序列的互补序列；(b)包含与所述核苷酸序列的至少90％序列同一性的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；或者(c)包含所述核苷酸序列的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；其中所述多核苷酸编码对昆虫植物有害生物具有不育化活性的沉默元件。在另外的实施例中，提供了采用包含至少一个双链rna区域的核糖核酸构建体的组合物和方法，所述双链rna区域的至少一条链包含与以下互补的多核苷酸：(a)包含在鞘翅目有害生物中表达的rna转录物的序列的核苷酸序列，其中所述rna转录物的下调导致所述靶标的不育增加；或其变体和片段，以及所述核苷酸序列的互补序列；(b)包含与所述核苷酸序列的至少90％序列同一性的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；或者(c)包含所述核苷酸序列的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；其中所述多核苷酸编码对昆虫植物有害生物具有不育化活性的沉默元件。在另一个实施例中，提供了采用包含至少一个双链rna区域的核糖核酸构建体的组合物和方法，所述双链rna区域的至少一条链包含与以下互补的多核苷酸：(a)包含seqidno.：1-53或107-254中任一项的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；(b)包含与核苷酸seqidno：1-53或107-254中任一项的至少90％序列同一性的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；或者(c)包含seqidno：1-53或107-254中任一项的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；其中所述多核苷酸编码对昆虫植物有害生物具有不育化活性的沉默元件。如本文所使用的，“vgr蛋白”或“卵黄原蛋白受体蛋白”是指大的(180kda-214kda)膜结合蛋白家族，并且包括如下蛋白，例如具有seqidno.：106的序列的vgr蛋白，及其变体、同系物和突变体。据信，这些蛋白以高亲和力与卵黄原蛋白结合(kd值约为30nm-180nm)并参与卵黄原蛋白的细胞摄取。vgr蛋白通常在卵巢组织中表达。如本文所使用的，“boule”是指编码具有高度保守的rrm(rna识别基序)结构域的rna结合蛋白和富含asn、tyr和gln残基的24个氨基酸的至少一个daz(在无精子症中缺失)重复的基因家族。苍蝇中boule的缺失或突变通常严重损害精子形成。boule是进入减数分裂期以及在减数分裂g2期和m期之间过渡时的种系分化所必需的。boule通常在生殖系细胞中表达。如本文所使用的，“vgrmrna”或“卵黄原蛋白受体mrna”是指当翻译时提供vgr蛋白，或其变体、同系物或突变体蛋白的信使rna转录物。如本文所使用的，“防治植物昆虫有害生物”或“能防治植物昆虫有害生物”意指使植物昆虫有害生物造成的损害受到限制的对有害生物的任何影响。防治植物昆虫有害生物包括但不限于杀死该有害生物、抑制该有害生物的发育、改变该有害生物的能育性或生长，以此种方式使该有害生物对植物的损害减小，或以某种方式减少所产生后代的数量、产生适应力较弱的有害生物(包括后代)、产生易受捕食者攻击的有害生物、产生更易受其他杀昆虫蛋白影响的有害生物、或阻止这些有害生物啃食植物。降低有害生物中的靶标多核苷酸或由其编码的多肽的表达水平使得入侵有害生物被抑制、防治和/或杀死。在一个实施例中，减少有害生物的靶标序列的表达水平将使有害生物损害减少了至少约2％至至少约6％、至少约5％至约50％、至少约10％至约60％、至少约30％至约70％、至少约40％至约80％、或至少约50％至约90％或更高。因此，本文披露的方法可以用于防治有害生物，有害生物包括但不限于鞘翅目植物昆虫有害生物或叶甲属植物有害生物。某些测量对植物昆虫有害生物的防治的测定法通常是本领域已知的，正如用以记录结节损伤评分的方法也是本领域已知的一样。参见，例如，oleson等人(2005)j.econ.entomol.[经济昆虫学杂志]98∶1-8。其他测定方法在下面的实例中提供。本文披露的是用于保护植物免受植物昆虫有害生物侵害或诱导植物中的对植物昆虫有害生物(例如鞘翅目植物有害生物或叶甲属植物有害生物或其他植物昆虫有害生物)抗性的组合物和方法。植物昆虫有害生物包括选自如下各目的昆虫：鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、缨翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目、毛翅目等，特别是鳞翅目和鞘翅目。本领域技术人员将认识到，并非所有组合物对所有有害生物都同样有效。披露的组合物(包括本文披露的沉默元件)显示出抗植物昆虫有害生物活性，该植物昆虫有害生物可以包括经济上重要的农艺、森林、温室、苗圃观赏植物、食物和纤维、公共和动物健康、家庭和商业结构、家用和储存产品有害生物。如本文所使用的，“鞘翅目植物有害生物”用于指鞘翅目的任何成员。可以通过本文披露的方法和组合物进行靶向的其他植物昆虫有害生物包括但不限于墨西哥豆瓢虫(epilachnavarivestis)和马铃薯甲虫(leptmotarsadecemlineata)。如本文所使用的，术语“叶甲属植物有害生物”是指叶甲属的任何成员。因此，这些组合物和方法也可用于保护植物免受任何叶甲属植物有害生物的侵害，该叶甲属植物有害生物包括，例如柠条叶甲(diabroticaadelpha)；阿梅卡梅卡叶甲(diabroticaamecameca)，黄瓜条叶甲(diabroticabalteata)；北方玉米根虫(diabroticabarberi)；双环叶甲(diabroticabiannularis)；冠叶甲(diabroticacristata)；十星叶甲(diabroticadcempunctata)；异色叶甲(diabroticadissimilis)；纽带叶甲(diabroticalemniscata)；小拟叶甲(diabroticalimitata)(包括，例如，十五星小拟叶甲(diabroticalimitataquindecimpuncata))；长角叶甲(diabroticalongicornis)，钱币状叶甲(diabroticanummularis)，中空叶甲(diabroticaporracea)；棘角叶甲(diabroticascutellata)；六斑叶甲(diabroticasexmaculata)；南美叶甲(diabroticaspeciosa)(包括，例如，diabroticaspeciosaspeciosa)；胫叶甲(diabroticatibialis)；黄瓜十一呈叶甲(diabroticaundecimpunctata)(包括，例如，南方玉米根虫(黄瓜十一星叶甲(diabroticaundecimpunctata))，diabroticaundecimpunctataduodecimnotata；斑点黄瓜甲虫(diabroticaundecimpunctatahowardi，spottedcucumberbeetle)；西方斑点黄瓜甲虫(diabroticaundecimpunctataundecimpunctata，westernspottedcucumberbeetle))；玉米根虫(diabroticavirgifera)(包括，例如，玉米根萤叶甲(diabroticavirgiferavirgifera)(西方玉米根虫(westerncornrootworm))和墨西哥玉米根虫(diabroticavirgiferazeae，mexicancornrootworm))；绿叶甲(diabroticaviridula)，芜菁叶甲(diabroticawartensis)，叶甲属物种jjg335，叶甲属物种jjg336；叶甲属物种jjg341，叶甲属物种jjg356；叶甲属物种jjg362；和叶甲属物种jjg365。在某些实施例中，叶甲属植物有害生物包括玉米根萤叶甲、北方玉米根虫(d.barberi)、墨西哥玉米根虫、南美叶甲(d.speciosa)或斑点黄瓜甲虫(d.undecimpunctatahowardi)。鳞翅目的幼虫包括但不限于，夜蛾科秋粘虫(spodopterafrugiperdajesmith，fallarmyworm)中的粘虫、夜蛾、尺蠖和棉铃虫(heliothines)；甜菜夜蛾(s.exiguahübner，beetarmyworm)；斜纹夜蛾(s.litrurafabricius，tobaccocutworm，clustercaterpillar)；蓓带夜蛾(mamestraconfiguratawalker)(披肩粘虫(berthaarmyworm))；甘蓝夜蛾(m.brassicaelinnaeus，cabbagemoth)；小地老虎(agrotisipsilonhufnagel，blackcutworm)；地老虎(a.orthogoniamorrison)(西方地老虎(westerncutworm))；a.subterraneafabricius(颗粒状地老虎(granulatecutworm))；棉叶波纹夜蛾(alabamaargillaceahübner)(棉叶虫(cottonleafworm))；粉纹夜蛾(trichoplusianihübner，cabbagelooper)；大豆夜蛾(pseudoplusiaincludenswalker)(大豆夜蛾(soybeanlooper))；黎豆夜蛾(anticarsiagemmatalishübner)(黎豆夜蛾(velvetbeancaterpillar))；苜蓿绿夜蛾(hypenascabrafabricius)(苜蓿绿夜蛾(greencloverworm))；烟芽夜蛾(heliothisvirescensfabricius)(烟草夜蛾(tobaccobudworm))；一星黏虫(pseudaletiaunipunctahaworth)(粘虫(armyworm))；athetismindarabarnes&mcdunnough(粗皮地老虎(roughskinnedcutworm))；暗缘地老虎(euxoamessoriaharris)(暗缘地老虎(darksidedcutworm))；棉斑实蛾(eariasinsulanaboisduval)(多刺螟蛉(spinybollworm))；翠纹钻夜蛾(e.vittellafabricius)(斑点螟蛉(spottedbollworm))；棉铃虫(helicoverpaarmigerahübner)(美国螟蛉(americanbollworm))；棉铃虫(h.zeaboddie，cornearworm或cottonbollworm)；melanchrapictaharris(斑马毛虫(zebracaterpillar))；egira(xylomyges)curialisgrote(柑橘夜蛾(citruscutworm))；来自螟蛾科欧洲玉米螟(ostrinianubilalishübher，europeancornborer)的螟虫、鞘蛾、结网虫、锥形虫(coneworms)、和雕叶虫(skeletonizers)；脐橙螟(amyeloistransitellawalker，navalorangeworm)；地中海粉斑螟(anagastakuehniellazeller，mediterraneanflourmoth)；粉斑螟蛾(cadracautellawalker，almondmoth)；二化螟(chilosuppressaliswalker，ricestemborer)；斑禾草螟(c.partellus)(高粱螟(sorghumborer))；米蛾(corcyracephalonicastainton，ricemoth)；玉米根草螟(crambuscaiiginosellusclemens)(玉米根结网虫(cornrootwebworm))；c.teterrelluszincken(蓝草结网虫(bluegrasswebworm))；稻纵卷叶螟(cnaphalocrocismedinalisguenée，riceleafroller)；desmiafuneralishübher(葡萄甘薯麦蛾(grapeleaffolder))；绢野螟(diaphaniahyalinatalinnaeus)(瓜虫(melonworm))；黄瓜绢野螟(d.llidisstoll)(泡菜虫(pickleworm))；巨座玉米螟(diatraeagrandioselladyar)(西南玉米秆草螟(southwesterncornborer))，蔗螟(d.saccharalisfabricius，surgarcaneborer)；墨西哥稻螟(eoreumaloftinidyar，mexicanriceborer)；烟草螟(ephestiaelutellahübner)(烟草(可可)蛾)；大蜡螟(galleriamellonellalinnaeus，greaterwaxmoth)；herpetogrammalicarsisaliswalker(草地螟(sodwebworm))；向日葵斑螟(homoeosomaelectellumhulst，sunflowermoth)；南美玉米苗斑螟(elasmopalpuslignoselluszeller)(小玉米茎蛀虫)；小蜡蛾(achroiagrisellafabricius，lesserwaxmoth)；草地螟(loxostegesticticalislinnaeus，beetwebworm)；orthagathyrisaliswalker(茶树结网蛾(teatreewebmoth))；豆荚螟(marucatestulalisgeyer，beanpodborer)；印度谷螟(plodiainterpunctellahübner，indianmealmoth)；三化螟(scirpophagaincertulaswalker，yellowstemborer)；udearubigalisguenée(芹菜卷叶螟(celeryleaftier))；和卷蛾科东部黑头长翅卷蛾(tortricidaeaclerisgloveranawalsingham)(西方黑头蚜虫)中的卷叶虫、蚜虫、种子虫和水果虫；a.varianafernald(东部黑头蚜虫)；果树黄卷蛾(archipsargyrospilawalker)(果树卷叶虫(fruittreeleafroller))；a.rosanalinnaeus(欧洲卷叶虫(europeanleafroller))；以及其他黄卷蛾物种，棉褐带卷蛾(adoxophyesoranafischervon，summerfruittortrixmoth)；cochylishospeswalsingham(带状向日葵斑蛾(bandedsunflowermoth))；cydialatiferreanawalsingham(榛树虫(filbertworm))；c.pomonellalinnaeus(苹果蠹蛾(codingmoth))；platynotaflavedanaclemens(杂色卷叶虫(variegatedleafroller))；p.stultanawalsingham(杂食卷叶虫(omnivorousleafroller))；葡萄花翅小卷蛾(lobesiabotranadenis&schiffermüller)(欧洲葡萄树蛾(europeangrapevinemoth))；苹果小卷蛾(spilonotaocellanadenis&schiffermüller，eyespottedbudmoth)；endopizaviteanaclemens(葡萄浆果蛾(grapeberrymoth))；女贞细卷蛾(eupoeciliaambiguellahübner)(藤蛾(vinemoth))；bonagotasalubricolameyrick(巴西苹果卷叶虫(brazilianappleleafroller))；梨小食心虫(grapholitamolestabusck)(东方水果蛾(orientalfruitmoth))；suleimahelianthanariley(向日葵芽蛾(sunflowerbudmoth))；带卷蛾属物种(argyrotaeniaspp.)；卷叶蛾属物种(choristoneuraspp.)。在鳞翅目中选择的其他农艺学有害生物包括但不限于，秋星尺蠖(alsophilapometariaharris，fallcankerworm)；桃蚜蛾(anarsialineatellazeller)(桃条麦蛾(peachtwigborer))；anisotasenatoriaj.e.smith(橙色条纹橡树虫(orangestripedoakworm))；柞蚕(antheraeapemyiguérin-méneville)(中国橡树柞蛾(chineseoaktussahmoth))；桑蚕(bombyxmorilinnaeus，silkworm)；棉潜蛾(bucculatrixthurberiellabusck，cottonleafperforator)；纹黄豆粉蝶(coliaseurythemeboisduval)(苜蓿粉蝶(alfalfacaterpillar))；datanaintegerrimagrote&robinson(胡桃毛虫(walnutcaterpillar))；西伯利亚松毛虫(dendrolimussibiricustschetwerikov)(西伯利亚丝蛾(siberiansilkmoth))，ennomossubsignariahübner(榆树尺蠖(elmspanworm))；erannistiliariaharris(椴尺蠖(lindenlooper))；褐尾蠹(euproctischrysorrhoealinnaeus，browntailmoth)；harrisinaamericanaguérin-méneville(葡萄叶雕叶虫(grapeleafskeletonizer))；行列半白大蚕蛾(hemileucaoliviaecockrell)(山脉毛虫(rangecaterpillar))；美国白蛾(hyphantriacuneadrury，fallwebworm)；番茄茎麦蛾(keiferialycopersicellawalsingham)(番茄蛲虫(tomatopinworm))；铁杉尺蠖(lambdinafiscellariafiscellariahulst，easternhemlocklooper)；l.fiscellarialugubrosahulst(西方铁杉尺蠖(westernhemlocklooper))；毒蛾(leucomasalicislinnaeus)(柳毒蛾(satinmoth))；舞毒蛾(lymantriadisparlinnaeus，gypsymoth)；番茄天蛾(manducaquinquemaculatahaworth，fivespottedhawkmoth，tomatohornworm)；烟草天蛾(m.sextahaworth)(番茄天蛾(tomatohornworm)，烟草天蛾(tobaccohornworm))；冬尺蠖蛾(operophterabrumatalinnaeus，wintermoth)；春尺蠖(paleacritavematapeck，springcankerworm)；美洲大芷凤蝶(papiliocresphontescramer)(大燕尾柑桔凤蝶(giantswallowtailorangedog))；phryganidiacalifornicapackard(加利福尼亚州橡木虫(californiaoakworm))；桔潜蛾(phyllocnistiscitrellastainton，citrusleafminer)；phyllonorycterblancardellafabricius(斑点幕型潜叶虫(spottedtentiformleafminer))；大菜粉蝶(pierisbrassicaelinnaeus，largewhitebutterfly)；菜青虫(p.rapaelinnaeus)(小菜粉蝶(smallwhitebutterfly))；暗脉菜粉蝶(p.napilinnaeus)(绿色纹理粉蝶(greenveinedwhitebutterfly))；platyptiliacarduidactylariley(洋蓟羽蛾(artichokeplumemoth))；小菜蛾(plutellaxylostellalinnaeus，diamondbackmoth)；红铃麦蛾(pectinophoragossypiellasaunders)(棉红铃虫(pinkbollworm))；pontiaprotodiceboisduval&leconte(南方菜青虫(southerncabbageworm))；sabulodesaegrotataguenée(杂食尺蠖(omnivorouslooper))；schizuraconcinnaj.e.smith(红瘤毛虫(redhumpedcaterpillar))；麦蛾(sitotrogacerealellaolivier，angoumoisgrainmoth)；松异带蛾(thaumetopoeapityocampaschiffermuller)(松树列队毛虫(pineprocessionarycaterpillar))；幕谷蛾(tineolabisselliellahummel)(织带衣蛾(webbingclothesmoth))；番茄斑潜蝇(tutaabsolutameyrick)(番茄潜叶虫(tomatoleafminer))；苹果巢蛾(yponomeutapadellalinnaeus)(巢蛾(erminemoth))；实夜蛾(heliothissubflexaguenée)；天幕毛虫属物种(malacosomaspp.)和古毒蛾属物种(orgyiaspp.)。目的是鞘翅目的幼虫和成虫，其包括来自长角象科(anthribidae)、豆象科(bruchidae)和象甲科(curculionidae)的象鼻虫(包括但不限于：墨西哥棉铃象(anthonomusgrandisboheman)(棉铃象甲(bollweevil))；稻水象甲(lissorhoptrusoryzophiluskuschel)(稻水象虫(ricewaterweevil))；谷象鼻虫(sitophilusgranariuslinnaeus)(谷象(granaryweevil))；稻象虫(s.oryzaelinnaeus，riceweevil)；三叶草叶象(hyperapunctatafabricius)(车轴草叶象虫(cloverleafweevil))；密点细枝象(cronrocopturusadspersusleconte)(向日葵茎象鼻虫(sunflowerstemweevil))；黄褐小爪象(smicronyxfulvusleconte)(红色葵花籽象鼻虫(redsunflowerseedweevil))；s.sordidusleconte(灰色葵花籽象鼻虫(graysunflowerseedweevil))；sphenophorusmaidischittenden(玉米象虫(maizebillbug))；叶甲科中的跳甲、黄瓜叶甲、根虫、叶甲虫、马铃薯甲虫和潜叶虫(包括但不限于：科罗拉多马铃薯甲虫(leptinotarsadecemlineatasay，coloradopotatobeetle)；玉米根萤叶甲(diabroticavirgiferavirgiferaleconte)(西方玉米根虫(westerncomrootworm))；北方玉米根虫(d.barberismithandlawrence)(北方玉米根虫(northerncornrootworm)))；斑点黄瓜甲虫(d.undecimpunctatahowardibarber)(南方玉米根虫(southerncornrootworm))；玉米跳甲(chaetocnemapulicariamelsheimer，cornfleabeetle)；十字花科条跳甲(phyllotretacruciferaegoeze，crueiferfleabeetle)；黄曲条跳甲(phyllotretastriolata，strippedfleabeetle)；colaspisbrunneafabricius(葡萄肖叶甲(grapecolaspis))；橙足负泥虫(oulemamelanopuslinnaeus)(谷物叶甲(cerealleafbeetle))；zygogrammaexclamationisfabricius(向日葵叶甲(sunflowerbeetle))；来自瓢虫科的甲虫(包括但不限于：墨西哥豆瓢虫(epilachnavarivestismulsant，mexicanbeanbeetle))；来自金龟子科的金龟子和其他甲虫(包括但不限于：日本金龟子(popilliajaponicanewman)(日本金龟(japanesebeetle))；cyclocephalaborealisarrow(北方独角仙(northernmaskedchafer)，蛴螬(whitegmb))；c.immaculataolivier(南方独角仙(southernmaskedchafer)，蛴螬(whitegrub))；欧洲切根鳃金龟(rhizotrogusmajalisrazoumowsky)(欧洲金龟子(europeanchafer))；具毛鳃角金龟(phyllophagacrinitaburmeister)(蛴螬(whitegrub))；ligyrusgibbosusdegeer(胡萝卜甲虫(carrotbeetle))；来自皮蠹科家族的红缘皮蠹；来自叩头虫科(elateridae)、伪金针虫属物种(eleodesspp.)、梳爪叩头虫属物种(melanotusspp.)的金针虫；宽胸金针虫属物种(conoderusspp.)；叩甲属物种(limoniusspp.)；缺隆叩甲属物种(agriotesspp.)；特尼塞拉属物种(cteniceraspp.)；埃俄罗斯属物种(aeolusspp.)；来自小蠹科(scolytidae)的树皮甲虫和来自拟步甲科(tenebrionidae)的甲虫。目的是双翅目的成虫和未成熟的虫，包括潜叶虫玉米斑潜蝇(agromyzaparvicornisloew)(玉米斑潜蝇(cornblotchleafminer))；瘿蚊(包括但不限于：高梁瘿蚊(contariniasorghicolacoquillett，sorghummidge)；小麦黑森瘿蚊(mayetioladestructorsay，hessianfly)；麦红吸浆虫(sitodiplosismosellanagéhin，wheatmidge)；向日葵籽瘿蚊(neolasiopteramurtfeldtianafelt，sunflowerseedmidge)；果蝇(实蝇科(tephritidae))，瑞典麦秆蝇(oscinellafritlinnaeus)(果蝇)；蛆(包括但不限于：灰地种蝇(deliaplaturameigen)(玉米种蛆(oscinellafrit))；麦地种蝇(d.coarctatafallen)(麦种蝇(wheatbulbfly))和其他地种蝇属物种，美洲麦秆蝇(meromyzaamericanafitch)(美洲麦秆蝇(wheatstemmaggot))；家蝇(muscadomesticalinnaeus，houseflies)；黄腹厕蝇(fanniacanicularislinnaeus)，f.femoralisstein(小家蝇(lesserhouseflies))；厩螫蝇(stomoxyscalcitranslinnaeus，stableflies)；秋家蝇(faceflies)、角蝇(hornflies)、丽蝇(blowflies)、金蝇属物种(chrysomyaspp.)；伏蝇属物种(phormiaspp.)和其他蝇状的蝇类有害生物，虻属物种(tabanusspp.)；肤蝇(botflies)胃蝇属物种(gastrophilusspp.)；狂蝇属物种(oestrusspp.)；纹皮蝇(cattlegrubs)皮蝇属物种(hypodermaspp.)；鹿虻(deerflies)斑虻属物种(chrysopsspp.)；绵羊虱蝇(melophagusovinuslinnaeus)(羊蜱蝇(keds))和其他短角亚目(brachycera)，蚊子伊蚊属物种(aedesspp.)；疟蚊属物种(anophelesspp.)；家蚊属物种(culexspp.)；黑蝇(blackflies)原蚋属物种(prosimuliumspp.)；蚋属物种(simuliumspp.)；蠓、沙蝇、眼菌蚊和长角亚目。作为目的昆虫包括了半翅目和同翅目的成虫和若虫，如但不限于：来自球蚜科(adelgidae)的球蚜、来自盲蝽科(miridae)的盲蝽、来自蝉科(cicadidae)的蝉、叶蝉、小绿叶蝉属(empoasca)物种；来自叶蝉科的，来自菱蜡蝉科(cixiidae)、青翅飞虱科(flatidae)、蜡蝉总科(fulgoroidea)、瓢蜡蝉科(issidae)和(delphacidae)的飞虱，来自角蝉科(membracidae)的角蝉，来自木虱科(psyllidae)的木虱，来自粉虱科(aleyrodidae)的粉虱，来自蚜科(aphididae)的蚜虫，来自根瘤蚜科(phylloxeridae)的葡萄根瘤蚜，来自粉蚧科(pseudococcidae)的粉蚧，来自链介壳虫科(asterolecanidae)、蚧科(coccidae)、粉蚧科(dactylopiidae)、盾蚧科(diaspididae)、绒蚧科(eriococcidae)、旌介壳虫科(ortheziidae)、刺葵介壳虫科(phoenicococcidae)和绵蚧科(margarodidae)的介壳虫，来自网蝽科的网蝽，来自蝽科(pentatomidae)的椿象，长蝽(cinchbug)，土长蝽属物种；和来自长蝽科的其他长蝽，来自沫蝉科的沫蝉，来自缘蝽科的瓜椿象和来自红蝽科的秋恙螨和污棉虫。来自同翅目的农艺学上重要成员进一步包括但不限于：acyrthisiphonpisumharris(豌豆蚜(peaaphid))；黑豆蚜(aphiscraccivorakoch)(豇豆蚜(cowpeaaphid))；甜菜蚜(a.fabaescopoli)(黑豆蚜(blackbeanaphid))；棉蚜(a.gossypiiglover)(棉蚜虫(cottonaphid，melonaphid))；槐蚜(a.maidiradicisforbes)(玉米根蚜(cornrootaphid)))；苹果蚜(a.pomidegeer，appleaphid)；绣线菊蚜(a.spiraecolapatch，spireaaphid)；茄沟无网蚜(aulacorthumsolanikaltenbach)(毛地黄蚜虫(foxgloveaphid))；草莓钉蚜(chaetosiphonfragaefoliicockerell)(草莓蚜(strawberryaphid))；麦双尾蚜(diuraphisnoxiakurdjumov/mordvilko，russianwheataphid)；车前圆尾蚜(dysaphisplantagineapaaserini)(红苹果蚜(rosyappleaphid))；苹果绵蚜(eriosomalanigerumhausmann，woollyappleaphid)；甘蓝蚜(brevicorynebrassicaelinnaeus，cabbageaphid)；大尾蚜(hyalopterusprunigeoffroy)(桃大尾蚜(mealyplumaphid))；萝卜蚜(lipaphiserysimikaltenbach，turnipaphid)；麦无网蚜(metopolophiumdirrhodumwalker)(谷物蚜虫(cerealaphid))；马铃薯蚜(macrosiphumeuphorbiaethomas，potatoaphid)；桃蚜(myzuspersicaesulzer)(桃-马铃薯蚜虫，绿桃蚜虫)；莴苣蚜(nasonoviaribisnigrimosley，lettuceaphid)；瘿绵蚜属物种(pemphigusspp.)(根蚜(rootaphid)和瘿蚜(gallaphid))；玉米蚜(rhopalosiphummaidisfitch，cornleafaphid)；稻麦蚜(r.padilinnaeus)(禾谷缢管蚜(birdcherry-oataphid))；麦二叉蚜(schizaphisgraminumrondani，greenbug)；甘蔗黄蚜(siphaflavaforbes，yellowsugarcaneaphid)；麦长管蚜(sitobionavenaefabricius，englishgrainaphid)；苜蓿斑蚜(therioaphismaculatabuckton，spottedalfalfaaphid)；茶二叉蚜(toxopteraaurantiiboyerdefonscolombe，blackcitrusaphid)和桔二叉蚜(t.citricidakirkaldy，browncitrusaphid)；球蚜属物种(adelgesspp.)(球蚜(adelgid))；phyloseradevastatrixpergande(山核桃木虱(pecanphylloxera))；烟粉虱(bemisiatabacigennadius)(烟粉虱(tobaccowhitefly)，甘薯粉虱(sweetpotatowhitefly))；银叶粉虱(b.argentifoliibellows&perring，silverleafwhitefly)；柑桔粉虱(dialeurodescitriashmead，citruswhitefly)；trialeurodesabutiloneus(带状有翼粉虱(bandedwingedwhitefly))和温室粉虱(t.vaporariorumwestwood，greenhousewhitefly)；马铃薯小绿叶蝉(empoascafabaeharris)(马铃薯叶蝉(potatoleafhopper))；灰飞虱(laodelphaxstriatellusfallen)(小褐飞虱(smallerbrownplanthopper))；macrolestesquadrilineatusforbes(紫菀叶蝉(asterleafhopper))；黑尾叶蝉(nephotettixcinticepsuhler)(青大叶蝉(greenleafhopper))；二条斑黑尾叶蝉(n.nigropictus)(稻叶蝉(riceleafhopper))；稻褐飞虱(nilaparvatalugens)(褐飞虱(brownplanthopper))；玉米蜡蝉(peregrinusmaidisashmead)(玉米飞虱(cornplanthopper))；白背飞虱(sogatellafurciferahorvath，white-backedplanthopper)；稻飞虱(sogatodesorizicolamuir，ricedelphacid)；typhlocybapomariamcatee(白苹果叶蝉(whiteappleleafhopper))；葡萄斑叶蝉属物种(erythroneouraspp.)(葡萄叶蝉(grapeleafhopper))；十七年蝉(magicicadaseptendecimlinnaeus)(晚秀蝉(periodicalcicada))；吹绵蚧(iceryapurchaseasimaskell，cottonycushionscale)；梨圆蚧(quadraspidiotusperniciosuscomstock，sanjosescale)；桔粉蚧(planococcuscitririsso，citrusmealybug)；粉蚧属物种(pseudococcusspp.)(其他粉蚧复合体)；梨木虱(cacopsyllapyricolafoerster，pearpsylla)；triozadiospyriashmead(柿木虱(persimmonpsylla))。来自半翅目的农艺学上重要的物种包括但不限于：喜绿蝽(acrosternumhilaresay，greenstinkbug)；南瓜缘蝽(anasatristisdegeer，squashbug)；blissusleucopterusleucopterussay(麦长蝽(chinchbug))；corythucagossypiifabricius(棉网蝽(cottonlacebug))；cyrtopeltismodestadistant(番茄虫(tomatobug))；dysdercussuturellusherrich-(污棉虫(cottonstainer))；褐臭蝽(euschistusservussay，brownstinkbug)；e.variolariuspalisotdebeauvois(单斑椿象(one-spottedstinkbug))；红腺长蝽属物种(graptostethusspp.)(长蝽的复合体)；leptoglossuscorculussay(叶足松树长蝽(leaf-footedpineseedbug))；美洲牧草盲蝽(lyguslineolarispalisotdebeauvois)(牧草盲蝽(tarnishedplantbug))；豆荚盲蝽(l.hesperusknight)(西方牧草盲蝽(westerntarnishedplantbug))；牧草盲蝽(l.pratensislinnaeus)(常见的草地虫)；长毛草盲蝽(l.rugulipennispoppius)(欧洲牧草盲蝽(europeantarnishedplantbug))；lygocorispabulinuslinnaeus(苹绿盲蝽(commongreencapsid))；南方绿椿象(nezaraviridulalinnaeus)(南方喜绿蝽(southerngreenstinkbug))；美洲稻蝽(oebaluspugnaxfabricius)(稻椿象(ricestinkbug))；马利筋长蝽(oncopeltusfasciatusdallas)(大马利筋长蝽(largemilkweedbug))；棉跳盲蝽(pseudatomoscelisseriatusreuter，cottonfleahopper)。此外，实施例可能对半翅目有效，如calocorisnorvegicusgmelin(草莓虫(strawberrybug))；orthopscampestrislinnaeus；plesiocorisrugicollisfallen(苹盲蝽(applecapsid))；cyrtopeltismodesmsdistant(番茄虫(tomatobug))；黑斑烟盲铸(cyrtopeltisnotatusdistant)(吸蝇(suckfly))；spanagonicusalbofasciatusreuter(水印跳盲蝽(whitemarkedfleahopper))；diaphnocorischlorionissay(皂荚植食蝽(honeylocustplantbug))；labopidicolaalliiknight(洋葱植食蝽(onionplantbug))；棉跳盲蝽(pseudatomoscelisseriatusreuter，cottonfleahopper)；adelphocorisrapidussay(快速植食蝽(rapidplantbug))；poecilocapsuslineatusfabricius(四线植食蝽(four-linedplantbug))；小长蝽(nysiusericaeschilling)(谷长蝽(falsechinchbug))；nysiusraphanushoward(谷长蝽(falsechinchbug))；南方绿椿象(nezaraviridulalinnaeus)(南方喜绿蝽(southerngreenstinkbug))；扁盾蝽属物种(eurygasterspp.)；缘蝽属物种(coreidaespp.)；红蝽属物种(pyrrhocoridaespp.)；谷蛾属物种(tinidaespp.)；负子蝽科物种(blostomatidaespp.)；猎蝽属物种(reduviidaespp.)和臭虫属物种(cimicidaespp.)。还包括蜱螨目(螨)的成虫和幼虫，如aceriatosichellakeifer(小麦卷曲螨(wheatcurlmite))；麦岩螨(petrobialatensmüller)(棕色小麦螨(brownwheatmite))；叶螨科中的蜘蛛螨(spidermite)和红螨(redmite)，苹果全爪螨(panonychusulmikoch)(欧洲红螨(europeanredmite))；二点叶螨(tetranychusurticaekoch，twospottedspidermite)；迈叶螨(t.medanielimcgregor，mcdanielmite)；朱砂虫螨(t.cinnabarinusboisduval)(胭脂红蜘蛛螨(carminespidermite))；t.turkestaniugarov&nikolski(草莓蜘蛛螨(strawberryspidermite))；细须螨科中的平螨，短须螨(brevipalpuslewisimcgregor)(柑橘平螨(citrusflatmite))；瘿螨科中的锈螨和蚜螨，和其他叶子喂养的螨虫和在人类和动物健康方面有重要影响的螨虫，蠕形螨科中的毛囊螨，食甜螨科中的谷物螨，蜱亚目中的蜱。肩突硬蜱(ixodesscapularissay)(鹿蜱(deertick))；全环硬蜱(i.holocyclusneumann)(澳大利亚麻痹蜱(australianparalysistick))；变异革蜱(dermacentorvariabilissay)(美洲犬蜱(americandogtick))；美洲钝眼蜱(amblyommaamericanumlinnaeus)(孤星蜱(lonestartick))和痒螨科、蒲螨科和疥螨科中的疥螨和痒螨。目的是缨尾目的昆虫有害生物，如衣鱼(lepismasaccharinalinnaeus)(蠹虫(silverfish))；家衣鱼(thermobiadomesticapackard，firebrat)。目的昆虫有害生物包括椿象和其他相关昆虫的超家族，包括但不限于属于以下各科的物种：蝽科(稻绿蝽、茶翅蝽(halyomorphahalys)、piezodorusguildini、褐臭蝽、拟绿蝽、英雄美洲蝽(euschistusheros)、美洲蝽(euschistustristigmus)、拟绿蝽、褐蝽(dichelopsmelacanthus)、和蓓蝽(bagradahilaris)(蓓蝽(bagradabug)))，龟蝽科(plataspidae)(筛豆龟蝽(megacoptacribraria)-豆平腹蝽蟓(beanplataspid))和土蝽科(scaptocoriscastanea-rootstinkbug)，以及鳞翅目物种包括但不限于：小菜蛾，例如，玉米穗虫；大豆尺蠖，例如，大豆尺夜蛾(pseudoplusiaincludenswalker)，以及绒毛豆毛虫，例如，大豆夜蛾(anticarsiagemmatalishübner)。ii.靶标序列如本文所使用的，“靶标序列”或“靶标多核苷酸”包括有害生物中的希望降低其表达水平的任何序列。在某些实施例中，降低所述靶标序列在有害生物中的表达水平能防治该有害生物。例如，该靶标序列可以是生长和发育所必需的。靶标序列的非限制性实例包括seqidno.：1-53或107-254中所示的多核苷酸，或其变体和片段、及其互补序列。如本文别处所示例的，降低这些靶标序列中的一者或多者在鞘翅目植物有害生物或叶甲属植物有害生物中的表达水平能防治有害生物。iii.沉默元件“沉默元件”意指当被植物昆虫有害生物接触或摄取时能够降低或消除靶标多核苷酸或其编码的多肽的水平或表达的多核苷酸。因此，应当理解的是，本文所用的“沉默元件”包含如下多核苷酸：例如rna构建体、双链rna(dsrna)、发夹rna以及正义和/或反义rna。在一个实施例中，所用的沉默元件可通过影响靶标rna转录物的水平，或者可替代地，通过影响翻译并由此影响所编码的多肽的水平来降低或消除靶标序列的表达水平。本文别处披露了测定功能性沉默元件的方法，该沉默元件能够降低或消除目的序列的水平。披露的方法中所采用的单个多核苷酸可包含针对相同或不同靶标多核苷酸的一个或多个沉默元件。该沉默元件可在体内(即，在宿主细胞诸如植物或微生物中)或体外生成。在某些实施例中，沉默元件可以包含如下嵌合构建分子，该嵌合构建分子包含两个或更多个本披露的序列或其部分。例如，该嵌合构建体可为如本文所披露的发夹或dsrna。嵌合体可包含两个或更多个所披露的序列或其部分。在一个实施例中，设想出嵌合体具有本文所示的两个互补序列或其部分，这两个互补序列之间具有一定程度的错配，使得这两个序列彼此并非完全互补。在单一沉默元件中提供至少两个不同序列可以允许使用一个沉默元件和/或例如一个表达盒靶向多个基因。靶向多个基因可以允许减缓或降低有害生物抗性的可能性。此外，在一个表达的分子中提供多重靶向能力可减轻经转化的植物或植物产物的表达负担，或提供能够用一次施用靶向多个宿主的局部处理。在某些实施例中，虽然沉默元件能防治有害生物，但优选地沉默元件对正常植物或植物部分无作用。如下文进一步详细讨论的，沉默元件可以包括但不限于，有义抑制元件、反义抑制元件、双链rna、sirna、amirna、mirna或发夹抑制元件。在实施例中，沉默元件可以包含如下嵌合体，其中在相同的rna分子中发现两个或更多个本披露的序列、或者活性片段或变体、或者其互补序列。在各种实施例中，本披露的序列、或者活性片段或变体、或者其互补序列可以作为多于一个拷贝存在于dna构建体、沉默元件、dna分子或rna分子中。在发夹或dsrna分子中，有义或反义序列在分子中的位置(例如，其中序列首先进行转录或位于该rna分子的具体末端上)对所披露的序列来说并不是限制性的，并且dsrna不受本文公开内容中这种序列的具体位置的限制。可用于降低这些靶标序列表达的沉默元件的非限制性实例，包括该有义或反义序列的片段或变体，或者可替代地，由该有义或反义序列和seqidno.：1-53或107-254中所示序列、或者其变体和片段、及其互补序列组成。该沉默元件可以进一步包含有利地影响转录和/或所得转录物的稳定性的另外的序列。例如，该沉默元件可以在3′端包含至少一个胸腺嘧啶残基。这有助于稳定。因此，该沉默元件在3′端可具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个胸腺嘧啶残基。如下文进一步详细讨论的，增强子抑制元件也可以与本文所披露的沉默元件结合使用。通过“减少”或“降低”多核苷酸或由其编码的多肽的表达水平，旨在表示，该靶标序列的多核苷酸或多肽水平在统计学上低于适当的对照有害生物中相同靶标序列的多核苷酸水平或多肽水平，该对照有害生物没有暴露于(即没有摄取或接触)沉默元件。在具体实施例中，本文披露的方法和/或组合物降低植物昆虫有害生物中靶标序列的多核苷酸水平和/或多肽水平，得到多核苷酸水平和/或多肽水平是适当的对照有害生物中相同靶标序列的多核苷酸水平或由其编码的多肽的水平的小于95％、小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％。在一些实施例中，沉默元件与靶标多核苷酸具有大量的序列同一性，通常大于约65％序列同一性，大于约85％序列同一性，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。此外，沉默元件可以与靶标多核苷酸的一部分互补。通常，可以使用seqidno.：1-53或107-254中任一项所示的序列、或者其变体和片段、及其互补序列的至少15、16、17、18、19、20、22、25、50、100、200、300、400、450个或更多个连续核苷酸的序列。本文别处讨论了测定rna转录物水平、经编码的多肽水平、或者该多核苷酸或多肽活性的方法。i.有义抑制元件如本文所使用的，“有义抑制元件”包括如下多核苷酸，该多核苷酸被设计用于表达对应于“有义”方向的靶标信使rna的至少一部分的rna分子。包含有义抑制元件的rna分子的表达能降低或消除靶标多核苷酸或由其编码的多肽的水平。包含有义抑制元件的多核苷酸可以对应于靶标多核苷酸序列的全部或一部分、靶标多核苷酸的5′和/或3′非翻译区的全部或一部分、靶标多核苷酸的编码序列的全部或一部分、或靶标多核苷酸的编码序列和非翻译区二者的全部或一部分。通常，有义抑制元件与靶标多核苷酸具有大量的序列同一性，通常大于约65％序列同一性，大于约85％序列同一性，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。参见美国专利号5，283，184和5，034，323；以上专利通过引用并入本文。有义抑制元件可以是任何长度的，只要其允许抑制靶标序列即可。该有义抑制元件可以是例如，seqidno.：1-53或107-254中任一个所示的靶标多核苷酸、或其变体和片段、以及其互补序列的15、16、17、18、19、20、22、25、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、900、1000、1100、1200、1300个核苷酸或更长。在其他实施例中，该有义抑制元件可以是例如，seqidno.：1-53或107-254中任一个所示的靶标多核苷酸、或其变体和片段、以及其互补序列的约15-25、19-35、19-50、25-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1050、1050-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800个核苷酸或更长。ii.反义抑制元件如本文所使用的，“反义抑制元件”包括被设计用于表达与靶标信使rna的全部或部分互补的rna分子的多核苷酸。反义rna抑制元件的表达能降低或消除靶标多核苷酸的水平。用于反义抑制中的多核苷酸可以对应于编码靶标多核苷酸的序列的互补序列的全部或部分、靶标多核苷酸的5′和/或3′非翻译区的互补序列的全部或部分、靶标多核苷酸的编码序列的互补序列的全部或部分、或靶标多核苷酸的编码序列和非翻译区两者的互补序列的全部或部分。此外，该反义抑制元件可以与靶标多核苷酸完全互补(即，与靶标序列的互补序列100％相同)或部分互补(即，与靶标序列的互补序列低于100％相同)。在某些实施例中，该反义抑制元件包含与靶标多核苷酸的至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列互补性。反义抑制可用于抑制同一植物中多种蛋白质的表达。参见例如美国专利号5,942,657。此外，该反义抑制元件可以与靶标多核苷酸的一部分互补。通常，可以使用seqidno.：1-53或107-254中任一项所示的序列、或者其变体和片段、及其互补序列的至少15、16、17、18、19、20、22、25、50、100、200、300、400、450个或更多个核苷酸的序列。用于使用反义抑制来抑制植物中内源基因表达的方法描述于以下文献中：例如，liu等人(2002)plantphysiol.[植物生理学]129：1732-1743和美国专利号5,942,657(其通过引用并入本文)。iii.双链rna抑制元件“双链rna沉默元件”或“dsrna”包含至少一种能够在被植物昆虫有害生物摄取之前或之后形成dsrna的转录物。因此，“dsrna沉默元件”包括dsrna、能够形成dsrna的转录物或多核糖核苷酸或超过一种能够形成dsrna的转录物或多核糖核苷酸。“双链rna”或“dsrna”是指由单个自互补的rna分子形成的多核糖核苷酸结构或由至少两个不同的rna链的表达形成的多核糖核苷酸结构。所披露的方法和组合物中使用的一种或多种dsrna分子介导靶标序列表达的降低，例如通过以序列特异性方式介导rna干扰“rnai”或基因沉默。在各种实施例中，dsrna能够降低或消除植物昆虫有害生物中靶标多核苷酸或由其编码的多肽的水平或表达。dsrna可以通过影响靶标rna转录物的水平、通过影响翻译并从而影响经编码的多肽的水平、或通过影响转录前水平上的表达(即，经由染色质结构的调节、甲基化状态等来改变基因表达)来降低或消除靶标序列的表达水平。例如，参见verdel等人，(2004)science[科学]303：672-676；pal-bhadra等人，(2004)science[科学]303：669-672；allshire，(2002)science[科学]297：1818-1819；volpe等人，(2002)science[科学]297：1833-1837；jenuwein，(2002)science[科学]297：2215-2218；以及hall等人，(2002)science[科学]297：2232-2237。本文别处披露了测定功能性dsrna的方法，该dsrna能够降低或消除目的序列的水平。因此，如本文所使用的，术语“dsrna”意在包括用于描述能够介导rna干扰或基因沉默的核酸分子的其他术语，包括例如短干扰rna(sirna)、双链rna(dsrna)、微rna(mirna)、发夹rna、短发夹rna(shrna)、转录后基因沉默rna(ptgsrna)等。在某些实施例中，dsrna的双链体或双链区域的至少一条链与靶标多核苷酸共享足够的序列同一性或序列互补性，以允许dsrna降低靶标序列的表达水平。在一些实施例中，dsrna与靶标多核苷酸具有大量的序列同一性，通常大于约65％序列同一性，大于约85％序列同一性，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。此外，dsrna元件可以与靶标多核苷酸的一部分互补。通常，可以使用seqidno.：1-53或107-254中任一项所示的序列、或者其变体和片段、及其互补序列的至少15、16、17、18、19、20、22、25、50、100、200、300、400、450个或更多个核苷酸的序列。如本文所使用的，与靶标多核苷酸互补的链是“反义链”，并且与靶标多核苷酸同源的链是“有义链”。在另一个实施例中，dsrna包含发夹rna。发夹rna包含能够折回到自身上以形成双链结构的rna分子。多种结构都可以用作发夹元件。在某些实施例中，该dsrna抑制元件包含如下发夹元件，该发夹元件依次包含第一区段、第二区段和第三区段，其中该第一和第三区段共享足够的互补性，以允许经转录的rna形成双链茎环结构。该发夹的“第二区段”包含“环”或“环区”。这些术语在本文中作为同义词使用，并且广义地被解释为包含任何如下核苷酸序列，该核苷酸序列赋予足够灵活性以允许多核苷酸的互补区域(即，形成发夹茎的区段1和3)之间发生自配对。例如，在一些实施例中，该环区域可以基本上是单链的并且作为发夹茎环的自互补区域之间的间隔区。在一些实施例中，该环区可以包含随机或无义核苷酸序列，并且因此不与靶标多核苷酸共享序列同一性。在其他实施例中，该环区包含与靶标多核苷酸共享同一性的有义或反义rna序列或者其片段。参见，例如，国际专利公开号wo02/00904。在某些实施例中，该环序列可以包括内含子序列、源自内含子序列的序列、与内含子序列同源的序列、或经修饰的内含子序列。该内含子序列可以是与衍生出区段1和3相同或不同物种中发现的序列。在某些实施例中，可以将环区优化为尽可能短，同时仍然提供足够的分子内灵活性以允许形成碱基配对的茎区。因此，该环序列通常小于1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、25、20、19、18、17、16、15、10个核苷酸或更少。发夹rna分子的“第一”和“第三”区段包含发夹结构的碱基配对的茎。第一和第三区段是彼此的反向重复序列，并且共享足够的互补性以允许形成碱基配对的茎区。在某些实施例中，第一和第三区段彼此完全互补。可替代地，第一和第三区段可以彼此部分互补，只要它们能够彼此杂交形成碱基配对的茎区就可以。第一和第三区段之间的互补性的量可以计算为整个区段的百分比。因此，发夹rna的第一和第三区段通常共享至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、至多且包括100％的互补性。第一和第三区段至少约为1000、500、475、450、425、400、375、350、325、300、250、225、200、175、150、125、100、75、60、50、40、30、25、22、20、19、18、17、16、15或10个核苷酸的长度。在某些实施例中，该第一和/或第三区段的长度为约10-100个核苷酸、约10至约75个核苷酸、约10至约50个核苷酸、约10至约40个核苷酸、约10至约35个核苷酸、约10至约30个核苷酸、约10至约25个核苷酸、约10至约19个核苷酸、约10至约20个核苷酸、约19至约50个核苷酸、约50个核苷酸至约100个核苷酸、约100个核苷酸至约150个核苷酸、约100个核苷酸至约300个核苷酸、约150个核苷酸至约200个核苷酸、约200个核苷酸至约250个核苷酸、约250个核苷酸至约300个核苷酸、约300个核苷酸至约350个核苷酸、约350个核苷酸至约400个核苷酸、约400个核苷酸至约500个核苷酸、约600nt、约700nt、约800nt、约900nt、约1000nt、约1100nt、约1200nt、1300nt、1400nt、1500nt、1600nt、1700nt、1800nt、1900nt、2000nt或更长。在其他实施例中，第一和/或第三区段的长度包含至少10-19个核苷酸、10-20个核苷酸；19-35个核苷酸、20-35个核苷酸；30-45个核苷酸；40-50个核苷酸；50-100个核苷酸；100-300个核苷酸；约500-700个核苷酸；约700-900个核苷酸；约900-1100个核苷酸；约1300-1500个核苷酸；约1500-1700个核苷酸；约1700-1900个核苷酸；约1900-2100个核苷酸；约2100-2300个核苷酸；或约2300-2500个核苷酸。参见，例如国际公开号wo02/00904。本披露的发夹分子或双链rna分子可以具有在该rna分子的相同部分中发现的多于一个本披露的序列或活性片段或变体或者其互补序列。例如，在嵌合发夹结构中，发夹分子的第一区段包含两个多核苷酸部分，每个具有不同的本披露的序列。例如，从发夹的一个末端开始读，第一区段由来自两个单独基因(a之后是b)的序列构成。该第一区段后面是第二区段，即发夹的环部分。该环区段之后是第三区段，其中发现第一区段中的序列的互补链(b*之后是a*)形成了发夹结构的茎环，该茎包含茎远端的seqa-a*以及邻近环区的seqb-b*。在某些实施例中，该第一和第三区段包含与该第一区段具有至少85％互补性的至少20个核苷酸。在其他实施例中，形成发夹的茎-环结构的第一和第三区段包含具有不成对的核苷酸残基的3′或5’悬垂区域。在某些实施例中，第一、第二和/或第三区段中使用的序列包含设计为与目的靶标多核苷酸具有足够的序列同一性并且从而具有降低靶标多核苷酸的表达水平的能力的结构域。抑制性rna转录物的特异性因此通常由沉默元件的这些结构域赋予。因此，在一些实施例中，沉默元件的第一、第二和/或第三区段包含具有至少10、至少15、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少40、至少50、至少100、至少200、至少300、至少500、至少1000或1000个以上的核苷酸的结构域，这些核苷酸与靶标多核苷酸共享足够的序列同一性，以允许在合适的细胞中表达时降低靶标多核苷酸的表达水平。在其他实施例中，该结构域介于约15至50个核苷酸之间、约19-35个核苷酸之间、约20-35个核苷酸之间、约25-50个核苷酸之间、约19至75个核苷酸之间、约20至75个核苷酸之间、约40-90个核苷酸之间、约15-100个核苷酸之间、10-100个核苷酸之间、约10至约75个核苷酸之间、约10至约50个核苷酸之间、约10至约40个核苷酸之间、约10至约35个核苷酸之间、约10至约30个核苷酸之间、约10至约25个核苷酸之间、约10至约20个核苷酸之间、约10至约19个核苷酸之间、约50个核苷酸至约100个核苷酸之间、约100个核苷酸至约150个核苷酸之间、约150个核苷酸至约200个核苷酸之间、约200个核苷酸至约250个核苷酸之间、约250个核苷酸至约300个核苷酸之间、约300个核苷酸至约350个核苷酸之间、约350个核苷酸至约400个核苷酸之间、约400个核苷酸至约500个核苷酸之间或更长。在其他实施例中，第一和/或第三区段的长度包含至少10-20个核苷酸、至少10-19个核苷酸、20-35个核苷酸、30-45个核苷酸、40-50个核苷酸、50-100个核苷酸、或约100-300个核苷酸。在某些实施例中，第一、第二和/或第三区段的结构域与靶标多核苷酸具有100％序列同一性。在其他实施例中，与靶标多核苷酸具有同源性的第一、第二和/或第三区段的结构域与该靶标多核苷酸的区域具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。与靶标多核苷酸互补的第一、第二和/或第三区段的结构域的序列同一性只需足以降低目的靶标多核苷酸的表达即可。参见，例如chuang和meyerowitz(2000)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]97∶4985-4990；stoutjesdijk等人(2002)plantphysiol.[植物生理学]129∶1723-1731；waterhouse和helliwell(2003)nat.rev.genet.[遗传学自然评论]4∶29-38；pandolfini等人bmcbiotechnology[bmc生物技术学]3∶7，以及美国专利公开号20030175965；其各自通过引用并入本文。用于测定hprna构建体至沉默基因体内表达的效率的瞬时测定法已在以下文献中进行描述：panstruga等人(2003)mol.biol.rep.[分子生物学导报]30：135-140。第一、第二和/或第三区段与靶标多核苷酸之间共享的互补性的量或第一区段与第三区段(即，发夹结构的茎)之间共有的互补性的量可以根据其基因表达需要被防治的生物体而有所不同。一些生物体或细胞类型可能需要精确配对或100％同一性，而其他生物体或细胞类型可以容忍一些错配。在一些细胞中，例如，靶向序列中的单一核苷酸错配消除了抑制基因表达的能力。在这些细胞中，所披露的抑制盒可以用于靶向突变基因的抑制，例如其转录物包含点突变的癌基因，并因此可使用本发明的方法和组合物特异性地靶向这些癌基因而不改变其余野生型等位基因的表达。在其他生物体中，可以容忍整体序列变异性，只要该序列的某个22nt区域表现出靶标多核苷酸与抑制盒之间的100％同源性即可。可以使用靶标多核苷酸的任何区域来设计共享足够序列同一性的沉默元件的结构域，以允许发夹转录物的表达来降低靶标多核苷酸的水平。例如，可以将结构域设计为与一种或多种靶标多核苷酸的5′非翻译区、一种或多种靶标多核苷酸的3′非翻译区、一种或多种靶标多核苷酸的外显子区、一种或多种靶标多核苷酸的内含子区以及其任何组合共享序列同一性。在某些实施例中，该沉默元件的结构域与来自靶标序列的约核苷酸1-50、25-75、75-125、50-100、125-175、175-225、100-150、150-200、200-250、225-275、275-325、250-300、325-375、375-425、300-350、350-400、425-475、400-450、-475-525、450-500、525-575、575-625、550-600、625-675、675-725、600-650、625-675、675-725、650-700、725-825、825-875、750-800、875-925、925-975、850-900、925-975、975-1025、950-1000、1000-1050、1025-1075、1075-1125、1050-1100、1125-1175、1100-1200、1175-1225、1225-1275、-1200-1300、1325-1375、1375-1425、1300-1400、1425-1475、1475-1525、1400-1500、1525-1575、1575-1625、1625-1675、1675-1725、1725-1775、1775-1825、-1825-1875、1875-1925、1925-1975、1975-2025、2025-2075、2075-2125、2125-2175、2175-2225、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000的至少约15、16、17、18、19、20、22、25或30个连续核苷酸共享足够的同一性、同源性、或与其互补。在某些情况下，为了优化发夹中使用的sirna序列，可以使用合成的寡脱氧核糖核苷酸/rnaseh法确定靶标mrna上易经受rna沉默的构象中的位点。参见，例如vickers等人(2003)j.biol.chem[生物化学杂志]278：7108-7118和yang等人(2002)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]99：9442-9447，这些文献通过引用并入本文。这些研究表明，rnase-h-敏感位点与促进有效的sirna导向的mrna降解的位点之间具有显著的相关性。还可对发夹沉默元件进行设计，使得有义序列或反义序列不对应于靶标多核苷酸。在这个实施例中，该反义和有义序列侧翼于如下环序列，该环序列包含对应于靶标多核苷酸的全部或部分的核苷酸序列。因此，是环区决定了rna干扰的特异性。参见，例如wo02/00904。另外，可以通过使用发夹抑制元件实现转录基因沉默(tgs)，其中该发夹的反向重复序列与待沉默的靶标多核苷酸的启动子区域共享序列同一性。参见，例如，aufsatz等人(2002)pnas99(增刊4)：16499-16506和mette等人(2000)emboj19(19)：5194-5201。在其他实施例中，该沉默元件可包含小rna(srna)。srna可以包含微rna(mirna)和短干扰rna(sirna)两者(meister和tuschl(2004)nature[自然]431：343-349和bonetta等人(2004)naturemethods[自然方法]1：79-86)。mirna是长度为约19至约24个核糖核苷酸的调控剂，其能高效抑制靶标多核苷酸的表达。参见例如javier等人(2003)nature[自然]425：257-263。对于mirna干扰，可以将该沉默元件设计用来表达形成发夹结构或部分碱基配对的结构的dsrna分子，该发夹结构或部分碱基配对的结构包含与目的靶标多核苷酸互补的19、20、21、22、23、24或25个核苷酸序列。该mirna可以经合成产生，或被转录为更长的rna，该更长的rna随后裂解，以产生活性mirna。具体地讲，mirna可以包含与有义方向上的靶标多核苷酸具有同源性的序列的19个核苷酸，以及与有义序列互补的相应反义序列的19个核苷酸。该mirna可以是“人造mirna”或包含mirna序列的“amirna”，该mirna序列以合成的方式被设计用来使靶标序列沉默。当表达mirna时，最终的(成熟的)mirna以双链体存在于前体主链结构中，这两条链被称为mirna(将最终与靶标进行碱基配对的链)和mirna*(星号序列)。已经证明mirna可以以转基因的方式被表达并且目的靶基因可以被有效地沉默(highlyspecificgenesilencingbyartificialmicrornasinarabidopsis[在拟南芥中通过人造微rna进行高度特异性基因沉默]，schwabr，ossowskis，riesterm，warthmannn，weigeld，plantcell.[植物细胞]2006年5月；18(5)：1121-33.epub2006年3月10日；以及expressionofartificialmicrornasintransgenicarabidopsisthalianaconfersvirusresistance[人造微rna在转基因拟南芥中的表达赋予病毒抗性]，niuqw，linss，reyesjl，chenkc，wuhw，yehsd，chuanh，natbiotechnol.[自然生物技术]2006年11月；24(11)：1420-8，epub2006年10月22日.勘误表在natbiotechnol.[自然生物技术]2007年2月；25(2)：254中)。用于mirna干扰的沉默元件包含mirna一级序列。该mirna一级序列包含如下dna序列，该dna序列具有被环间隔开的mirna和星号序列，以及侧翼于该区域的对于加工重要的另外的序列。当表达为rna时，该一级mirna的这种结构使得允许形成如下发夹rna结构，该发夹rna结构可被加工成成熟的mirna。在一些实施例中，mirna主链包含基因组的或cdnamirna前体序列，其中所述序列包含在其中插入异源(人造)成熟mirna和星号序列的天然一级序列。如本文所使用的，“星号序列”是与mirna互补的mirna前体主链内的序列，并与mirna形成双链体以形成发夹rna的茎结构。在一些实施例中，该星号序列可以包含与mirna序列的小于100％的互补性。可替代地，该星号序列可以包含与mirna序列的至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％或更低的序列互补性，只要该星号序列与mirna序列具有足以形成双链结构的互补性即可。在仍另外的实施例中，该星号序列包含与mirna序列具有1、2、3、4、5或更多个错配的序列并且仍然具有足够的互补性以与mirna序列形成双链结构，从而导致mirna的生成和靶标序列的抑制。该mirna前体主链可来自任何植物。在一些实施例中，该mirna前体主链来自单子叶植物。在其他实施例中，该mirna前体主链来自双子叶植物。在另外的实施例中，该主链来自玉米或大豆。之前已对微rna前体主链进行了描述。例如，us20090155910a1(wo2009/079532)披露了下列大豆mirna前体主链：156c、159、166b、168c、396b和398b，并且us20090155909a1(wo2009/079548)披露了下列玉蜀黍mirna前体主链：159c、164h、168a、169r和396h。因此，可以改变一级mirna以允许异源mirna和星号序列有效插入到mirna前体主链内。在此类情况下，使用pcr技术将mirna前体主链的mirna区段和星号区段替换为设计用来靶向任何目的序列的异源mirna和异源星号序列，并克隆到表达构建体中。人们认识到，将人造mirna和星号序列插入该主链的位置处可能会发生改变。用于将mirna和星号序列插入mirna前体主链中的详细方法描述于例如美国专利申请20090155909a1和us20090155910a1中。当设计mirna序列和星号序列时，可作出各种设计选择。参见，例如，schwabr等人(2005)devcell[发育细胞]8：517-27。在非限制性实施例中，本文所披露的mirna序列可具有5′端的“u”、第19个核苷酸位置处的“c”或“g”、以及第10个核苷酸位置处的“a”或“u”。在其他实施例中，mirna的这种设计使得mirna具有如用zipfold算法计算得到的高自由δ-g(markham，n.r.和zuker，m.(2005)nucleicacidsres.[核酸研究]33：w577-w581)。任选地，在mirna的5′部分内可添加一个碱基对改变，以使该序列与靶标序列相差一个核苷酸。本文披露的方法和组合物使用dna构建体，所述dna构建体在转录时“形成”沉默元件(例如dsrna分子)。所述方法和组合物还可以包含含有编码沉默元件的dna构建体的宿主细胞。在另一个实施例中，所述方法和组合物还可以包含含有编码沉默元件的dna构建体的转基因植物。因此，正在被表达的异源多核苷酸不需要自己形成dsrna，而可以与植物细胞中或摄食后的有害生物肠中的其他序列相互作用，以允许形成dsrna。例如，可以通过将包含mirna或sirna靶标序列的嵌合构建体表达到与待沉默的一个或多个基因的全部或一部分相对应的序列中，来生成能够选择性沉默靶标多核苷酸的嵌合多核苷酸。在这个实施例中，当mirna或sirna的靶标与细胞中存在的mirna相互作用时，“形成”dsrna。然后所得的dsrna可以降低待沉默的一个或多个基因的表达水平。参见例如美国申请公开2007-0130653，题目为“methodsandcompositionsforgenesilencing[用于基因沉默的方法和组合物]”。可以将该构建体设计为具有内源性mirna的靶标，或者可替代地，可以在该构建体中使用的异源的和/或合成的mirna的靶标。如果使用异源的和/或合成的mirna，可以将其引入与嵌合多核苷酸相同的核苷酸构建体上或单独的构建体上的细胞中。如本文别处所述的，可以用任何方法来引入包含该异源mirna的构建体。ⅳ.变体和片段“片段”意在是多核苷酸的一部分或者氨基酸序列和因此由其编码的蛋白质的一部分。多核苷酸的片段可以编码保留天然蛋白的生物活性的蛋白质片段。可替代地，可用作沉默元件的多核苷酸片段不必编码保留生物活性的片段蛋白质。因此，核苷酸序列的片段的范围为至少约10个核苷酸、约15个核苷酸、约16个核苷酸、约17个核苷酸、约18个核苷酸、约19个核苷酸、约20个核苷酸、约22个核苷酸、约50个核苷酸、约75个核苷酸、约100个核苷酸、200个核苷酸、300个核苷酸、400个核苷酸、500个核苷酸、600个核苷酸、700个核苷酸并且最多且包括比所使用的全长多核苷酸少一个核苷酸。可替代地，核苷酸序列的片段的范围可以为seqidno.：1-53或107-254中任一项、或者其变体和片段、及其互补序列的1-50、25-75、75-125、50-100、125-175、175-225、100-150、100-300、150-200、200-250、225-275、275-325、250-300、325-375、375-425、300-350、350-400、425-475、400-450、475-525、450-500、525-575、575-625、550-600、625-675、675-725、600-650、625-675、675-725、650-700、725-825、825-875、750-800、875-925、925-975、850-900、925-975、975-1025、950-1000、1000-1050、1025-1075、1075-1125、1050-1100、1125-1175、1100-1200、1175-1225、1225-1275、1200-1300、1325-1375、1375-1425、1300-1400、1425-1475、1475-1525、1400-1500、1525-1575、1575-1625、1625-1675、1675-1725、1725-1775、1775-1825、1825-1875、1875-1925、1925-1975、1975-2025、2025-2075、2075-2125、2125-2175、2175-2225、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000。测定期望的沉默元件的活性的方法在本文其他地方进行了描述。“变体”意指基本上相似的序列。对于多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸中的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的取代。可用作沉默元件的多核苷酸的变体将保留降低靶标多核苷酸表达的能力，并且在一些实施例中，因此能防治目的植物昆虫有害生物。如在此使用，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸，保守的变体包括如下那些序列，由于遗传密码的简并性而，该序列编码所披露的多肽之一的氨基酸序列。变体多核苷酸还包括通过合成衍生的多核苷酸，诸如那些例如通过使用定点诱变产生但继续保留所需活性的多核苷酸。通常，如通过本文别处所描述的序列比对程序和参数确定的，具体的经披露的多核苷酸(即，沉默元件)的变体将与该具体的多核苷酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。具体的经披露的多核苷酸(即参照多核苷酸)的变体还可通过比较由变体多核苷酸所编码的多肽与由该参照多核苷酸所编码的多肽之间的序列同一性百分数来进行评价。可以使用本文别处描述的序列比对程序和参数计算任何两个多肽之间的百分比序列同一性。当通过比较由它们编码的两个多肽共有的序列同一性百分数来评估所使用的给定的所披露的多核苷酸对时，两个经编码的多肽之间的序列同一性百分数为至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。以下术语用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参照序列′，(b)“比较窗口”，(c)“序列同一性”以及(d)“序列同一性百分数”。(a)如在此使用，“参照序列”是用作序列比较的基础的所定义的序列。参照序列可以是指定序列的子集或整体；例如，作为全长cdna或基因序列的区段、或完整的cdna或基因序列。(b)如本文所用，“比较窗口”参照了多核苷酸序列的连续并指定的区段，其中与用于两种多核苷酸的最佳比对的参照序列(其不包括添加或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸序列可能包括添加或缺失(即空位)。通常，比较窗口的长度为至少20个连续核苷酸，并且任选地可以是30、40、50、100个或更长。本领域技术人员应当理解，由于多核苷酸序列中含有缺口，为了避免与参照序列的高相似性，典型地引入缺口罚分，并且将其从匹配数中减去。除非另行说明，否则本文中提供的序列同一性/相似性值是指使用采用以下参数的gap版本10获得的值：核苷酸序列的％同一性和％相似性采用gap权重50和长度权重3，以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；氨基酸序列的％同一性和％相似性采用gap权重8和长度权重2，以及blosum62评分矩阵；或其任何等效程序。“等效的程序”是指任何序列比较程序，该程序对于任何两个所讨论的序列产生一个比对，当与gap版本10所产生的对应的比对相比较时，该比对具有相同的核苷酸或氨基酸残基配对以及相同的序列同一性百分比。(c)如本文所用，在两个多核苷酸或多肽序列的上下文中的“序列同一性”或“同一性”是指，当在指定比较窗口上比对最大对应性时，两个序列中的相同残基。当使用关于蛋白质的序列同一性百分比时，认识到不相同的残基位置通常相差保守氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，并且因此不改变分子的功能性质。当序列在保守取代方面不同时，可以向上调节序列同一性百分比，以校正该取代的保守性质。相差这些保守取代的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行该调整的方法是本领域技术人员所熟知的。典型地，这涉及作为部分而不是完全错配对保守取代打分，从而提高百分比序列同一性。因此，例如，当相同的氨基酸得分为1，并且非保守取代的得分为零时，保守取代的得分在零和1之间。计算保守取代的评分，例如，如在程序pc/gene(智能遗传学(intelligenetics)，山景城，加利福尼亚州)中实现的。(d)如本文所用，“序列同一性百分比”意指在比较窗口上比较两个最佳比对序列所确定的值，其中与参照序列(其不包含添加或缺失)相比，该比较窗中的多核苷酸序列部分可以包含添加或缺失(即空位)，以进行这两个序列的最佳比对。通过以下方式计算该百分比：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将该结果乘以100以产生序列同一性百分比。进一步提供了用于从seqidno.：1-53或107-254中所示的靶标多核苷酸、或者其变体和片段、及其互补序列中识别沉默元件的方法。这样的方法包括获得seqidno.：1-53或107-254中任一项、或者其变体和片段、及其互补序列的的候选片段，该候选片段具有足够的长度以至于能充当沉默元件，并且从而降低靶标多核苷酸的表达和/或防治期望的有害生物；在合适的表达盒中表达所述候选多核苷酸片段以产生候选沉默元件，并确定所述候选多核苷酸片段具有沉默元件的活性，并且从而降低靶标多核苷酸的表达和/或防治期望的有害生物。鉴于本文提供的教导，基于用于抑制的期望的途径来识别此类候选片段的方法是已知的。例如，可以采用各种生物信息学程序来识别可以被用来产生沉默元件的靶标多核苷酸的区域。参见，例如，elbahir等人(2001)genesanddevelopment[基因与发育]15∶188-200，schwartz等人(2003)cell[细胞]115∶199-208，khvorova等人(2003)cell[细胞]115∶209-216。还参见，在whitehead网站(jura.wi.mit.edu/bioc/sirnaext/)的sirna，其计算正义和反义sirna的结合能。还参见网址genscript.com/ssl-bin/app/rnai？op＝known；来自英杰公司(invitrogen)和金斯瑞公司(genscript)sirna构建体生成器(sirnaconstructbuilder)的block-ittmrnai设计器(block-ittmrnaidesigner)。在各个方面，应当理解，术语“......seqidno.：1-53或107-254，或者其变体或片段，或者其互补序列......”意在表示，本披露的序列包含seqidno.：1-53或107-254，和/或seqidno.：1-53或107-254的片段，和/或seqidno.：1-53或107-254的变体，和/或seqidno.：1-53或107-254、seqidno.：1-53或107-254的变体、和/或seqidno.：1-53或107-254的片段的互补序列，单独地(或)或包含一些或所有列出的序列。v.dna构建体术语“多核苷酸”的用途并不限于包含dna的多核苷酸。本领域普通技术人员将认识到，多核苷酸可以包含核糖核苷酸和核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的组合。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然存在的分子也包括合成的类似物。所披露的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹结构、茎-环结构等。编码沉默元件或在某些实施例中的、在披露的方法和组合物中使用的多核苷酸可以在表达盒中提供以便在目的植物或生物体中表达。已经认识到，可以使用多个沉默元件，该多个沉默元件包括多个相同沉默元件、多个靶向靶标序列不同区域的沉默元件、或多个来自不同靶标序列的沉默元件。在这个实施例中，认识到每个沉默元件可以由单个或单独的盒、dna构建体或载体编码。如所讨论的，设想了提供该沉默元件的任何方式。可以用包含编码一个或多个沉默元件的dna的单个的盒或者编码沉默元件的分离的盒来转化植物或植物细胞，以转化植物或者植物细胞或宿主细胞。同样地，用一个组分转化的植物可以随后用第二组分进行转化。还可以通过有性杂交将编码沉默元件的一个或多个dna构建体聚在一起。也就是说，包含一种组分的第一种植物与包含第二种组分的第二植物杂交。杂交所产生的子代植物将包含这两种组分。该表达盒可以包括有效地连接至本发明的多核苷酸的5′和3′调控序列。“有效地连接”旨在表示两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，本发明的多核苷酸与调节序列(即，启动子)之间的有效连接是可使本文披露的多核苷酸得以表达的功能性连接。有效地连接的元件可以是连续的或非连续的。当用于指两个蛋白质编码区域的连接时，有效地连接意在是这些编码区域处于相同的阅读框中。该盒可以另外地含有至少一个待共转化成生物体的另外的多核苷酸。可替代地，可以在多个表达盒上提供另外的一种或多种多肽。提供的表达盒可以具有多个限制性位点和/或重组位点，用于将多核苷酸插入到调节区的转录调控之下。该表达盒可另外包含选择性标记基因。该表达盒可以包括转录的5′-3′方向、转录和翻译起始区(即启动子)、编码本发明的方法和组合物中使用的沉默元件的多核苷酸、以及在植物中起作用的转录和翻译终止区(即，终止区)。在其他实施例中，从抑制盒表达双链rna。这样的盒可以包含驱动有效地连接的沉默元件的转录的两个趋同启动子。“趋同启动子”是指定向于编码该沉默元件的、有效地连接的多核苷酸任一末端的启动子，使得每个启动予以相反方向驱动该沉默元件的转录，产生两个转录物。在此类实施例中，趋同启动子允许正义和反义链的转录，并且从而允许dsrna的形成。这种盒还可以包含驱动编码该沉默元件的一个或多个有效地连接的多核苷酸的转录的两个趋异启动子。“趋异启动子”是指彼此以相反方向定向的启动子，以相反的方向驱动编码该沉默元件的一个或多个多核苷酸的转录。在此类实施例中，趋异启动子允许正义和反义链的转录并允许dsrna的形成。在此类实施例中，趋异启动子还允许至少两个单独发夹rna的转录。在另一个实施例中，构建体中存在一个盒，该盒包含受到在相同定向上的两个单独启动子控制的、编码该沉默元件的两个或更多个多核苷酸。在另一个实施例中，构建体中存在在相同定向上的两个或更多个单独的盒，每个盒包含受到启动子控制的、编码该沉默元件的至少一个多核苷酸。本文披露的调控区(即，启动子、转录调控区和翻译终止区)和/或多核苷酸对于宿主细胞而言或彼此之间可以是天然的/相似的。可替代地，本文披露的调控区和/或多核苷酸对于宿主细胞或彼此之间可以是异源的。如本文所使用的，关于序列的“异源的”是指该序列源于外来物种，或者，如果源于相同物种的话，则是通过蓄意人为干预从组合物和/或基因组基因座中的天然形式进行实质性修饰得到的序列。例如，有效地连接至异源多核苷酸的启动子来自与从其衍生该多核苷酸的物种不同的物种，或者，如果来自相同/类似的物种，那么一方或双方基本上由它们的原来形式和/或基因组基因座修饰得到，或者该启动子不是被有效地连接的多核苷酸的天然启动子。如本文所使用的，嵌合基因包含与转录起始区有效地连接的编码序列，该转录起始区对于该编码序列是异源的。终止区可以对于转录起始区而言是天然的，可以对于编码沉默元件的有效地连接的多核苷酸而言是天然的，可以对于植物宿主而言是天然的，或者可以衍生自对于启动子、编码该沉默元件的多核苷酸、植物宿主或其任何组合而言别的来源(即外来的或异源的)。方便的终止区可获自根瘤农杆菌(a.tumefaciens)的ti质粒，诸如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还参见guerineau等人，(1991)mol.gen.genet.[分子遗传学和普通遗传学]262∶141-144；proudfoot(1991)cell[细胞]64∶671-674；sanfacon等人(1991)genesdev.[基因与发育]5∶141-149；mogen等人(1990)plantcell[植物细胞]2∶1261-1272；munroe等人(1990)gene[基因]91∶151-158；ballas等人(1989)nucleicacidsres.[核酸研究]17∶7891-7903；以及joshi等人(1987)nucleicacidsres.[核酸研究]15∶9627-9639。已知有另外的序列修饰能增强细胞宿主中的基因表达。这些包括：消除编码假的聚腺苷酸化信号和外显子-内含子剪接位点信号的序列、转座子样重复序列、及可能不利于基因表达的其他经充分表征的序列。可将序列的g-c含量调整至通过参照宿主细胞中表达的已知基因而计算出的给定细胞宿主的平均水平。当可能时，修饰序列以避免出现预测的发夹二级mrna结构。在制备表达盒时，可以操作各种dna片段，以提供处于适当方向以及合适时，处于适当阅读框中的dna序列。为此，可采用衔接子(adapter)或接头以连接dna片段，或可以涉及其他操作以提供方便的限制位点、移除多余的dna、移除限制位点等。出于这个目的，可以涉及体外诱变、引物修复、限制性酶切(restriction)、退火、再取代(例如转换和颠换)。多种启动子可用于本发明的实践中。可以基于期望的结果来选择启动子。核酸可以与组成型启动子、组织偏好性启动子、诱导型启动子或其他启动子组合用于在宿主生物体中的表达。此类组成型启动子包括，例如rsyn7启动子的核心启动子和其他在wo99/43838和美国专利号6,072,050中披露的组成型启动子；核心camv35s启动子(odell等人，(1985)nature[自然]313∶810-812)；稻肌动蛋白(mcelroy等人，(1990)plantcell[植物细胞]2∶163-171)；泛素(christensen等人，(1989)plantmol.biol.[植物分子生物学]12∶619-632以及christensen等人，(1992)plantmol.biol.[植物分子生物学]18：675-689)；pemu(last等人，(1991)theor.appl.genet.[理论与应用遗传学]81∶581-588)；mas(velten等人，(1984)emboj.[欧洲分子生物学学会杂志]3：2723-2730)；als启动子(美国专利号5,659,026)等。其它组成型启动子包括例如美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611。取决于所希望的结果，从诱导型启动子表达基因可能是有益的。还可以采用诱导型启动子，例如病原体诱导型启动子。这些启动子包括来自病程相关蛋白(pr蛋白)的那些启动子，其在被病原体感染后收到诱导；例如，pr蛋白、sar蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等。参见，例如redolfi等人(1983)neth.j.plantpathol.[荷兰植物病理学杂志]89∶245-254；uknes等人(1992)plantcell[植物细胞]4∶645-656；以及vanloon(1985)plantmol.virol.[植物分子病毒学]4：111-116。还参见wo99/43819。此外，由于病原体通过伤口或昆虫损伤找到进入植物的入口，伤口诱导型启动子可以用于本发明的构建中。这种伤口诱导型启动子包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pinii)基因(ryan(1990)ann.rev.phytopath.[植物病理学年鉴]28∶425-449；duan等人(1996)naturebiotechnology[自然生物技术]14∶494-498)；wun1和wun2，美国专利号5,428，148；win1和win2(stanford等人(1989)mol.gen.genet.[分子和普通遗传学]215∶200-208)；系统素(mcgurl等人(1992)science[科学]225∶1570-1573)；wip1(rohmeier等人(1993)plantmol.biol.[植物分子生物学]22：783-792；eckelkamp等人(1993)febsletters[欧洲生化学会联盟通讯]323：73-76)；mpi基因(corderok等人(1994)plantj.[植物杂志]6(2)：141-150)；等等。此外，可以在实施例的方法和核苷酸构建体中使用病原诱导型启动子。这些病原体诱导型启动子包括来自病程相关蛋白(pr蛋白)的那些启动子，其在被病原体感染后收到诱导；例如，pr蛋白、sar蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等。参见，例如redolfi等人(1983)neth.j.plantpathol.[荷兰植物病理学杂志]89：245-254；uknes等人(1992)plantcell[植物细胞]4：645-656；以及vanloon(1985)plantmol.virol.[植物分子病毒学]4：111-116。还参见wo99/43819。目的是在病原体侵染部位处或附近局部表达的启动子。参见，例如，marineau等人，(1987)plantmol.biol.[植物分子生物学]9：335-342；matton等人，(1989)molecularplant-microbeinteractions[分子植物-微生物相互作用]2：325-331；somsisch等人，(1986)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]83：2427-2430；somsisch等人，(1988)mol.gen.genet.[分子遗传和基因组学]2：93-98以及yang，(1996)proc.natl.acad.sci.[美国国家科学院院刊]usa93：14972-14977。还参见chen等人，(1996)plantj.[植物杂志]10：955-966；zhang等人，(1994)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]91：2507-2511；warner等人，(1993)plantj.[植物杂志]3：191-201；siebertz等人，(1989)plantcell[植物细胞]1：961-968；美国专利号5,750,386(可诱导线虫的)。特定的目的是玉米prms基因的诱导型启动子，其表达是由病原体串珠镰刀菌(fusariummoniliforme)诱导的(参见例如cordero等人，(1992)physiol.mol.plantpath.[生理学与分子植物病理学]41：189-200)。可以使用化学调节型启动予以通过应用外源化学调节剂来调节植物中的基因表达。取决于目标，在应用化学品诱导基因表达的情况下启动子可以是化学诱导型启动子，或者在应用化学品阻抑基因表达的情况下启动子可以是化学阻抑型启动子。化学诱导型启动子是本领域已知的，并且包括但不限于由苯磺酰胺除草剂安全剂激活的玉米in2-2启动子、由用作萌前除草剂的疏水亲电子化合物激活的玉米gst启动子、以及由水杨酸激活的烟草pr-1a启动子。其他目的化学调节的启动子包括类固醇应答性启动子(参见，例如，糖皮质激素诱导型启动子(schena等人，(1991)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]88：10421-10425和mcnellis等人，(1998)plantj[植物杂志]14(2)：247-257)以及四环素诱导型和四环素阻抑型启动子(参见例如gatz等人，(1991)molgengenet[分子遗传和基因组学]227∶229-237以及美国专利号5,814,618和5,789,156)。组织偏好性启动子可以用于靶向特定植物组织内的增强的表达。组织偏好性启动子包括yamamoto等人(1997)plantj.[植物杂志]12(2)：255-265；kawamata等人(1997)plantcellphysiol.[植物细胞生理学]38(7)：792-803；hansen等人(1997)mol.gengenet.[分子遗传学和普通遗传学]254(3)：337-343；russell等人(1997)transgenicres.[转基因研究]6(2)：157-168；rinehart等人(1996)plantphysiol.[植物生理学]112(3)：1331-1341；vancamp等人(1996)plantphysiol.[植物生理学]112(2)：525-535；canevascini等人(1996)plantphysiol.[植物生理学]112(2)：513-524；yamamoto等人(1994)plantcellphysiol.[植物细胞生理学]35(5)：773-778；lam(1994)resultsprobl.celldiffer.[细胞分化的结果和问题]20：181-196；orozco等人(1993)plantmolbiol.[植物分子生物学]23(6)：1129-1138；matsuoka等人(1993)procnatl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]90(20)：9586-9590；和guevara-garcia等人(1993)plantj.[植物杂志]4(3)：495-505。如果需要，此类启动子可以被修饰用于弱表达。叶偏好性启动子是本领域已知的。参见，例如，yamamoto等人，(1997)plantj.[植物杂志]12(2)：255-265；kwon等人，(1994)plantphysiol.[植物生理学]105∶357-67；yamamoto等人，(1994)plantcellphysiol.[植物细胞生理学]35(5)：773-778；gotor等人，(1993)plantj.[植物杂志]3∶509-18；orozco等人，(1993)plantmol.biol[植物细胞生理学].23(6)：1129-1138以及matsuoka等人，(1993)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]90(20)：9586-9590。根偏好性启动子是已知的，并且可以选自来自文献的许多可获得的启动子，或从各种相容物种中重新分离。参见，例如，hire等人，(1992)plantmol.biol.[植物分子生物学]20(2)：207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；keller和baumgartner(1991)plantcell[植物细胞]3(10)：1051-1061(法国菜豆的grp1.8基因中的根特异性控制元件)；sanger等人，(1990)plantmol.biol.[植物分子生物学]14(3)：433-443(根癌农杆菌的甘露碱合酶(mas)的根特异性启动子)；以及miao等人，(1991)plantcell[植物细胞]3(1)：11-22(编码细胞溶质谷氨酰胺合成酶(gs)的全长cdna克隆，其在大豆根和根结节中表达)。还参见bogusz等人(1990)plantcell[植物细胞]2(7)：633-641，该文献描述了分离自血红蛋白基因的两个根特异性启动子，该血红蛋白基因来自固氮非豆科作物山黄麻(parasponiaandersonii)和相关的非固氮非豆科作物山油麻(trematomentosa)。这些基因的启动子与β-葡糖醛酸糖苷酶报告基因连接，并且被引入非豆科作物烟草(nicotianatabacum)和豆科作物百脉根(lotuscorniculatus)两者中，并且在两种情况下都保留了根特异性启动子活性。leach和aoyagi(1991)描述了他们对发根土壤杆菌的高表达的rolc和rold根诱导性基因的启动子的分析(参见plantscience[植物科学](limerick)79(1)：69-76)。他们得出结论，增强子和组织偏好性dna决定簇在这些启动子中是解离的。teeri等人(1989)对lacz使用基因融合来表明，编码章鱼碱合酶的土壤杆菌t-dna基因在根尖的表皮中特别活跃，并且tr2′基因在完好的植物中是根特异性的，并且受到叶组织中的伤害的刺激，特别合适的具有与杀昆虫或杀幼虫基因一起使用的特性的组合(参见emboj.[欧洲分子生物学学会杂志]8(2)：343-350)。融合至nptii(新霉素磷酸转移酶ii)上的tr1′基因显示出相似的特性。另外的根偏好性启动子包括vfenod-grp3基因启动子(kuster等人(1995)plantmol.biol.[植物分子生物学]29(4)：759-772)；和rolb启动子(capana等人(1994)plantmol.biol.[植物分子生物学]25(4)：681-691。还参见美国专利号5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5，110,732；和5,023,179。“种子偏好性”启动子包括“种子特异性”启动子(在种子发育期间有活性的那些启动子如种子贮藏蛋白的启动子)以及“种子发芽性”启动子(在种子发芽期间有活性的那些启动子)。参见thompson等人，(1989)bioessays[生物学分析]10∶108。这样的种子优选的启动子包括但不限于cim1(细胞分裂素诱导的信息)；cz19b1(玉米19kda玉米蛋白)；和milps(肌醇-1-磷酸盐合酶)(参见美国专利号6,225,529，通过引用并入本文)。γ-玉米蛋白和glob-1是胚乳特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于：菜豆β-菜豆素、油菜籽蛋白(napin)、β-伴大豆球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于：玉蜀黍15kda玉蜀黍蛋白、22kda玉蜀黍蛋白、27kda玉蜀黍蛋白、g-玉蜀黍蛋白、蜡质、收缩素1、收缩素2、球蛋白1等。还参见wo00/12733，其中披露了来自end1和end2基因的种子偏好性启动子。在特定组织中具有“偏好性”表达的启动子在该组织中比在至少一种其他植物组织中更大程度地表达。一些组织优先的启动子几乎专门在特定组织中表达。在实施例中，植物表达性启动子是血管特异性启动子，例如韧皮部特异性启动子。如本文所使用的，“血管特异性”启动子是至少在血管细胞中表达的启动子或优先在血管细胞中表达的启动子。血管特异性启动子的表达不必仅在血管细胞中，其他细胞类型或组织中的表达也是可能的。如本文所使用的，“韧皮部特异性启动子”是至少在韧皮部细胞中表达的植物可表达性启动子，或优先在韧皮部细胞中表达的启动子。韧皮部特异性启动子的表达不需要仅在韧皮部细胞中，在其他细胞类型或组织(例如木质部组织)中的表达也是可能的。在本发明的一个实施例中，韧皮部特异性启动子是至少在韧皮部细胞中表达的植物可表达性启动子，其中与韧皮部细胞中的表达相比，非韧皮部细胞中的表达更有限(或不存在)。根据本发明，合适的血管特异性或韧皮部特异性启动子的实例包括但不限于选自由以下各项组成的组的启动子：scsv3、scsv4、scsv5和scsv7启动子(schunmann等人(2003)plantfunctionalbiology[植物生物学功能]30∶453-60)；发根土壤杆菌的rolc基因启动子(kiyokawa等人(1994)plantphysiology[植物生理学]104∶801-02；pandolfini等人(2003)biomedcentral(bmc)biotechnology[生物医学中心(bmc)生物技术]3∶7，(www.biomedcentral.com/1472-6750/3/7)；graham等人(1997)plantmol.biol.[植物分子生物学]33：729-35；guivarc′h等人(1996)；almon等人(1997)plantphysiol.[植物生理学]115∶1599-607)；发根土壤杆菌的rola基因启动子(dehio等人(1993)plantmol.biol.[植物分子生物学]23∶1199-210)；根癌农杆菌t-dna基因5的启动子(korber等人(1991)emboj.[欧洲分子生物学学会杂志]10∶3983-91)；稻蔗糖合酶rss1基因启动子(shi等人(1994)j.exp.bot.[实验植物学杂志]45∶623-31)；coymv或鸭跖草黄斑驳杆状病毒(commelinayellowmottlebadnavirus)启动子(medberry等人(1992)plantcell[植物细胞]4∶185-92；zhou等人(1998)chin.j.biotechnol.[中国生物技术杂志]14∶9-16)；cfdv或椰子叶面腐败病毒启动子(rohde等人(1994)plantmol.biol.[植物分子生物学]27∶623-28；hehn和rhode(1998)j.gen.virol.[普通病毒学杂志]79∶1495-99)；rtbv或东格鲁水稻杆状病毒(ricetungrobacilliformvirus)启动子(yin和beachy(1995)plantj.[植物杂志]7∶969-80；yin等人(1997)plantj.[植物杂志]12∶1179-80)；豌豆谷氨酰胺合酶gs3a基因(edwards等人(1990)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]87∶3459-63；brears等人(1991)plantj.[植物杂志]1∶235-44)；马铃薯转化酶基因的invcd111和invcd141启动子(hedley等人(2000)j.exp.botany[实验植物学杂志]51∶817-21)；从拟南芥中分离的启动子显示在烟草中具有韧皮部特异性表达(kertbundit等人(1991)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]88：5212-16)；vahox1启动子区(tornero等人(1996)plantj.[植物杂志]9：639-48)；豌豆细胞壁转化酶基因启动子(zhang等人(1996)plantphysiol.[植物生理学]112：1111-17)；与美国公开专利申请20030106097，来自胡萝卜的酸性转化酶基因启动子的几丁质酶相关的内源性棉花蛋白的启动子(ramloch-lorenz等人(1993)theplantj.[植物学杂志]4：545-54)；硫酸转运蛋白基因sultr1的启动子；3(yoshimoto等人(2003)plantphysiol.[植物生理学]131：1511-17)；蔗糖合酶基因的启动子(nolte和koch(1993)plantphysiol.[植物生理学]101：899-905)；以及烟草蔗糖转运蛋白基因的启动子(kuhn等人(1997)science[科学]275-1298-1300)。可能的启动子还包括洋李甙水解酶(phdl1.4pro)的黑樱桃启动子(美国专利号6,797,859)，来自黄瓜和稻的硫氧还蛋白h启动子(fukudaa等人(2005)，plantcellphysiol.[植物细胞生理学]46(11)：1779-86)，稻(rss1)(shi，t.wang等人(1994).j.exp.bot.[实验植物学杂志]45(274)：623-631)和玉米蔗糖合酶-1启动子(yang.，n-s.等人(1990)pnas87：4144-4148)，来自南瓜的pp2启动子(guo，h.等人(2004)transgenicresearch[转基因研究]13：559-566)，suc2启动子(truernit，e.等人(1995)planta[植物]196(3)：564-70)，sam-1(s-腺苷甲硫氨酸合成酶)(mijnsbruggekv.等人(1996)plantcell.physiol.[植物细胞生物学]37(8)：1108-1115)，以及水稻东格鲁杆状病毒(rtbv)启动子(bhattacharyya-pakrasi等人(1993)plantj.[植物杂志]4(1)：71-79)。当希望低水平表达时，可使用弱启动子。通常，如本文使用的，术语“弱启动子”是指以低水平驱动编码序列表达的启动子。低水平表达旨在约1/1000转录物至约1/100,000转录物至约1/500,000转录物的水平。可替代地，应当认识到，术语“弱启动子”还涵盖仅在少数细胞中驱动表达但不在其他细胞中表达以给出完全低表达水平的启动子。当启动予以不可接受的高水平驱动表达时，可以删除或修饰部分启动子序列以降低表达水平。此类弱组成型启动子包括，例如：rsyn7启动子的核心启动子(wo99/43838和美国专利号6,072,050)、核心35scamv启动子等。其他组成型启动子包括，例如以下专利文献中所披露的那些：美国专利号5,608，149；5,608，144；5,604，121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611。该表达盒还可以包含用于选择经转化细胞的可选标记基因。利用可选标记基因用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，如编码新霉素磷酸转移酶ii(neo)和潮霉素磷酸转移酶(hpt)的基因，以及赋予除草化合物(如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-d))抗性的基因。另外的可选标记包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(gfp)(su等人(2004)biotechnolbioeng[生物技术与生物工程]85：610-9和fetter等人(2004)plantcell[植物细胞]16：215-28)、青色荧光蛋白(cyp)(bolte等人(2004)j.cellscience[细胞科学杂志]117∶943-54和kato等人(2002)plantphysiol[植物生理学]129：913-42)和黄色荧光蛋白(来自evrogen的phiyfptm，参见bolte等人(2004)j.cellscience[细胞科学杂志]117∶943-54)。对于另外的可选标记，一般参见yarranton(1992)curr.opin.biatech.[生物技术新见]3∶506-511；christopherson等人(1992)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]89∶6314-6318；yao等人(1992)cell[细胞]71∶63-72；reznikoff(1992)mo，.microbiol.[分子微生物学]6∶2419-2422；barkley等人(1980)theoperon[操纵子]中，第177-220页；hu等人(1987)cell[细胞]48∶555-566；brown等人(1987)cell[细胞]49：603-612；figge等人(1988)cell[细胞]52：713-722；deuschle等人(1989)proc.nail.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]86：5400-5404；fuerst等人(1989)proc.nail.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]86∶2549-2553；deuschle等人(1990)science[科学]248∶480-483；gossen(1993)博士学位论文，德国海德堡大学；reines等人(1993)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]90∶1917-1921；labow等人(1990)mol.cell.biol.[分子细胞生物学]10：3343-3356；zambretti等人(1992)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]89∶3952-3956；baim等人(1991)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]88∶5072-5076；wyborski等人(1991)nucleicacidsres.[核酸研究]19：4647-4653；hillenand-wissman(1989)topicsmol.struc.biol.[热点分子结构生物学]10：143-162；degenkolb等人(1991)antimicrob.agentschemother.[抗微生物剂]35：1591-1595；kleinschnidt等人(1988)biochemistry[生物化学]27：1094-1104；bonin(1993)博士学位论文，德国海德堡大学；gossen等人(1992)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]89：5547-5551；oliva等人(1992)antimicrob.agentschemother.[抗微生物剂]36：913-919；hlavka等人(1985)handbookofexperimentalpharmacology[实验药理学手册]，第78卷(springer-verlag，berlin[柏林施普林格出版社])；gill等人，(1988)nature[自然]334：721-724。以上可选标记基因的列表并不意指是限制性的。任何可选标记基因都可以与本文所述的组合物和方法一起使用。vi.包含沉默元件的组合物可以提供包含沉默元件的多核苷酸中的一种或多种作为植物、植物部分、种子、植物昆虫有害生物或耕作区的外用组合物，诸如喷雾剂或粉剂。在另一个实例中，用dna构建体或表达盒转化植物用于至少一个沉默元件的表达。在任一组合物中，沉默元件在被有害生物摄取时可降低靶标有害生物序列的水平并从而防治该有害生物(即，鞘翅目植物有害生物，包括叶甲属植物有害生物，诸如玉米根萤叶甲、北方玉米根虫、墨西哥玉米根虫、南美叶甲或斑点黄瓜甲虫)。已经认识到，该组合物可以包含如下细胞(诸如植物细胞或细菌细胞)，在该细胞中，编码沉默元件的多核苷酸稳定地被并入到基因组中并有效地连接到在细胞中有活性的启动子上。还涵盖包含细胞(一些表达至少一个沉默元件的细胞)混合物的组合物。在其他实施例中，包含沉默元件的组合物不包含于细胞中。在此类实施例中，可将该组合物施用到植物昆虫有害生物所栖息的区域。在一个实施例中，将该组合物外用地施用于植物(即，通过喷洒田间或种植区域)来保护植物免受有害生物侵害。以这种方式施用核苷酸的方法是本领域技术人员已知的。还可以将本文披露的组合物配制成诱饵。在此实施例中，这些组合物包含增加该组合物对有害生物的吸引力的食品或引诱剂。包含沉默元件的组合物可在农业上合适的和/或环境上可接受的载体中进行配制。此类载体可以为待处理的动物、植物或环境可耐受的任何材料。此外，此类载体必须使得该组合物在防治植物昆虫有害生物时仍然有效。此类载体的实例包括水、盐水、林格氏溶液、右旋糖或其他糖溶液、汉克氏溶液和其他生理上平衡的水性盐溶液、磷酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液以及tris缓冲液。另外，该组合物可以包括延长组合物半衰期的化合物。各种杀昆虫制剂也可见于例如美国公开2008/0275115、2008/0242174、2008/0027143、2005/0042245和2004/0127520。已经认识到，可使用包含编码沉默元件的序列的多核苷酸来转化生物体，以便宿主生物体产生这些组分，并随后将该宿主生物体施用到一种或多种靶标有害生物的环境中。此类宿主生物体包括杆状病毒、细菌等等。以这种方式，可通过合适的载体将编码沉默元件的多核苷酸的组合引入微生物宿主中，并将所述宿主施用到环境中或者施用到植物或动物上。在将核酸插入细胞的背景下，术语“引入”是指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括将核酸并入真核或原核细胞中，在该真核或原核细胞中核酸可以稳定地被并入细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体dna)中，转化为自主复制子，或被瞬时表达(例如经转染的mrna)。可选择如下微生物宿主，已知该微生物宿主可占领一种或多种目的作物的“植物圈”(叶面、叶围、根围和/或根面)。选择这些微生物以便能够在具体环境中成功地与野生型微生物竞争，为编码沉默元件的序列供给稳定的维持和表达，并且理想的是，增加对这些组分的保护使其不受环境降解和失活的影响。此类微生物包括细菌、藻类和真菌。特定的目的是微生物，例如细菌，如假单胞菌属(pseudomonas)、欧文氏菌属(erwinia)、沙雷氏菌属(serratia)、克雷伯氏杆菌属(klebsiella)、黄单胞菌属(xanthomonas)、链霉菌属(streptomyces)、根瘤菌属(rhizobium)、红假单胞菌属(rhodopseudomonas)、甲基菌属(methylius)、农杆菌属(agrobacterium)、醋酸杆菌属(acetobacter)、乳酸杆菌属(lactobacillus)、节细菌属(arthrobacter)、固氮菌属(azotobacter)、明串珠菌属(leuconostoc)和产碱杆菌属(alcaligenes)；真菌，尤其是酵母，如酵母菌属(saccharomyces)、隐球菌属(cryptococcus)、克鲁维酵母菌属(kluyveromyces)、掷孢酵母属(sporobolomyces)、红酵母(rhodotorula)和短梗霉属(aureobasidium)。特定的目的是诸如以下的植物圈细菌物种：丁香假单胞菌(pseudomonassyrmgae)、荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)、粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)、木醋杆菌(acetobacterxylinum)、农杆菌、球形红假单胞菌(rhodopseudomonasspheroides)、野油菜黄单胞菌(xanthomonascampestris)、苜蓿根瘤菌(rhizobiummelioti)、富营养产碱菌(alcaligenesentrophus)、木质棍状杆菌(clavibacterxyli)和维涅兰德固氮菌(azotobactervinlandir)；以及诸如以下的植物圈酵母物种：深红酵母(rhodotorularubra)、粘红酵母(r.glutinis)、海滨红酵母(r.marina)、橙黄红酵母(r.aurantiaca)、浅白色隐球酵母(cryptococcusalbidus)、流散隐球酵母(c.diffluens)、罗伦隐球酵母(c.laurentii)、罗斯酵母(saccharomycesrosei)、普地酵母(s.pretoriensis)、酿酒酵母(s.cerevisiae)、粉红掷孢酵母(sporobolomycesrosues)、香气掷孢酵母(s.odorus)、佛地克鲁维酵母(kluyveromycesveronae)如出芽短梗霉(aureobasidiumpollulans)。特定的目的是有颜色的微生物。有多种方式可用来将包含沉默元件的多核苷酸引入处于如下条件下的微生物宿主中，该条件容许这种核苷酸编码序列的稳定维持和表达。例如，可以构建出如下表达盒，该表达盒包括为了该核苷酸构建体的表达与转录和翻译调节信号有效地连接的目的核苷酸构建体，以及与宿主生物体(在此将发生合并)中的序列同源的核苷酸序列和/或在该宿主(在此将发生合并或稳定维持)中具有功能的复制系统。转录和翻译调节信号包括但不限于启动子、转录起始位点、操纵子、活化子、增强子、其他调节元件、核糖体结合位点、起始密码子、终止信号等。参见，例如美国专利号5,039,523和4,853,331；ep0480762a2；sambrook等人(2000)；molecularcloning：alaboratorymanual(3rdedition；coldspringharborlaboratorypress，plainview，ny)[分子克隆：实验室手册(第3版；冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州)]；davis等人(1980)advancedbacterialgenetics(coldspringharborlaboratory，coldspringharbor，ny)[高级细菌遗传学(冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州)]；以及其中引用的参考文献。合适的宿主细胞包括原核生物和低等真核生物，如真菌。说明性的原核生物(革兰氏阴性和革兰氏阳性)，包括肠杆菌科，如埃希氏杆菌属、欧文氏菌属、志贺氏杆菌、沙门氏菌和变形杆菌；芽孢杆菌科；根瘤科，如根瘤菌；螺菌科，如发光杆菌属、单胞发酵菌属、沙雷菌属、气单孢菌属、弧菌属、脱硫弧菌属、螺旋菌属；乳酸细菌科；假单胞菌科，如假单胞菌属和醋菌属；固氮菌科和硝化杆菌科。真核生物中的真菌，如藻菌和子囊菌纲(包括酵母，如酵母菌属和裂殖酵母属；以及担子菌纲酵母，如红酵母、短梗霉、掷孢酵母等)。在选择宿主细胞上特定的目的特征可以包括易于将编码序列引入该宿主中、表达系统的可用性、表达效率、宿主中的稳定性以及辅助遗传能力的存在。用作杀有害生物剂微胶囊的目的特征包括保护性性质，如细胞壁厚、色素沉着、以及细胞内包装或包涵体的形成；叶亲和力；无哺乳动物毒性；吸引有害生物摄取；等等。其他考虑因素包括易于配制和处理、经济性、储存稳定性等。特定的目的宿主微生物包括酵母，例如红酵母属物种(rhodotorulaspp.)、短梗霉属物种(aureobasidiumspp.)、酵母属物种(saccharomycesspp.)和掷孢酵母属物种(sporobolomycesspp.)，叶面生物体，例如假单胞菌属物种(pseudomonasspp.)、欧文氏菌属物种(erwiniaspp.)如黄杆菌属物种(flavobacteriumspp.)，以及其他此类生物体，包括铜绿假单胞菌(pseudomonasaerugmosa)、荧光假单胞菌、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)、大肠杆菌(escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)等。本发明所包含的编码沉默元件的序列可以被引入到植物(附生植物)上繁殖的微生物中，以将这些成分传递给潜在的靶标有害生物。附生植物，例如可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。可以将沉默元件在细菌宿主中发酵，并且将所得到的细菌以与苏云金芽孢杆菌菌株已被用作杀昆虫喷雾剂相同的方式进行加工并用作微生物喷雾剂。任何合适的微生物都可以用于此目的。举例来说，假单胞菌已被用来表达作为包封的蛋白质的苏云金芽孢杆菌内毒素，并且将所得细胞进行加工并将其作为杀昆虫剂进行喷雾(gaertner等人(1993)，advancedengineeredpesticides[高级工程杀有害生物剂]，编辑l.kim(马塞尔·德克尔公司(marceldecker，inc.)))。可替代地，通过将异源基因引入细胞宿主中来产生本发明的组分。异源序列的表达直接或间接地导致沉默元件在细胞内产生。然后可以根据常规技术配制这些组合物，以施用于靶标有害生物所寄宿的环境(例如，土壤、水和植物的叶子)中。参见，例如epa0192319及其中引用的参考文献。可以用可接受的载体将经转化的微生物配制成单独的或组合的组合物，该组合物为例如悬浮液、溶液、乳剂、扑粉、可分散颗粒、可湿性粉末、以及乳油、气雾剂、浸渍颗粒、辅剂、可涂覆型糊剂，以及还有如聚合物物质中的包封物。以上所披露的这类组合物可通过添加以下物质来获得：表面活性剂、惰性载体、防腐剂、保湿剂、取食刺激剂、引诱剂、包囊剂、粘合剂、乳化剂、染料、紫外保护剂、缓冲剂、助流剂或肥料、微量营养物供体或其他能影响植物生长的制剂。包括但不限于除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀螨剂、植物生长调节剂、收获助剂(harvestaid)和肥料的一种或多种农用化学品可以与制剂或其他组分的本领域通常使用的载体、表面活性剂或佐剂组合，以促进特定靶标有害生物的产品处理和应用。合适的载体和佐剂可以是固体或液体并且对应于制剂技术中通常使用的物质，例如，天然或再生矿物质、溶剂、分散剂、润湿剂、增粘剂、粘合剂或肥料。这些活性成分(即至少一种沉默元件)通常以组合物的形式被施用，并且可以施用于待处理的作物区域、植物或种子上。例如，可以在准备贮藏于粮仓或筒仓等中或者在贮藏于粮仓或筒仓等中的过程中将这些组合物施用于谷物上。可以将这些组合物与其他化合物同时或相继施用。施用含有至少一种沉默元件的活性成分或组合物的方法包括但不限于叶面施用、种子包衣和土壤施用。施用次数和施用速度取决于相应有害生物侵袭的强度。合适的表面活性剂包括但不限于阴离子化合物，例如羧酸盐，如金属的羧酸盐；长链脂肪酸的羧酸盐；n-酰基肌氨酸盐；磷酸与脂肪醇乙氧基化物的单酯或二酯或这些酯的盐；脂肪醇硫酸盐，如十二烷基硫酸钠、十八烷基硫酸钠或十六烷基硫酸钠；乙氧基化脂肪醇硫酸盐；乙氧基化烷基酚硫酸盐；木质素磺酸盐；石油磺酸盐；烷基芳基磺酸盐，例如烷基苯磺酸盐或低级烷基木素磺化盐，如丁基木素磺化盐；磺化萘-甲醛缩合物的盐；磺化苯酚-甲醛缩合物的盐；更复杂的磺酸盐，例如酰胺磺酸盐，如油酸和n-甲基牛磺酸的磺化缩合产物；或二烷基磺基琥珀酸盐，例如，磺酸钠或二辛基琥珀酸盐。非离子剂包括脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪酸酰胺或者经脂肪烷基或烯基取代的酚与环氧乙烷的缩合产物，多元醇醚的脂肪酯(例如脱水山梨糖醇脂肪酸酯)，这种酯类与环氧乙烷的缩合产物(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯)，环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物，炔属乙二醇(例如2，4，7，9-四乙基-5-癸炔-4，7-二醇，或者乙氧基化的炔属乙二醇)。阳离子表面活性剂的实例包括例如脂肪族单胺、二胺或多胺诸如乙酸盐、环烷酸盐或者油酸盐；或含氧胺，如聚氧乙烯烷基胺的氧化胺；通过将羧酸与二胺或多胺进行缩合制备的酰胺连接的胺；或季铵盐。惰性材料的实例包括但不限于，无机矿物(如高岭土、页硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐)或植物材料(如软木、粉末玉米芯、花生壳、稻壳和核桃壳)。包含沉默元件的这些组合物可以处于用于直接施用的合适形式或作为主要组合物的浓缩物，该浓缩物在施用前需要用适量的水或其他稀释剂进行稀释。这些组合物(包括经转化的微生物)可以通过例如以如下方式施用于昆虫有害生物(例如鞘翅目植物有害生物或叶甲属植物有害生物)的环境中：喷雾、雾化、撒粉、散射、涂覆或浇注、引入到土壤中或土壤上、引入到灌溉水中、在有害生物已开始出现时或者在有害生物出现前进行种子处理或普通施用或撒粉作为保护措施。例如，可以将该一种或多种组合物和/或一种或多种经转化的微生物与谷物混合以在储存期间保护谷物。通常重要的是在植物生长的早期阶段获得对有害生物的良好防治，因为这是植物可能受到最严重损害的时候。如果认为必要，这些组合物可方便地含有另一种杀昆虫剂。在本发明的实施例中，在种植时将该一种或多种组合物直接施用于土壤，施用的形式为载体与芽孢杆菌菌株的或者本发明经转化微生物的死细胞的组合物的颗粒形式。另一个实施例是包含惰性载体中的农业化学品(例如除草剂、杀昆虫剂、肥料)与芽孢杆菌菌株的或本发明经转化微生物的死细胞的组合物的颗粒形式。ⅶ.植物、植物部分及将序列引入植物中的方法在一个实施例中，本发明的方法涉及将多核苷酸引入植物中。“引入”旨在表示将该多核苷酸呈送给该植物，以这样的方式使得该序列进入该植物细胞的内部。本发明的方法不取决于用于将序列引入植物中的具体方法，只要多核苷酸或多肽进入该植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸引入植物的方法是本领域已知的，该方法包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法。“稳定转化”旨在表示经引入植物中的核苷酸构建体合并到该植物的基因组中，并且能够被其子代遗传。“瞬时转化”旨在表示将多核苷酸引入该植物中并且不合并到该植物的基因组中，或者将多肽引入植物中。转化方案连同用于将多肽或多核苷酸序列引入植物中的方案可以取决于被靶向转化的植物或植物细胞的类型(即，单子叶植物或双子叶植物)而变化。用于将多肽和多核苷酸引入植物细胞的适合的方法包括显微注射(crossway等人(1986)biotechniques[生物技术]4：320-334)、电穿孔(riggs等人(1986)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]83：5602-5606)、农杆菌介导的转化(美国专利号5,563,055和美国专利号5,981,840)、直接基因转移(paszkowski等人(1984)emboj.[欧洲分子生物学学会杂志]3：2717-2722)、和弹道粒子加速法(参见例如美国专利号4,945,050；美国专利号5,879,918；美国专利号5,886,244；和5,932,782；tomes等人(1995)，plantcell，tissue，andorganculture：fundamentalmethods[植物细胞、组织和器官培养：基础方法]，gamborg和phillips编辑(施普林格出版公司(springer-verlag)，柏林)；mccabe等人(1988)biotechnology[生物技术]6：923-926)；和lec1转化法(wo00/28058)。也参见weissinger等人(1988)ann.rev.genet.[遗传学年鉴]22：421-477；sanford等人(1987)particulatescienceandtechnology[微粒科学与技术]5：27-37(洋葱)；christou等人(1988)plantphysiol.[植物生理学]87：671-674(大豆)；mccabe等人(1988)bio/technology[生物学/技术]6：923-926(大豆)；finer和mcmullen(1991)invitrocelldev.biol.[体外细胞与发育生物学]27p：175-182(大豆)；singh等人(1998)theot.appl.genet.[理论与应用遗传学]96：319-324(大豆)；datta等人(1990)biotechnology[生物技术]8：736-740(稻)；klein等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]85：4305-4309(玉米)；klein等人(1988)biotechnology[生物技术]6：559-563(玉米)；美国专利号5,240,855、5,322,783、和5,324,646；klein等人(1988)plantphysiol.[植物生理学]91：440-444(玉米)；fromm等人(1990)biotechnology[生物技术]8：833-839(玉米)；hooykaas-vanslogteren等人(1984)nature[自然](伦敦)311：763-764；美国专利号5,736,369(谷类)；bytebier等人(1987)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]84：5345-5349(百合科)；dewet等人(1985)在theexperimentalmanipulationofovuletissues[卵巢组织的实验操作]中chapman等人编辑(纽约朗文出版社(longman，newyork))第197-209页(花粉)；kaeppler等人(1990)plantcellreports[植物细胞报告]9：415-418和kaeppler等人(1992)theor.appl.genet.[理论与应用遗传学]84：560-566(须介导的转化)；d′halluin等人(1992)plantcell[植物细胞]4：1495-1505(电穿孔)；li等人(1993)plantcellreports[植物细胞报告]12：250-255以及christou和ford(1995)annalsoofbotany[植物学年鉴]75：407-413(稻)；osjoda等人(1996)naturebiotechnology[自然生物技术]14：745-750(maizeviaagrobacteriumtumefaciens[经由根癌农杆菌的玉米])。在某些实施例中，可以使用各种瞬时转化法向植物提供本文披露的沉默元件。这种瞬时转化法包括但不限于将蛋白质或者其变体或片段直接引入植物中或将转录物引入植物中。此类方法包括例如显微注射或粒子轰击。参见例如crossway等人(1986)molgen.genet.[分子遗传学和基因组学]202：179-185；nomura等人(1986)plantsci.[植物科学]44：53-58；hepler等人(1994)proc.natl.acad.sci.[国家科学院院刊]91：2176-2180和hush等人(1994)thejournalofcellscience[细胞科学杂志]107：775-784，以上所有文献都通过引用并入本文。可替代地，可以使用本领域已知的技术将多核苷酸瞬时转化到植物中。此类技术包括病毒载体系统，和以阻止dna后续释放的方式使多核苷酸沉淀。此类方法包括使用涂覆有聚乙亚胺(pei；西格玛公司#p3143)的颗粒。在其他实施例中，可以通过使植物与病毒或病毒核酸接触将本文披露的多核苷酸引入植物中。通常，此类方法涉及将本发明的核苷酸构建体并入病毒dna或rna分子内。此外，已经认识到，启动子还可以涵盖用于通过病毒rna聚合酶转录的启动子。涉及病毒dna或rna分子、用于将多核苷酸引入植物并表达其中所编码的蛋白质的方法是本领域已知的。参见例如，美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931和porta等人(1996)molecularbiotechnology[分子生物技术]5：209-221。用于在植物基因组的特定位置定向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施例中，利用位点特异性重组系统实现多核苷酸在所期望的基因组位置的插入。参见例如wo99/25821、wo99/25854、wo99/25840、wo99/25855和wo99/25853。简而言之，本文披露的多核苷酸可以包含在两侧为两个非引起重组的重组位点的转运盒中。将转移盒引入使如下靶标位点稳定地并入其基因组中的植物中，该靶标位点的侧翼为两个与该转移盒的这些位点相对应的非引起重组的重组位点。提供适当的重组酶，并将该转移盒整合到靶标位点。目的多核苷酸因而被并入到植物基因组中的特定染色体位置上。已经转化的细胞可以按照常规方法生长为植物。参见例如，mccormick等人(1986)plantcellreports[植物细胞报告]5：81-84。然后可以培育这些植株，并用相同的经转化的株系或者不同的株系进行授粉，并鉴定出具有所希望的表型特征的组成型表达的所得后代。可以培育两代或更多代植株，确保所希望的表型特征的表达得到稳定保持和遗传，并且然后收获种子，确保已实现所希望的表型特征的表达。以这种方式，本文所述的组合物和方法提供了如下经转化的种子(也称为“转基因种子”)，该种子本文披露的多核苷酸(例如表达盒)稳定地并入其基因组中。如本文所使用的，术语植物包括植物细胞、植物原生质体、可再生植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物块和在植物或植物部分(如胚胎、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果、核、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花药等)中完好的植物细胞。谷物意指由商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的所生产的成熟种子。这些再生植物的后代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，条件是这些部分包含经引入的多核苷酸。本文描述的组合物和方法可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目的植物物种的实例包括但不限于玉米(玉蜀黍)，芸苔属物种(例如，甘蓝型油菜、芜菁、芥菜)(特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种)，苜蓿(紫花苜蓿(medicagosativa))，稻(rice，oryzasativa)，黑麦(rye，secalecereale)，高粱(甜高粱(sorghumbicolor)，高粱(sorghumvulgare))，粟(例如，珍珠粟(御谷(pennisetumglaucum))，黍(粟米(panicummiliaceum))，粟(谷子(setariaitalica))，穇子(龙爪稷(eleusinecoracana)))，向日葵(sunflower，helianthusannuus)，红花(safflower，carthamustinctorius)，小麦(wheat，triticumaestivum)，大豆(soybean，glycinemax)，烟草(tobacco，nicotianatabacum)，马铃薯(potato，solanumtuberosum)，花生(peanut，arachishypogaea)，棉花(海岛棉(gossypiumbarbadense)、陆地棉(gossypiumhirsutum))，甘薯(番著(ipomoeabatatas))，木薯(cassava，manihotesculenta)，咖啡(咖啡属物种(coffeaspp.))，椰子(coconut，cocosnucifera)，菠萝(pineapple，ananascomosus)，柑橘树(柑橘属物种(citrusspp.))，可可(cocoa，theobromacacao)，茶树(tea，camelliasinensis)，香蕉(芭蕉属物种(musaspp.))，鳄梨(avocado，perseaamericana)，无花果(fig或(ficuscasica))，番石榴(guava，psidiumguajava)，芒果(mango，mangiferaindica)，橄榄(olive，oleaeuropaea)，木瓜(番木瓜(caricapapaya))，腰果(cashew，anacardiumoccidentale)，澳洲坚果(macadamia，macadamiaintegrifolia)，巴旦杏(almond，prunusamygdalus)，甜菜(sugarbeets，betavulgaris)，甘蔗(甘蔗属物种(saccharumspp.))，燕麦，大麦，蔬菜，观赏植物和针叶树。蔬菜包括番茄(tomatoes，lycopersiconesculentum)、莴苣(例如，莴苣(lactucasativa))、青豆(菜豆(phaseolusvulgaris))、利马豆(limabean，phaseoluslimensis)、豌豆(香豌豆属物种(lathyrusspp.))和黄瓜属(cucumis)的成员诸如黄瓜(cucumber，c.sativus)、香瓜(cantaloupe，c.cantalupensis)和甜瓜(muskmelon，c.melo)。观赏植物包括杜鹃(杜鹃花属物种(rhododendronspp.))、绣球花(hydrangea，macrophyllahydrangea)、木槿(hibiscus，hibiscusrosasanensis)、玫瑰(蔷薇属物种(rosaspp.))、郁金香(郁金香属物种(tulipaspp.))、水仙(水仙属物种(narcissusspp.))、矮牵牛(pemnias，pemniahybrida)、康乃馨(carnation，dianthuscaryophyllus)、一品红(poinsettia，euphorbiapulcherrima)和菊花。可以用于实践本文所述组合物和方法的针叶树包括(例如)松树诸如火炬松(loblollypine，pinustaeda)、湿地松(slashpine，pinuselliotii)、西黄松(ponderosapine，pinusponderosa)、黑松(lodgepolepine，pinuscontorta)和辐射松(montereypine，pinusradiata)；花旗松(douglas-fir，pseudotsugamenziesii)；西方铁杉(westernhemlock，tsugacanadensis)；北美云杉(白云杉(piceaglauca))；红杉(北差红杉(sequoiasempervirens))；枞树(truefirs)诸如银杉(胶冷杉(abiesamabilis))和胶枞(香脂冷杉(abiesbalsamea))；以及雪松，如西方红雪松(北美乔柏(thujaplicata))和阿拉斯加黄雪松(黄扁柏(chamaecyparisnootkatensis))。在某些实施例中，本文所述组合物和方法可以与植物一起使用，例如作物植物(如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等)。在其他实施例中，玉米和大豆植物以及甘蔗植物是最佳的，并且在仍然其他的实施例中，玉米植物是最佳的。其他目的植物包括提供目的种子的谷物类植物、油料种子植物和豆科植物。目的种子包括谷物种子，如玉米、小麦、大麦、稻、高粱、黑麦等的种子。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉米、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。viii.转基因植物中性状的堆叠转基因植物可以包含大量的如本文所披露的如seqidno.：1-53或107-254中所示的一个或多个靶标多核苷酸、或者其变体或片段、或者其互补序列，以及一种或多种另外的多核苷酸，该多核苷酸导致多个多肽序列的产生或抑制。包含堆叠的多核苷酸序列的转基因植物可以通过传统育种方法或基因工程方法中的一种或两种获得。这些方法包括但不限于，育种各自包含目的多核苷酸的单个品系、如本文所披露的用随后的基因转化包含如下表达构建体的转基因植物，该表达构建体包含如seqidno.：1-53或107-254中所示的各种靶标多核苷酸，或者编码涉及这种靶标序列变体或其片段、或其互补序列的沉默元件，和将基因共转化入单个植物细胞中。如本文所使用的，术语“堆叠”包括使多个性状存在于相同植物中(即，两个性状都并入核基因组中、一个性状并入核基因组中并且另一个性状并入质体的基因组中、或者两种性状都并入质体的基因组中)。在一个非限制性实例中，“堆叠的性状”包括如下分子堆叠物，在该分子堆叠物中，这些序列在物理上彼此相邻。本文所使用的性状是指从特定序列或序列组衍生的表型。可以使用包含多个多核苷酸或分别携带于多个载体上的多核苷酸的单一转化载体进行多核苷酸的共转化。如果通过对该植物进行基因转化来堆叠这些序列，则可以在任何时间和以任何顺序组合目的这些多核苷酸序列。可以用共转化方案将这些性状与转化盒的任何组合所提供的目的多核苷酸一起引入。例如，如果要引入两个序列，则这两个序列可以包含在单独的转化盒(反式)中或包含在相同的转化盒(顺式)中。这些序列的表达可以由相同的启动子或不同的启动子驱动。进一步认识到，使用位点特异性重组系统可以将多核苷酸序列堆叠在所期望的基因组位置上。参见，例如wo1999/25821、wo1999/25854、wo1999/25840、wo1999/25855和wo1999/25853。在一些实施例中，如本文所披露的，单独的或与一种或多种另外的昆虫抗性性状相堆叠的如seqidno.：1-53或107-254中所示的各种靶标多核苷酸、涉及这类靶标序列的沉默元件、以及其变体或片段、或其互补序列，可以与一种或多种另外的投入性状(例如，除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性、胁迫耐受性、抗病性、雄性不育性、茎秆强度等)或产出性状(例如，增加的产量、经修饰的淀粉、改进的油特性、平衡的氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、增加的消化性、改善的纤维品质、抗旱性等)相堆叠。因此，多核苷酸实施例可用于提供具有灵活地且成本有效地防治任何数量的农艺有害生物的能力的经改进的作物品质的完整农艺学方案。可用于堆叠的转基因包括但不限于下文所述的那些转基因。i.赋予昆虫抗性或抗病性的转基因(a)植物抗病性基因通常通过植物中抗病性基因(r)的产物与病原体中相应的无毒性(avr)基因的产物之间的特异性相互作用来活化植物防御。可以用经克隆的抗性基因来转化植物品种，以设计对特定病原菌株具有抗性的植物。参见，例如jones等人(1994)science[科学]266：789(cloningofthetomatocf-9geneforresistancetocladosporiumfulvum[克隆番茄cf-9基因以抵抗番茄叶霉病菌])；martin等人(1993)science[科学]262∶1432(tomatoptogeneforresistancetopseudomonassyringaepv.tomatoencodesaproteinkinase[用于抵抗丁香假单胞菌番茄致病变种的番茄pto基因编码蛋白激酶])；mindrinos等人(1994)cell[细胞]78∶1089(arabidopsisrsp2geneforresistancetopseudomonassyringae[拟南芥rsp2基因用于对抗丁香假单胞菌])，mcdowell和woffenden(2003)trendsbiotechnol.[生物科技趋势]21(4)：178-83以及toyoda等人(2002)transgenicres.[转基因研究]11(6)：567-82。与野生型植物相比，具有抗病性的植物对病原体更具抗性。(b)编码苏云金芽孢杆菌蛋白质的基因，其衍生物或其上建模的合成多肽。参见，例如，geiser等人，(1986)gene[基因]48∶109，其披露了bt6-内毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，编码6-内毒素基因的dna分子可购自美国典型培养物保藏中心(罗克维尔(rockville)，马里兰州)，例如在登录号40098、67136、31995和31998下。经遗传工程化的苏云金芽孢杆菌转基因的其他非限制性实例在以下专利和专利申请中给出，并且特此通过引用并入本文中：美国专利号5,188,960；5,689,052；5,880,275；5,986,177；6,023,013、6,060,594、6,063,597、6,077,824、6,620,988、6,642,030、6,713,259、6,893,826、7,105,332；7,179,965、7,208,474；7,227,056、7,288,643、7,323,556、7,329,736、7,449,552、7,468,278、7,510,878、7,521,235、7,544,862、7,605,304、7,696,412、7,629,504、7,705,216、7,772,465、7,790,846、7,858,849和wo1991/14778；wo1999/31248；wo2001/12731；wo1999/24581和wo1997/40162。也可以堆叠编码杀有害生物蛋白的基因，该基因包括但不限于：来自假单胞菌属的杀昆虫蛋白，如pseen3174(monalysin，(2011)plospathogens[plos病原体]，7∶1-13)，来自假单胞菌蛋白菌菌株cha0和pf-5(此前为荧光假单胞菌(fluorescens))(pechy-tarr，(2008)environmentalmicrobiology[环境微生物学]10∶2368-2386：基因库登录号eu400157)；来自台湾假单胞菌(pseudomonastaiwanensis)(liu等人，(2010)j.agric.foodchem.[农业食品化学学报]58∶12343-12349)和来自假产碱假单胞菌(pseudomonaspseudoalcaligenes)(zhang等人，(2009)annalsofmicrobiology[微生物学年报]59∶45-50和li等人，(2007)plantcelltiss.organcult.[植物细胞组织和器官培养]89∶159-168)；来自发光杆菌属和致病杆菌属的杀昆虫蛋白(hinchliffe等人，(2010)theopentoxinologyjournal[开放性毒理学杂志]3∶101-118和morgan等人，(2001)appliedandenvir.micro.[应用与环境微生物学]67∶2062-2069)，美国专利号6,048,838和美国专利号6,379,946；美国专利公开号us20140007292的pip-1多肽；美国专利公开号us20140033361的afip-1a和/或afip-1b多肽；美国专利公开us20140274885和us20160040184的phi-4多肽；pct公开号wo2015/023846的pip-47多肽、pct公开号wo2015/038734的pip-72多肽；pct公开号wo2015/120270的ptip-50多肽和ptip-65多肽；pct公开号wo2015/120276的ptip-83多肽；pct序列号pct/us15/55502的ptip-96多肽；以及δ-内毒素，包括但不限于cry1、cry2、cry3、cry4、cry5、cry6、cry7、cry8、cry9、cry10、cry11、cry12、cry13、cry14、cry15、cry16、cry17、cry18、cry19、cry20、cry21、cry22、cry23、cry24、cry25、cry26、cry27、cry28、cry29、cry30、cry31、cry32、cry33、cry34、cry35、cry36、cry37、cry38、cry39、cry40、cry41、cry42、cry43、cry44、cry45、cry46、cry47、cry49、cry51和cry55类的δ-内毒素基因和苏云金芽孢杆菌溶细胞cyt1和cyt2基因。苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白的这些类别的成员包括但不限于cry1aa1(登录号aaa22353)；cry1aa2(登录号aaa22552)；cry1aa3(登录号baa00257)；cry1aa4(登录号caa31886)；cry1aa5(登录号baa04468)；cry1aa6(登录号aaa86265)；cry1aa7(登录号aad46139)；cry1aa8(登录号126149)；cry1aa9(登录号baa77213)；cry1aa10(登录号aad55382)；cry1aall(登录号caa70856)；cry1aa12(登录号aap80146)；cry1aa13(登录号aam44305)；cry1aa14(登录号aap40639)；cry1aa15(登录号aay66993)；cry1aa16(登录号hq439776)；cry1aa17(登录号hq439788)；cry1aa18(登录号hq439790)；cry1aa19(登录号hq685121)；cry1aa20(登录号jf340156)；cry1aa21(登录号jn651496)；cry1aa22(登录号kc158223)；cry1ab1(登录号aaa22330)；cry1ab2(登录号aaa22613)；cry1ab3(登录号aaa22561)；cry1ab4(登录号baa00071)；cry1ab5(登录号caa28405)；cry1ab6(登录号aaa22420)；cry1ab7(登录号caa31620)；cry1ab8(登录号aaa22551)；cry1ab9(登录号caa38701)；cry1ab10(登录号a29125)；cry1ab11(登录号i12419)；cry1ab12(登录号aac64003)；cry1ab13(登录号aan76494)；cry1ab14(登录号aag16877)；cry1ab15(登录号aao13302)；cry1ab16(登录号aak55546)；cry1ab17(登录号aat46415)；cry1ab18(登录号aaq88259)；cry1ab19(登录号aaw31761)；cry1ab20(登录号abb72460)；cry1ab21(登录号abs18384)；cry1ab22(登录号abw87320)；cry1ab23(登录号hq439777)；cry1ab24(登录号hq439778)；cry1ab25(登录号hq685122)；cry1ab26(登录号hq847729)；cry1ab27(登录号jn135249)；cry1ab28(登录号jn135250)；cry1ab29(登录号jn135251)；cry1ab30(登录号jn135252)；cry1ab31(登录号jn135253)；cry1ab32(登录号jn135254)；cry1ab33(登录号aas93798)；cry1ab34(登录号kc156668)；cry1ab样(登录号aak14336)；cry1ab样(登录号aak14337)；cry1ab样(登录号aak14338)；cry1ab样(登录号abg88858)；cry1ac1(登录号aaa22331)；cry1ac2(登录号aaa22338)；cry1ac3(登录号caa38098)；cry1ac4(登录号aaa73077)；cry1ac5(登录号aaa22339)；cry1ac6(登录号aaa86266)；cry1ac7(登录号aab46989)；cry1ac8(登录号aac44841)；cry1ac9(登录号aab49768)；cry1ac10(登录号caa05505)；cry1ac11(登录号caa10270)；cry1ac12(登录号i12418)；cry1ac13(登录号aad38701)；cry1ac14(登录号aaq06607)；cry1ac15(登录号aan07788)；cry1ac16(登录号aau87037)；cry1ac17(登录号aax18704)；cry1ac18(登录号aay88347)；cry1ac19(登录号abd37053)；cry1ac20(登录号abb89046)；cry1ac21(登录号aay66992)；cry1ac22(登录号abz01836)；cry1ac23(登录号caq30431)；cry1ac24(登录号abl01535)；cry1ac25(登录号fj513324)；cry1ac26(登录号fj617446)；cry1ac27(登录号fj617447)；cry1ac28(登录号acm90319)；cry1ac29(登录号dq438941)；cry1ac30(登录号gq227507)；cry1ac31(登录号gu446674)；cry1ac32(登录号hm061081)；cry1ac33(登录号gq866913)；cry1ac34(登录号hq230364)；cry1ac35(登录号jf340157)；cry1ac36(登录号jn387137)；cry1ac37(登录号jq317685)；cry1ad1(登录号aaa22340)；cry1ad2(登录号caa01880)；cry1ae1(登录号aaa22410)；cry1af1(登录号aab82749)；cry1ag1(登录号aad46137)；cry1ah1(登录号aaq14326)；cry1ah2(登录号abb76664)；cry1ah3(登录号hq439779)；cry1ai1(登录号aao39719)；cry1ai2(登录号hq439780)；cry1a样(登录号aak14339)；cry1ba1(登录号caa29898)；cry1ba2(登录号caa65003)；cry1ba3(登录号aak63251)；cry1ba4(登录号aak51084)；cry1ba5(登录号abo20894)；cry1ba6(登录号abl60921)；cry1ba7(登录号hq439781)；cry1bb1(登录号aaa22344)；cry1bb2(登录号hq439782)；cry1bc1(登录号caa86568)；cry1bd1(登录号aad10292)；cry1bd2(登录号aam93496)；cry1be1(登录号aac32850)；cry1be2(登录号aaq52387)；cry1be3(登录号acv96720)；cry1be4(登录号hm070026)；cry1bf1(登录号cac50778)；cry1bf2(登录号aaq52380)；cry1bg1(登录号aao39720)；cry1bh1(登录号hq589331)；cry1bi1(登录号kc156700)；cry1ca1(登录号caa30396)；cry1ca2(登录号caa31951)；cry1ca3(登录号aaa22343)；cry1ca4(登录号caa01886)；cry1ca5(登录号caa65457)；cry1ca6[1](登录号aaf37224)；cry1ca7(登录号aag50438)；cry1ca8(登录号aam00264)；cry1ca9(登录号aal79362)；cry1ca10(登录号aan16462)；cry1ca11(登录号aax53094)；cry1ca12(登录号hm070027)；cry1ca13(登录号hq412621)；cry1ca14(登录号jn651493)；cry1cb1(登录号m97880)；cry1cb2(登录号aag35409)；cry1cb3(登录号acd50894)；cry1cb样(登录号aax63901)；cry1da1(登录号caa38099)；cry1da2(登录号i76415)；cry1da3(登录号hq439784)；cry1db1(登录号caa80234)；cry1db2(登录号aak48937)；cry1dc1(登录号abk35074)；cry1ea1(登录号caa37933)；cry1ea2(登录号caa39609)；cry1ea3(登录号aaa22345)；cry1ea4(登录号aad04732)；cry1ea5(登录号a15535)；cry1ea6(登录号aal50330)；cry1ea7(登录号aaw72936)；cry1ea8(登录号abx11258)；cry1ea9(登录号hq439785)；cry1ea10(登录号adr00398)；cry1ea11(登录号jq652456)；cry1eb1(登录号aaa22346)；cry1fa1(登录号aaa22348)；cry1fa2(登录号aaa22347)；cry1fa3(登录号hm070028)；cry1fa4(登录号hm439638)；cry1fb1(登录号caa80235)；cry1fb2(登录号baa25298)；cry1fb3(登录号aaf21767)；cry1fb4(登录号aac10641)；cry1fb5(登录号aao13295)；cry1fb6(登录号acd50892)；cry1fb7(登录号acd50893)；cry1ga1(登录号caa80233)；cry1ga2(登录号caa70506)；cry1gb1(登录号aad10291)；cry1gb2(登录号aao13756)；cry1gc1(登录号aaq52381)；cry1ha1(登录号caa80236)；cry1hb1(登录号aaa79694)；cry1hb2(登录号hq439786)；cry1h样(登录号aaf01213)；cry1ia1(登录号caa44633)；cry1ia2(登录号aaa22354)；cry1ia3(登录号aac36999)；cry1ia4(登录号aab00958)；cry1ia5(登录号caa70124)；cry1ia6(登录号aac26910)；cry1ia7(登录号aam73516)；cry1ia8(登录号aak66742)；cry1ia9(登录号aaq08616)；cry1ia10(登录号aap86782)；cry1ia11(登录号cac85964)；cry1ia12(登录号aav53390)；cry1ia13(登录号abf83202)；cry1ia14(登录号acg63871)；cry1ia15(登录号fj617445)；cry1ia16(登录号fj617448)；cry1ia17(登录号gu989199)；cry1ia18(登录号adk23801)；cry1ia19(登录号hq439787)；cry1ia20(登录号jq228426)；cry1ia21(登录号jq228424)；cry1ia22(登录号jq228427)；cry1ia23(登录号jq228428)；cry1ia24(登录号jq228429)；cry1ia25(登录号jq228430)；cry1ia26(登录号jq228431)；cry1ia27(登录号jq228432)；cry1ia28(登录号jq228433)；cry1ia29(登录号jq22843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1(登录号anc87260)；cry59ba1(登录号jn790647)；cry59aa1(登录号acr43758)；cry60aa1(登录号acu24782)；cry60aa2(登录号eao57254)；cry60aa3(登录号eem99278)；cry60ba1(登录号gu810818)；cry60ba2(登录号eao57253)；cry60ba3(登录号eem99279)；cry61aa1(登录号hm035087)；cry61aa2(登录号hm132125)；cry61aa3(登录号eem19308)；cry62aa1(登录号hm054509)；cry63aa1(登录号bai44028)；cry64aa1(登录号baj05397)；cry65aa1(登录号hm461868)；cry65aa2(登录号zp_04123838)；cry66aa1(登录号hm485581)；cry66aa2(登录号zp_04099945)；cry67aa1(登录号hm485582)；cry67aa2(登录号zp_04148882)；cry68aa1(登录号hq113114)；cry69aa1(登录号hq401006)；cry69aa2(登录号jq821388)；cry69ab1(登录号jn209957)；cry70aa1(登录号jn646781)；cry70ba1(登录号ado51070)；cry70bb1(登录号eel67276)；cry71aa1(登录号jx025568)；cry72aa1(登录号jx025569)。δ-内毒素的实例还包括，但不限于美国专利号5,880,275和7，858,849的cry1a蛋白；美国专利号8,304,604和8.304,605的dig-3或dig-11毒素(cry蛋白(如cry1a)的α螺旋1和/或α螺旋2变体的n末端缺失)，美国专利申请序列号10/525,318的cry1b；美国专利号6,033,874的cry1c；美国专利号5，188,960、6，218，188的cry1f；美国专利号7,070,982、6，962,705和6，713,063的cry1a/f嵌合体；cry2蛋白，例如美国专利号7,064,249的cry2ab蛋白；cry3a蛋白，包括但不限于：通过融合至少两种不同cry蛋白的可变区和保守区的独特组合产生的工程化杂合杀昆虫蛋白(ehip)(美国专利申请公开号2010/0017914)；cry4蛋白；cry5蛋白；cry6蛋白；美国专利号7,329,736、7,449,552、7,803,943、7,476,781、7,105,332、7,378,499和7,462,760的cry8蛋白；cry9蛋白，例如cry9a、cry9b、cry9c、cry9d、cry9e和cry9f家族的成员；cry15蛋白，描述于以下文献中：naimov等人(2008)appliedandenvironmentalmicrobiology[应用与环境微生物学]74：7145-7151；美国专利号6,127,180、6,624,145和6,340,593的cry22、cry34ab1蛋白；美国专利号6,248,535、6,326,351、6,399,330、6,949,626、7,385,107和7,504,229的cryet33和cryet34蛋白；美国专利公开号2006/0191034、2012/0278954和pct公开号wo2012/139004的cryet33和cryet34同系物；美国专利号6,083，499、6,548,291和6,340，593的cry35ab1蛋白；cry46蛋白、cry51蛋白、cry二元毒素；tic901或相关毒素；us2008/0295207的tic807；pctus2006/033867的et29、et37、tic809、tic810、tic812、tic127、tic128；美国专利公开号2016/0108428的tic1100、tlc860、tic867、tic868、tic869和tic836。美国专利号8,236,757的axmi-027、axmi-036和axmi-038；us7,923,602的axmi-031、axmi-039、axmi-040、axmi-049；wo2006/083891的axmi-018、axmi-020和axmi-021；wo2005/038032的axmi-010；wo2005/021585的axmi-003；us2004/0250311的axmi-008；us2004/0216186的axmi-006；us2004/0210965的axmi-007；us2004/0210964的axmi-009；us2004/0197917的axmi-014；us2004/0197916的axmi-004；wo2006/119457的axmi-028和axmi-029；wo2004/074462的axmi-007、axmi-008、axmi-0080rf2、axmi-009、axmi-014和axmi-004；美国专利号8，084，416的axmi-150；us20110023184的axmi-205；us2011/0263488的axmi-011、axmi-012、axmi-013、axmi-015、axmi-019、axmi-044、axmi-037、axmi-043、axmi-033、axmi-034、axmi-022、axmi-023、axmi-041、axmi-063和axmi-064；us2010/0197592的axmi-r1和相关蛋白；wo2011/103248的axmi221z、axmi222z、axmi223z、axmi224z和axmi225z；wo11/103247的axmi218、axmi219、axmi220、axmi226、axmi227、axmi228、axmi229、axmi230和axmi231；美国专利号8，334，431的axmi-115、axmi-113、axmi-005、axmi-163和axmi-184；us2010/0298211的axmi-001、axmi-002、axmi-030、axmi-035和axmi-045；us20090144852的axmi-066和axmi-076；美国专利号8，318，900的axmi168、axmi166、axmi167、axmi168、axmi166、axmi167、axmi168、axmi166、axmi168、axmi168、axmi168、axmi168、axmi168、axmi170、axmi171、axmi172、axmi173、axmi174、axmi175、axmi176、axmi177、axmi178、axmi179、axmi180、axmi181、axmi182、axmi185、axmi186、axmi187、axmi188、axmi189；us2010/0005543的axmi079、axmi080、axmi081、axmi082、axmi091、axmi092、axmi096、axmi097、axmi098、axmi099、axmi100、axmi101、axmi102、axmi103、axmi104、axmi107、axmi108、axmi109、axmi110、axmi111、axmi112、axmi114、axmi116、axmi117、axmi118、axmi119、axmi120、axmi121、axmi122、axmi123、axmi124、axmi1257、axmi1268、axmi127、axmi129、axmi164、axmi151、axmi161、axmi183、axmi132、axmi138、axmi137；和cry蛋白(如cry1a和cry3a)，其具有美国专利号8,319,019的经修饰的蛋白水解位点；美国专利申请公开号2011/0064710的来自苏芸金杆菌菌株vbts2528的cry1ac、cry2aa和cry1ca毒素蛋白，和pct公开号wo2016/061197的ip1b。其他cry蛋白是本领域技术人员熟知的(参见crickmore等人，“bacillusthuringiensistoxinnomenclature[苏云金芽孢杆菌毒素命名法]”(2011)，网址为lifesci.sussex.ac.uk/home/neil_crickmore/bt/，可以使用“www”前缀在万维网上访问)。cry蛋白的杀昆虫活性是本领域技术人员所熟知的(回顾参见vanfrannkenhuyzen，(2009)j.invert.path.[无脊椎动物病理学杂志]101∶1-16)。使用cry蛋白作为转基因植物性状是本领域技术人员所熟知的，并且cry转基因植物(包括但不限于cry1ac、cry1ac+cry2ab、cry1ab、cry1a.105、cry1f、cry1fa2、cry1f+cry1ac、cry2ab、cry3a、mcry3a、cry3bb1、cry34ab1、cry35ab1、vip3a、mcry3a、cry9c和cbi-bt)已获得监管部门的批准(参见，sanahuja，(2011)plantbiotechjournal[植物生物技术杂志]9∶283-300和cera(2010)转基因作物数据库环境风险评估中心(cera)(gmcropdatabasecenterforenvironmentalriskassessment)，ilsi研究基金会，华盛顿特区，网址为cera-gme.org/index.php？action＝gm_crop_database，可以使用“www”前缀在万维网上访问)。本领域技术人员熟知的多种杀有害生物蛋白也可以在如下植物中表达：如vip3ab&cry1fa(us2012/0317682)、cry1be&cry1f(us2012/0311746)、cry1ca&cry1ab(us2012/0311745)、cry1f&cryca(us2012/0317681)、cry1da&cry1be(us2012/0331590)、cry1da&cry1fa(us2012/0331589)、cry1ab&cry1be(us2012/0324606)以及cry1fa&cry2aa、cry1i或cry1e(us2012/0324605))；cry34ab/35ab和cry6aa(us20130167269)；cry34ab/vcry35ab&cry3aa(us20130167268)；cry3a和cry1ab或vip3aa(us20130116170)；以及cry1f、cry34ab1和cry35ab1(pct/us2010/060818)。杀有害生物蛋白还包括杀昆虫脂肪酶，该杀昆虫脂肪酶包括美国专利号7,491,869的脂质酰基水解酶，以及胆固醇氧化酶，例如来自链霉菌(purcell等人，(1993)biochembiophysrescommun[生物化学与生物物理研究通讯]15∶1406-1413)。杀有害生物蛋白还包括美国专利号5,877,012、6,107,279、6,137,033、7,244,820、7,615,686和8,237,020中的vip(营养性杀昆虫蛋白)毒素等。其他vip蛋白质是本领域技术人员所熟知的(参见lifesci.sussex.ac.uk/home/neil_crickmore/bt/vip.html，可以使用“www”前缀在万维网上访问)。杀有害生物蛋白还包括可从如下生物体获得的毒素复合物(tc)蛋白质：致病杆菌、发光杆菌和类芽孢杆菌(参见美国专利号7,491,698和8,084,418)。一些tc蛋白具有“独立”杀昆虫活性，并且其他tc蛋白增强了由相同给定生物体产生的独立毒素的活性。可以通过源自不同属的来源生物体的一种或多种tc蛋白“增效剂”来增强“独立”tc蛋白(例如来自发光杆菌属、致病杆菌属或类芽孢杆菌属)的毒性。有三种主要类型的tc蛋白。如本文所提及的，a类蛋白(“蛋白a”)是独立毒素。b类蛋白(“蛋白b”)和c类蛋白(“蛋白c”)提高了a类蛋白的毒性。a类蛋白的实例是tcba、tcda、xpta1和xpta2。b类蛋白的实例是tcac、tcdb、xptb1xb和xptc1wi。c类蛋白的实例是tccc、xptc1xb和xptb1wi。杀有害生物蛋白还包括蜘蛛、蛇和蝎毒蛋白。蜘蛛肽的实例包括但不限于莱科毒素-1肽及其突变体(美国专利号8,334,366)。(c)编码昆虫特异性激素或信息素(如蜕化类固醇和保幼激素)的多核苷酸，其变体，基于其的模拟物，或者其拮抗剂或激动剂。参见，例如hammock等人(1990)nature[自然]344∶458，该文献公开了经克隆的保幼激素酯酶的杆状病毒表达是保幼激素的灭活剂。(d)编码昆虫特异性肽的多核苷酸，其在表达时破坏受影响有害生物的生理机能。例如，参见regan，(1994)j.biol.chem.[生物化学杂志]269∶9的公开内容(表达克隆产生编码昆虫利尿激素受体的dna)；pratt等人，(1989)biochem.biophys.res.comm.[生物化学与生物物理研究通讯]163∶1243(在diplopterapuntata中识别出了阿洛斯德汀(allostatin))；chattopadhyay等人，(2004)criticalreviewsinmicrobiology[微生物学评论]30(1)：33-54；zjawiony，(2004)jnatprod[天然产物杂志]67(2)：300-310；carlini和grossi-de-sa，(2002)toxicon[毒素]40(11)：1515-1539；ussuf等人，(2001)currsci.[当代科学]80(7)：847-853以及vasconcelos和oliveira，(2004)toxicon[毒素]44(4)：385-403。还参见，美国专利号5,266,317，作者tomalski等人，他们披露了编码昆虫特异性毒素的基因。(e)编码如下酶的多核苷酸，该多核苷酸负责单萜、倍半萜烯、类固醇、异羟肟酸、苯丙素衍生物或具有杀昆虫活性的其他非蛋白质分子的超累积。(f)编码参与生物活性分子的修饰(包括翻译后修饰)的酶的多核苷酸；例如糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶，无论是天然还是合成的。参见，pct申请wo1993/02197，所属人为scott等人，该文献披露了调节酶(callase)基因的核苷酸序列。含有几丁质酶编码序列的dna分子可以例如从登录号39637和67152下的atcc获得。还参见，kramer等人，(1993)insectbiochem.molec.biol.[分子细胞生物学]23:691，他们教导了编码烟草钩虫几丁质酶的cdna的核苷酸序列和kawalleck等人，(1993)plantmolec.biol.[分子细胞生物学]21：673，他们提供了欧芹ubi4-2聚泛素基因的核苷酸序列，以及美国专利号6,563,020、7,145,060和7,087,810。(g)编码刺激信号转导的分子的多核苷酸。例如，参见botella等人，(1994)plantmolec.biol.[分子细胞生物学]24：757，该文献公开了绿豆钙调素cdna克隆的核苷酸序列，以及griess等人，(1994)plantphysiol.[植物生理学]104：1467，他们提供了玉米钙调素cdna克隆的核苷酸序列。(h)编码疏水时刻肽(momentpeptide)的多核苷酸。参见，pct申请wo1995/16776和美国专利号5,580,852(公开了抑制真菌植物病原体的鲎素(tachyplesin)的肽衍生物)以及pct申请wo1995/18855和美国专利号5,607,914(教导了赋予抗病性的合成抗微生物肽)。(i)编码膜通透酶、通道形成剂(channelformer)或通道阻断剂的多核苷酸。例如，参见jaynes等人，(1993)plantsci.[植物科学]89∶43，该文献公开了天蚕素-β裂解肽类似物的异源表达，以提供对烟草假单胞菌具有抗性的转基因烟草植物。(j)编码病毒侵入性蛋白质的基因或由其衍生的复合毒素。例如，病毒外壳蛋白在转化的植物细胞中的积累赋予由外源蛋白基因来源的病毒以及由相关病毒导致的病毒侵染和/或疾病发展的抗性。参见，beachy等人，(1990)ann.rev.phytopathol.[植物病理学年评]28∶451。外壳蛋白介导的抗性已被赋予至转化植物抵抗以下各项：苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草线条病毒、马铃薯x病毒、马铃薯y病毒、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒。同上。(k)编码昆虫特异性抗体或由其衍生的免疫毒素的基因。因此，靶向昆虫肠道中关键代谢功能的抗体将使受影响的酶失活，杀死该昆虫。参看taylor等人，摘要#497，关于分子植物-微生物相互作用的第七届国际研讨会(seventhint′lsymposiumonmolecularplant-microbeinteractions)(苏格兰爱丁堡(edinburgh，scotland)，1994)(通过生产单链抗体片段在转基因烟草中的酶失活)。(l)编码病毒特异性抗体的基因。参见，例如tavladoraki等人，(1993)nature[自然]366∶469，其作者显示，表达重组抗体基因的转基因植物不受病毒侵袭。(m)编码由病原体或寄生虫在自然中产生的发育阻滞蛋白的多核苷酸。因此，真菌内α-1，4-d-多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁homo-α-1，4-d-半乳糖醛酸酶来促进真菌定植和植物营养释放。参见lamb等人，(1992)bio/technology[生物技术]10∶1436。以下文献描述了编码豆内聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征：toubart等人，(1992)plantj.[植物杂志]2：367。(n)编码由植物在自然中产生的发育抑制蛋白的多核苷酸。例如，已在以下文献中表明表达大麦核糖体失活基因的转基因植物具有增加的对真菌疾病的抗性：logemann等人，(1992)bio/technology[生物技术]10∶305。(o)参与系统获得抗性(sar)反应的基因和/或发病机制相关的基因。briggs，(1995)currentbiology[当代生物学]5(2)，pieterse和vanloon，(2004)curr.opin.plantbio.[植物生物学新观点]7(4)：456-64，以及somssich，(2003)cell[细胞]113(7)：815-6。(p)抗真菌基因(comelissen和melchers，(1993)pl.physiol.[植物生理学]101∶709-712，和parijs等人，(1991)planta[植物]183∶258-264，以及bushnell等人，(1998)can.j.ofplantpath.[加拿大植物病理学杂志]20(2)：137-149)。还参见，美国专利申请序列号09/950,933；11/619,645；11/657,710；11/748,994；11/774，121以及美国专利号6,891,085和7,306,946。lysm受体样激酶用于感知几丁质片段，作为植物对真菌病原体防御反应的第一步(us2012/0110696)。(q)解毒基因，如伏马菌素、白僵菌素、念珠菌素和玉米赤霉烯酮及其结构相关的衍生物的基因。例如，参见美国专利号5,716,820；5,792,931；5,798,255；5,846,812；6,083,736；6,538,177；6,388,171和6,812,380。(r)编码胱抑素和半胱氨酸蛋白酶抑制剂的多核苷酸。参见，美国专利号7,205,453。(s)防御素基因。参见wo2003/000863和美国专利号6,911,577；6,855,865；6,777,592和7,238,781。(t)赋予线虫抗性的基因。参见，例如pct申请wo1996/30517；pct申请wo1993/19181、wo2003/033651，以及urwin等人，(1998)planta[植物]204：472-479，和williamson，(1999)curropinplantbio.[植物生物学新观点]2(4)：327-31；美国专利号6,284,948和7,301,069，和mir164基因(wo2012/058266)。(u)赋予对疫霉根腐病抗性的基因，如rps1、rps1-a、rps1-b、rps1-c、rps1-d、rps1-e、rps1-k、rps2、rps3-a、rps3-b、rps3-c、rps4、rps5、rps6、rps7和其他rps基因。参见，例如shoemaker等人，phytophthorarootrotresistancegenemappinginsoybean[大豆中疫霉根腐病抗性基因图谱]，植物基因组第四次会议，加利福尼亚州圣地亚哥(sandiego，calif.)(1995)。(v)赋予对褐茎腐病抗性的基因，如美国专利号5,689,035所述，并为此通过引入并入本文。(w)赋予对炭疽菌抗性的基因，如美国专利申请公开us2009/0035765中所述，并为此通过引用并入本文。这包括可以用作单一基因座转化的rcg基因座。(x)一些实施例涉及通过干扰核糖核酸(rna)分子来下调昆虫有害生物物种中靶基因的表达。pct公开wo2007/074405描述了抑制包括科罗拉多马铃薯甲虫在内的无脊椎动物有害生物中靶基因表达的方法。pct公开wo2005/110068描述了抑制无脊椎动物有害生物(特别是包括西方玉米根虫)中靶基因表达的方法，该方法作为防治昆虫侵染的手段。此外，pct公开wo2009/091864描述了用于抑制来自昆虫有害生物物种(包括来自草盲蝽属的有害生物)的靶基因的组合物和方法。核酸分子包括用于靶向液泡atp酶h亚基的沉默元件，该沉默元件可用于防治如美国专利申请公开号2012/0198586中所述的鞘翅目有害生物群体和侵袭。pct公开wo2012/055982描述了抑制或下调如下靶基因的表达的核糖核酸(rna或双链rna)，该靶基因编码：昆虫核糖体蛋白，如核糖体蛋白l19、核糖体蛋白l40或核糖体蛋白s27a；昆虫蛋白酶体亚基，如rpn6蛋白，pros25，rpn2蛋白，蛋白酶体p1亚基蛋白或prosβ2蛋白；copi囊泡的昆虫β-外被体，copi囊泡的γ-外被体，copi囊泡的β′-外被体蛋白或ζ-外被体；昆虫四跨膜蛋白2a蛋白，其是假定跨膜结构域蛋白；属于肌动蛋白家族的昆虫蛋白，如肌动蛋白5c；昆虫泛素-5e蛋白；昆虫sec23蛋白(参与细胞内蛋白质运输的gtp酶激活子)；涉及运动活性的作为非常规肌球蛋白的昆虫皱纹蛋白质；涉及核替代mrna剪接调节的昆虫曲颈蛋白；昆虫液泡h+-atp酶g亚基蛋白和昆虫tbp-1如tat结合蛋白。pct公开wo2007/035650描述了抑制或下调编码snf7的靶基因表达的核糖核酸(rna或双链rna)。美国专利申请公开2011/0054007描述了靶向rps10的多核苷酸沉默元件。美国专利申请公开2014/0275208和us2015/0257389描述了靶向ryanr和pat3的多核苷酸沉默元件。pct公开wo2016/060911、wo2016/060912、wo2016/060913、和wo2016/060914描述了靶向赋予对鞘翅目和半翅目有害生物的抗性的copi衣壳亚单位核酸分子的多核苷酸沉默元件。美国专利申请公开2012/029750、us20120297501和2012/0322660描述了干扰核糖核酸(rna或双链rna)，该干扰核糖核酸在被昆虫有害生物物种摄取时起作用以下调所述昆虫有害生物中靶基因的表达，其中该rna包含至少一个沉默元件，其中该沉默元件是包含经退火的互补链的双链rna区域，所述双链rna区域的一条链包含或由如下核苷酸序列组成，该核苷酸序列至少部分地与靶基因中的靶标核苷酸序列互补。美国专利申请公开2012/0164205描述了用于干扰双链核糖核酸(用于抑制无脊椎动物有害生物)的潜在靶标，包括：chd3同源序列、β-微管蛋白同源序列、40kdav-atp酶同源序列、ef1α同源序列、26s蛋白质体亚基p28同源序列、保幼激素环氧化物酶水解酶同源序列、溶胀依赖氯通道蛋白同源序列、葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶蛋白同源序列、act42a蛋白同源序列、adp-核糖因子1同源序列、转录因子iib蛋白同源序列、几丁质酶同源序列、泛素缀合酶同源序列、甘油醛-3-磷酸脱氢酶同源序列、泛素b同源序列、保幼激素酯酶同源物、和α微管蛋白同源序列。ii.赋予除草剂抗性的转基因(a)编码对如下除草剂的抗性的多核苷酸，该除草剂抑制生长点或分生组织，如咪唑啉酮或磺酰脲。此分类码中的示例性基因突变体als和ahas酶，分别如以下文献中所述：lee等人，(1988)emboj.[欧洲分子生物学学会杂志]7：1241和miki等人，(1990)theor.appl.genet.[理论与应用遗传学]80：449。还参见美国专利号5,605,011；5,013,659；5,141,870；5,767,361；5,731，180；5,304,732；4,761,373；5,331,107；5,928,937和5,378,824；美国专利申请序号11/683,737和国际公开wo1996/33270。(b)编码草甘膦抗性的蛋白质的多核苷酸(5-烯醇式丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(epsp)和aroa基因给予的抗性)和其他膦酰基化合物如草胺膦(草胺膦乙酰转移酶(pat)和吸水链霉菌草胺膦乙酰转移酶(bar)基因)，以及吡啶氧基或苯氧基丙酸和环己酮(acc酶抑制剂编码基因)。参见，例如shah等人的美国专利号4,940,835，其披露了epsps形式的能赋予草甘磷抗性的核苷酸序列。barry等人的美国专利号5,627,061也描述了编码epsps酶的基因。还参见美国专利号6,566,587；6,338,961；6,248,876b1；6,040,497；5,804,425；5,633,435；5,145,783；4,971,908；5,312,910；5，188,642；5,094,945、4,940,835；5,866,775；6,225，114b1；6,130,366；5,310,667；4,535,060；4,769,061；5,633,448；5,510,471；re.36,449；re37,287e和5,491,288以及国际公开ep1173580；wo2001/66704；ep1173581和ep1173582中。还给予植物草甘磷抗性，使该植物表达编码草甘磷氧化还原酶的基因，这在美国专利号5,776,760和5,463，175中进行了更全面地描述。另外，可通过过量表达编码草甘磷n-乙酰转移酶的基因，来赋予植物草甘磷抗性。参见，例如美国专利号7,462,481；7,405,074以及美国专利申请公开号2008/0234130。编码突变area基因的dna分子可以在atcc登录号39256下获得，并且该突变基因的核苷酸序列披露于授予comai的美国专利号4,769,061中。欧洲申请号0333033(kumada等人)和美国专利号4,975,374(goodman等人)披露了赋予除草剂(如l-草铵膦)抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。leemans等人的ep申请号0242246和0242236中提供了草丁膦乙酰基转移酶基因的核苷酸序列；degreef等人，(1989)bio/technology[生物/技术]7：61，描述了表达编码草丁膦乙酰转移酶活性的嵌合bar基因的转基因植物的产生。还参见美国专利号5,969,213；5,489,520；5,550,318；5,874,265；5,919,675；5,561,236；5,648,477；5,646,024；6,177,616b1和5,879,903。赋予苯氧基丙酸和环己酮(如稀禾定和吡氟氯禾灵)抗性的示例性基因是acc1-s1、acc1-s2和acc1-s3基因，其描述于以下文献中：marshall等人，(1992)theor.appl.genet.[理论与应用遗传学]83：435。(c)编码对抑制光合作用的除草剂具有抗性的蛋白质的多核苷酸，例如三嗪(psba和gs+基因)和苄腈(腈水解酶基因)。przibilla等人(1991)plantcell[植物细胞]3∶169，描述了用编码突变体psba基因的质粒对衣藻进行转化。针对腈水解酶基因的核苷酸序列披露在美国专利号4,810,648(stalker)中，并且含有这些基因的dna分子可以在atcc登录号53435,67441和53435,67442下获得。编码谷胱甘肽s-转移酶的dna的克隆和表达描述于以下文献中：hayes等人，(1992)biochem.j.[生物化学杂志]285：173。(d)已经发现，编码对乙酰醇酸合成酶具有抗性的蛋白质的多核苷酸能产生表达这种对多种类型的除草剂具有抗性的酶的植物，并已将该多核苷酸引入到多种植物中(参见，例如hattori等人(1995)molgengenet.[分子和普通遗传学]246：419)。赋予除草剂抗性的其他基因包括：编码大鼠细胞色素p4507a1和酵母nadph-细胞色素p450氧化还原酶的嵌合蛋白的基因(shiota等人，(1994)plantphysiol[植物生理学]106：17)，针对谷胱甘肽还原酶和超氧化物歧化酶的基因(aono等人，(1995)plantcellphysiol[植物细胞生理学]36：1687)和各种磷酸转移酶的基因(datta等人，(1992)plantmolbiol[植物分子生理学]20：619)。(e)编码靶向原卟啉原氧化酶(protox)(对于生产叶绿素所必需的)的除草剂抗性的多核苷酸。原卟啉原氧化酶(protox)作为针对各种除草化合物的靶标。这些除草剂还抑制存在的所有不同种类的植物的生长，导致其完全破坏。含有对这些除草剂具有抗性的经改变的原卟啉原氧化酶(protox)活性的植物的发育描述于以下文献中：美国专利号6,288,306b1；6,282,837b1和5,767,373，以及国际公开wo2001/12825。(f)aad-1基因(最初来自鞘脂单胞菌(sphingobiumherbicidovorans))编码芳氧基链烷酸酯双加氧酶(aad-1)蛋白。该性状赋予对2，4-二氯苯氧基乙酸和芳氧基苯氧基丙酸酯(通常称为“fop”除草剂，例如喹禾灵)除草剂的耐受性。用于植物中除草剂耐受性的aad-1基因本身首先在wo2005/107437中披露(还参见us2009/0093366)。来自食酸丛毛单胞菌的aad-12基因，其编码芳氧基链烷酸酯双加氧酶(aad-12)蛋白，该蛋白通过用芳氧基链烷酸酯部分(包括苯氧基生长素(例如2，4-d，mcpa)以及吡啶氧基生长素(例如氯氟吡氧乙酸，三氯吡氧乙酸))使几种除草剂失活来赋予对2，4-二氯苯氧基乙酸和吡啶氧基乙酸酯除草剂的耐受性。(g)美国专利申请公开2003/0135879中所披露的用于给予麦草畏耐受性的编码除草剂抗性的麦草畏单加氧酶的多核苷酸。(h)美国专利号4,810,648中所披露的用于给予溴苯腈耐受性的编码溴苯腈腈水解酶(bxn)的多核苷酸分子。(i)用于达草灭耐受性的编码八氢番茄红素(crt1)的多核苷酸分子描述于以下文献中：misawa等人，(1993)plantj.[植物杂志]4：833-840和misawa等人，(1994)plantj.[植物杂志]6：481-489。iii.赋予或贡献于经改变的谷物特征的转基因(a)经改变的脂肪酸，例如，通过(1)硬脂酰-acp的下调来增加植物的硬脂酸含量。参见，knultzon等人，(1992)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]89：2624和wo1999/64579(genestoalterlipidprofilesincorn[改变玉米脂质谱的基因])；(2)通过fad-2基因修饰提高油酸和/或通过fad-3基因修饰降低亚麻酸(参见美国专利号6,063,947；6,323,392；6,372,965以及wo1993/11245)；(3)改变共轭的亚麻酸或亚油酸含量，如wo2001/12800中；(4)改变lec1、agp、dek1、superal1、milps、各种ipa基因(如ipal、ipa3、hpt或hggt)。例如，参见wo2002/42424，wo1998/22604，wo2003/011015，wo2002/057439，wo2003/011015，美国专利号6,423,886、6，197,561、6,825,397，和美国专利申请公开号us2003/0079247、us2003/0204870，以及rivera-madrid等人，(1995)proc.natl.acad.sci.[国家科学院院刊]92：5620-5624；(5)编码用于制备长链多不饱和脂肪酸的δ-8去饱和酶的基因(美国专利号8,058,571和8,338，152)，用于降低饱和脂肪的δ-9去饱和酶(美国专利号8,063,269)，用于改善ω-3脂肪酸谱的报春花δ6-去饱和酶；(6)与脂质和糖代谢调节相关的分离的核酸和蛋白质，特别是用于生产转基因植物和调节种子储存化合物(包括脂质、脂肪酸、淀粉或种子储存蛋白)的水平的方法中以及并用于调节植物种子大小、种子数、种子重量、根长和叶子大小的方法中的脂质代谢蛋白(lmp)(ep2404499)；(7)改变植物中糖诱导型2(hsi2)蛋白的高水平表达，以增加或减少植物中hsi2的表达。增加hsi2的表达增加油含量，然而降低hsi2的表达降低脱落酸敏感性和/或增加抗旱性(美国专利申请公开号2012/0066794)；(8)细胞色素b5(cb5)单独的或与fad2一起的表达调节植物种子中的油含量，特别是提高ω-3脂肪酸的水平，并提高ω-6脂肪酸与ω-3脂肪酸的比例(美国专利申请公开号2011/0191904)；以及(9)编码用于调节糖代谢的皱纹1样多肽的核酸分子(美国专利号8,217,223)。(b)经改变的磷含量，例如，通过(1)引入植酸酶编码基因将促进植酸盐的分解，向经转化的植物中添加更多的游离磷酸盐。例如，参见vanhartingsveldt等人，(1993)gene[基因]127：87，该文献公开了黑曲霉植酸酶基因的核苷酸序列；和(2)调节降低植酸盐含量的基因。例如，可以在玉米中通过以下方法来完成：克隆然后重新引入与一个或多个等位基因相关联的dna，例如在以低水平的植酸为特征的玉米突变体中经识别的lpa等位基因，例如wo2005/113778中；和/或改变肌醇激酶活性，如wo2002/059324、美国专利申请公开号2003/0009011、wo2003/027243、美国专利申请公开号2003/0079247、wo1999/05298、美国专利号6,197,561、美国专利号6,291,224、美国专利号6,391,348、wo2002/059324、美国专利申请公开号2003/0079247、wo1998/45448、wo1999/55882、wo2001/04147中。(c)经改变的受到影响的碳水化合物，例如通过改变如下基因：影响淀粉分支模式的酶的基因，或改变硫氧还蛋白(如ntr和/或trx)(参见美国专利号6,531,648，为此目的通过引用并入本文)和/或γ玉米蛋白敲除或突变体(如cs27或tusc27或者en27)(参见美国专利号6,858,778和美国专利申请公开号2005/0160488、美国专利申请公开号2005/0204418，其通过引用并入本文)的基因。参见，shiroza等人，(1988)j.bacteriol.[细菌学杂志]170：810(链球菌突变体果糖基转移酶基因的核苷酸序列)，steinmetz等人，(1985)mol.gen.genet.[分子遗传学和基因组学]200：220(枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)，pen等人，(1992)bio/technology[生物技术]10：292(表达地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的转基因植物的生产)，elliot等人，(1993)plantmolec.biol.[植物分子生物学]21：515(番茄转化酶基因的核苷酸序列)，sogaard等人，(1993)j.biol.chem.[生物化学杂志]268：22480(大麦α-淀粉酶基因的定点诱变)以及fisher等人，(1993)plantphysiol.[植物生理学]102：1045(玉米胚乳淀粉分支酶ii)，wo1999/10498(通过修饰udp-d-木糖4-差向异构酶、fragile1和2、ref1、hchl、c4h改善消化性和/或淀粉提取)，美国专利号6,232,529(通过改变淀粉水平生产高油种子的方法(agp))。本文提及的脂肪酸修饰基因也可用于通过淀粉和油途径的相互关系来影响淀粉含量和/或组成。(d)改变的抗氧化剂含量或组成，如改变生育酚或生育三烯酚。例如，参见美国专利号6,787,683、美国专利申请公开号2004/0034886和wo2000/68393、以及wo2003/082899，这些专利涉及通过改变尿黑酸香叶基香叶基转移酶(hggt)来操作抗氧化剂水平。(e)改变的必需种子氨基酸。例如，参见美国专利号6，127,600(增加种子中必需氨基酸积累的方法)、美国专利号6,080,913(增加种子中必需氨基酸积累的二元方法)、美国专利号5,990,389(高赖氨酸)、wo1999/40209(种子中氨基酸组成的改变)、wo1999/29882(用于改变蛋白质的氨基酸含量的方法)、美国专利号5,850,016(种子中氨基酸组成的改变)、wo1998/20133(具有升高水平的必需氨基酸的蛋白质)、美国专利号5,885,802(高甲硫氨酸)、美国专利号5,885,801(高苏氨酸)、美国专利号6,664,445(植物氨基酸生物合成酶)、美国专利号6,459,019(赖氨酸和苏氨酸增加)、美国专利号6,441,274(植物色氨酸合酶β亚基)、美国专利号6,346,403(甲硫氨酸代谢酶)、美国专利号5,939,599(高硫)、美国专利号5,912,414(甲硫氨酸增加)、wo1998/56935(植物氨基酸生物合成酶)、wo1998/45458(具有较高百分比的必需氨基酸的工程化种子蛋白)、wo1998/42831(赖氨酸增加)、美国专利号5,633,436(增加含硫氨基酸含量)、美国专利号5,559,223(具有含可编程水平的必需氨基酸的明确定义的结构的合成储存蛋白，用于改善植物的营养价值)、wo1996/01905(苏氨酸增加)、wo1995/15392(赖氨酸增加)、美国专利申请公开号2003/0163838、美国专利申请公开号2003/0150014、美国专利申请公开号2004/0068767、美国专利号6,803,498、wo2001/79516。iv.控制雄性不育的基因有几种授予遗传雄性不育的方法，例如授予雄性不育的基因组内单独位置处的多个突变基因，如brar等人在美国专利号4,654,465和4,727,219中所披露的，以及染色体易位，如patterson在美国专利号3,861,709和3,710,511中所述。除了这些方法之外，albertsen等人在美国专利号5,432,068中描述了细胞核雄性不育的系统，该系统包括：识别对雄性能育性至关重要的基因；沉默这种对雄性能育性至关重要的天然基因；从必需的雄性能育性基因中除去天然启动子并用诱导型启动子取代；将该遗传工程化基因插回入植物；并因此产生雄性不育的植物，因为诱导型启动子不是“开”的，导致雄性能育性基因不被转录。通过诱导或将启动子打“开”来恢复能育性，该启动子反过来又允许赋予雄性能育性的基因被转录。非限制性实例包括：(a)在绒毡层特异性启动子的控制下并施用化学品n-ac-ppt来引入脱乙酰酶基因(wo2001/29237)；(b)引入各种雄蕊特异性启动子(wo1992/13956，wo1992/13957)；和(c)引入barnase和barstar基因(paul等人，(1992)plantmol.biol.[植物分子生物学]19：611-622)。关于细胞核雄性和雌性不育系统和基因的另外的实例，也可参见美国专利号5,859,341；6,297,426；5,478,369；5,824,524；5,850,014和6,265,640。v.创建用于位点特异性dna整合的位点的基因这包括引入可能用于flp/frt系统中的frt位点和可能用于cre/loxp系统中的lox位点。例如，参见lyznik等人(2003)plantcellrep[植物细胞报告]21：925-932和wo1999/25821。可以使用的其他系统包括噬菌体mu的gln重组酶(maeser等人，(1991)vickichandler，themaizehandbook[玉米手册]ch.118(施普林格出版公司(springer-verlag)1994)、大肠杆菌的pin重组酶(enomoto等人，1983)和psri质粒的r/rs系统(araki等人，1992)。vi.影响非生物胁迫抗性的基因包括但不限于开花、穗和种子发育、提高氮利用效率、改变氮反应性、抗旱性或耐旱性、抗寒性或耐寒性、抗盐性或耐盐性以及在胁迫下产量增加。非限制性实例包括：(a)例如，参见：wo2000/73475，其中通过改变苹果酸来改变水分的使用效率；美国专利号5,892,009、5,965,705、5,929,305、5,891,859、6,417,428、6,664,446、6,706,866、6,717,034、6,801,104，wo2000/060089，wo2001/026459，wo2001/035725，wo2001/034726，wo2001/035727，wo2001/036444，wo2001/036597，wo2001/036598，wo2002/015675，wo2002/017430，wo2002/077185，wo2002/079403，wo2003/013227，wo2003/013228，wo2003/014327，wo2004/031349，wo2004/076638，wo199809521；(b)wo199938977描述了基因(包括cbf基因)以及有效减轻冷冻、高盐度和干旱对植物的负面影响以及赋予植物表型其他积极作用的转录因子；(c)美国专利申请公开号2004/0148654和wo2001/36596中，在植物中改变脱落酸，产生改良的植物表型，例如增加的产量和/或增加的对非生物胁迫的耐受性；(d)wo2000/006341、wo2004/090143、美国专利号7,531,723和6,992,237中，修饰细胞分裂素表达，产生具有增加的胁迫耐受性(例如耐旱性和/或增加的产量)的植物。还可参见，wo2002/02776、wo2003/052063、jp2002/281975、美国专利号6,084，153、wo2001/64898、美国专利号6,177,275和美国专利号6,107,547(提高氮利用率和改变氮反应性)；(e)关于乙烯改变，参见美国专利申请公开号2004/0128719、美国专利申请公开号2003/0166197和wo2000/32761；(f)关于非生物胁迫的植物转录因子或转录调节子，参见例如美国专利申请公开号2004/0098764或美国专利申请公开号2004/0078852；(g)增加液泡焦磷酸酶(如avp1)表达的基因(美国专利号8,058,515)，用于提高产量；编码hsfa4或hsfa5的核酸(a4或a5类的热休克因子)多肽，寡肽转运蛋白(opt4样)多肽；plastochron2样(pla2样)多肽或wuschel相关同源盒1样(wox1样)多肽(美国专利申请公开号us2011/0283420)；(h)下调编码聚(adp-核糖)聚合酶(parp)蛋白的多核苷酸来调节程序性细胞死亡(美国专利号8,058,510)，用于增加活力；(i)编码用于赋予抗旱性的dtp21多肽的多核苷酸(美国专利申请公开号us2011/0277181)；(j)编码acc合酶3(acs3)蛋白质的核苷酸序列，用于调节发育、调节胁迫应答和调节胁迫耐受性(美国专利申请公开号2010/0287669)；(k)编码赋予耐旱表型(dtp)的蛋白质以赋予抗旱性的多核苷酸(wo2012/058528)；(l)赋予耐旱性和耐盐性的生育酚环化酶(tc)基因(美国专利申请公开号2012/0272352)；(m)caax氨基末端家族蛋白质用于胁迫耐受性(美国专利号8,338,661)；(n)sal1编码基因中的突变具有增加的胁迫耐受性，包括增加的抗旱性(美国专利申请公开号2010/0257633)；(o)编码增加产量相关性状的多肽(选自由grf多肽、raa1样多肽、syr多肽、arkl多肽和ytp多肽组成的组)的核酸序列的表达(美国专利申请公开号2011/0061133)；(p)调节植物中编码iii类海藻糖磷酸酯酶(tpp)多肽的核酸的表达，用于增强植物中产量相关的性状，特别是增加种子产量(美国专利申请公开号2010/0024067)。影响植物生长和农艺性状(如产量、开花、植物生长和/或植物结构)的其他基因和转录因子可被引入或种质渗入到植物中，参见例如wo1997/49811(lhy)、wo1998/56918(esd4)、wo1997/10339和美国专利号6,573,430(tfl)、美国专利号6,713,663(ft)、wo1996/14414(con)、wo1996/38560、wo2001/21822(vrn1)、wo2000/44918(vrn2)、wo1999/49064(gi)、wo2000/46358(fr1)、wo1997/29123、美国专利号6,794,560、美国专利号6,307，126(gai)、wo1999/09174(d8和rht)以及wo2004/076638和wo2004/031349(转录因子)。vii.赋予增加的产量的基因赋予增加的产量的基因的非限制性实例是：(a)由编码核酸的1-氨基环丙烷-1-羧酸酯脱氨酶样多肽(accdp)转化的转基因作物植物，其中，与该植物的野生型品种相比，在该作物植物中的核酸序列的表达使该植物具有增加的根生长、和/或增加的产量、和/或增加的对环境胁迫的耐受性(美国专利号8,097,769)；(b)已显示，使用种子偏好性启动子的玉米锌指蛋白基因(zm-zfp1)的过表达能促进植物生长、增加每株植物的核数和总核重量(美国专利申请公开号2012/0079623)；(c)已显示，玉米侧生器官界限(lob)结构域蛋白(zm-lobdp1)的组成型过表达能增加每株植物的核数和总核重量(美国专利申请公开号2012/0079622)；(d)通过调节植物中编码vim1(甲基化1中的变体)样多肽或vtc2样(gdp-l-半乳糖磷酸化酶)多肽或duf1685多肽或arf6样(生长素应答因子)多肽(wo2012/038893)的核酸的表达来增强植物中产量相关的性状；(e)调节植物中编码ste20样多肽或其同源物的核酸的表达，得到相对于对照植物具有增加的产量的植物(ep2431472)；以及(f)编码核苷二磷酸酶激酶(ndk)多肽及其同源物的基因，用于修饰该植物根系结构(美国专利申请公开号2009/0064373)。ix.使用方法本文中披露的方法包含用于防治如下植物昆虫有害生物的方法：例如鞘翅目、半翅目或鳞翅目植物有害生物，包括叶甲属、瘦跗叶甲属、条跳甲属、无网蚜属、小粉虱属、茶翅蝽属、稻绿蝽属或灰翅夜蛾属植物有害生物。在一个实施例中，该方法包括向植物昆虫有害生物饲喂或施用包含本文披露的沉默元件的组合物，其中所述沉默元件在被植物昆虫有害生物(即，并不限于，鞘翅目植物有害生物，包括叶甲属植物有害生物，诸如玉米根萤叶甲、北方玉米根虫、墨西哥玉米根虫、南美叶甲或斑点黄瓜甲虫)摄取或接触时，降低该有害生物的靶标多核苷酸的水平，并且因此能防治该有害生物。可以以各种方式向该有害生物饲喂沉默元件。该沉默元件可以饲喂给雄性、雌性或两性有害生物。例如，在一个实施例中，将编码沉默元件，即靶向如seqidnos.：1-53或107-254中所示一个或多个多核苷酸的沉默元件的多核苷酸引入植物中。由于植物有害生物以表达这些序列的植物或其部分为食，所以在幼虫、成虫、或者在任何或所有的发育阶段，将所述沉默元件递送到该有害生物中。在一个实施例中，本文所述的方法和组合物进一步包含含有本文披露的沉默元件的转基因植物，其中所述沉默元件在幼虫、成虫、或者在任何或所有的发育阶段均具有不育化活性。当以这种方式将沉默元件递送到植物中时，已经认识到，该沉默元件可以以构成或替代的方式被表达，其可以通过使用各种本文别处所讨论的诱导型、或组织偏好性、或受发育调节的启动予以阶段特异性方式产生。在某些实施例中，该沉默元件在根、杆或茎、叶(包括花梗、木质部和韧皮部)、果实或生殖组织、丝、花、及其中的所有部分、或其任何组合中表达。以这种方式暴露于沉默元件可能产生不育昆虫，并且因此通过竞争性交配或sit使相反性别的昆虫不育。在另一种方法中，将包含本文所披露的至少一种沉默元件的组合物施用于植物。在这样的实施例中，可以将沉默元件配制在农艺学上合适的和/或环境可接受的载体(优选适于在田间喷散)中。在一些实施例中，可以将靶向不同昆虫阶段、途径和性别的沉默元件组合获得不育活性和杀昆虫活性。在一个实施例中，本文披露的沉默元件可以通过桶混与杀昆虫化学物质混合。此外，载体还可以包括增加该组合物半衰期的化合物。在某些实施例中，包含该沉默元件的组合物以这样的方式配制，使得其在环境中持续一段足以允许其被递送至植物有害生物中的时间。在此类实施例中，可将该组合物施用到植物昆虫有害生物所栖息的区域。在一个实施例中，将该组合物外部施用于植物(即，通过喷洒田地)以保护植物免受有害生物的侵害。由暴露于沉默元件产生的不育昆虫可以通过竞争性交配或sit使异性昆虫不育。在某些实施例中，所披露的多核苷酸或构建体可以与目的多核苷酸序列的任何组合堆叠，以产生具有所需性状的植物。本文所用的性状是指从特定序列或序列组所衍生的表型。例如，本文所述的多核苷酸可以与编码具有杀有害生物和/或杀昆虫活性的多肽的任何其他多核苷酸堆叠，例如其他苏云金芽孢杆菌毒性蛋白(描述于美国专利号5,366,892；5,747,450；5,737,514；5,723,756；5,593,881；和geiser等人，(1986)gene[基因]48：109中)、凝集素(vandamme等人，(1994)plantmol.biol.[植物分子生物学]24：825)、果胶(pentin)(描述于美国专利号5,981,722中)等。产生的组合也可以包括目的多核苷酸中的任一种的多个拷贝。本文所述的多核苷酸还可以与任何其他基因或基因组合堆叠以产生具有多种期望的性状组合的植物，该期望的性状包括但不限于动物饲料所期望的性状，例如高油基因(例如，美国专利号6,232,529)；平衡氨基酸(例如，戈多硫蛋白(hordothionin)(美国专利号5,990,389；5,885,801；5,885,802；和5,703,409)；大麦高赖氨酸(williamson等人(1987)eur.j.biochem.[欧洲生物化学杂志]165：99-106；和wo98/20122)和高蛋氨酸蛋白(pedersen等人(1986)j.biol.chem.[生物化学杂志]261：6279；kirihara等人(1988)gene[基因]71：359；和musumura等人(1989)plantmol.biol.[植物分子生物学]12：123))；增加的消化性(例如，经修饰的储存蛋白(2001年11月7日提交的美国申请序列号10/053,410)；和硫氧还蛋白(2001年12月3日提交的美国申请序列号10/005,429))。披露的多核苷酸也可以与疾病或除草剂抗性所期望的性状堆叠(例如，伏马菌素解毒基因(美国专利号5,792,931)；无毒性和抗病基因(jones等人(1994)science[科学]266：789；martin等人(1993)science[科学]262：1432；mindrinos等人(1994)cell[细胞]78：1089)；引起除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(als)突变体，如s4和/或hra突变；谷氨酰胺合酶抑制剂如草丁膦或巴斯塔(例如，bar基因)；和草甘膦抗性(epsps基因))；和加工或加工产品所需的特性，例如高油(例如，美国专利号6,232,529)；经修饰的油(例如，脂肪酸去饱和酶基因(美国专利号5,952,544；wo94/11516))；经修饰的淀粉(例如，adpg焦磷酸酶(agp酶)、淀粉合成酶(ss)、淀粉分支酶(sbe)和淀粉脱支酶(sdbe))；和聚合物或生物塑料(例如，美国专利号5.602,321)；β-酮硫解酶、聚羟基丁酸合酶和乙酰乙酰辅酶a还原酶(schubert等人(1988)j.bacteriol.[细菌学杂志]170：5837-5847)促进聚羟基链烷酸酯(pha)的表达)；以上文献的公开内容通过引用并入本文。还可以将多核苷酸与提供农艺性状(例如，雄性不育(例如，参见美国专利号5.583,210)、茎秆强度、抗旱性(例如美国专利号7,786,353)、开花时间)或转化技术性状(如细胞周期调节或基因靶向(例如，wo99/61619、wo00/17364和wo99/25821))的多核苷酸组合。这些堆叠的组合可以通过如下任何方法产生，该方法包括但不限于，通过任何常规的或topcross方法学进行杂交育种或遗传转化。如果通过对植物进行遗传转化来堆叠这些序列(即分子堆叠物)，则可以在任何时间和以任何顺序组合这些目的多核苷酸序列。例如，可以使用包含一种或多种所需性状的转基因植物作为靶标，以通过随后的转化来引入另外的性状。可以用共转化方案将这些性状与转化盒的任何组合所提供的目的多核苷酸一起引入。例如，如果要引入两个序列，则这两个序列可以包含在单独的转化盒(反式)中或包含在相同的转化盒(顺式)中。这些序列的表达可以由相同的启动子或不同的启动子驱动。在某些情况下，引入将抑制目的多核苷酸的表达的转化盒是可取的。这可以与其他抑制盒或过表达盒的任何组合进行组合以在植物中产生期望的性状组合。进一步认识到，可以使用位点特异性重组系统将多核苷酸序列堆叠在期望的基因组位置上。参见例如wo99/25821、wo99/25854、wo99/25840、wo99/25855和wo99/25853。x.昆虫抗性治理方法本文中披露的方法包括用于防治如下植物昆虫有害生物(例如昆虫抗性治理)的方法：例如鞘翅目、半翅目或鳞翅目植物有害生物，包括叶甲属、瘦跗叶甲属、条跳甲属、无网蚜属、小粉虱属、茶翅蝽属、稻绿蝽属或灰翅夜蛾属植物有害生物。昆虫抗性治理(irm)是用来描述旨在减少昆虫有害生物变得对杀有害生物剂具有抗性的潜力的实践的术语。bt(或其他杀有害生物蛋白，化学的或生物学的)irm的维护是非常重要的，因为昆虫抗性对将来使用研植物并入保护剂和bt技术整体而言构成威胁。特定的irm策略，例如高剂量/结构化庇护所策略，延迟对玉米、棉花和马铃薯中产生的特异性bt蛋白的昆虫抗性。然而，为了确保非抗性昆虫发育并可用于与在受保护作物中产生的任何抗性有害生物交配，这样的策略导致作物的一部分容易受到一种或多种有害生物的侵害。因此，从农民/生产者的角度来看，非常希望拥有尽可能小的庇护所，但仍然能够治理昆虫抗性，从而获得最大的产量，同时仍然保持所用的有害生物防治方法(无论是bt、化学、一些其他方法、或其组合)的功效。通常使用的irm策略是种植庇护所(使用非bt/杀有害生物性状种子的总面积的一部分)，因为通常认为这将通过保持昆虫易感性来延迟昆虫对杀有害生物特性的抗性的发展。用于延迟抗性的庇护所策略的理论基础取决于如下假设：昆虫抗性的频率和隐性与有害生物易感性成反比；只有当有害生物对毒素非常敏感时，抗性才是罕见且隐性的，并且反之，当有害生物不是非常敏感时，抗性会更加频繁且隐性也更小。此外，该策略假定对bt的抗性是隐性的并且由具有两个等位基因的单一基因座赋予，所述两个等位基因产生三种基因型：易感纯合体(ss)、杂合体(rs)和抗性纯合体(rr)。还假定初始抗性等位基因频率较低，并且抗性成虫和易感成虫之间会有大量的随机交配。在理想的情况下，只有罕见的rr个体将幸免于作物产生的杀有害生物毒素。ss个体和rs个体均易受到杀有害生物毒素的影响。结构化庇护所是种植者的田地或一组田地的非bt/杀有害生物性状部分，其提供可能随机与幸免于所述杀有害生物特性作物(可能是bt性状作物)的罕见抗性(rr)昆虫交配的易感(ss)昆虫的产生，以产生将被所述bt/杀有害生物性状作物杀死的易感rs杂合子。整合的庇护所是种植者的田地或一组田地的随机种植的非bt/杀有害生物性状部分的某些部分，其提供可能随机与幸免于所述杀有害生物特性作物的罕见抗性(rr)昆虫交配的易感(ss)昆虫的产生，以产生将被所述杀有害生物性状作物杀死的易感rs杂合子。每个庇护所策略将从昆虫群体中移除抗性(r)等位基因并延迟抗性的演变。减少对庇护所的需求的另一个策略是对具有针对靶标昆虫有害生物的不同作用模式的性状进行聚合。例如，具有堆叠在一个转基因植物中的不同作用模式的bt毒素对庇护所的需求降低。堆叠组合中不同的作用模式也保持了每种性状的持久性，因为抗性发展到每种性状的速度较慢。目前，庇护所的规模、安置和管理通常被认为是减轻昆虫对玉米、棉花、大豆和其他作物中产生的bt/杀有害生物性状的抗性的庇护所策略成功的关键。由于庇护所种植区的产量下降，一些农民选择避开庇护所需求，而其他农民则不遵循规模和/或安置要求。这些问题导致没有庇护所或庇护所效果不佳，而且抗性有害生物发展的风险也相应增加。因此，仍然需要用于治理一片有害生物抗性作物植物中的有害生物抗性的方法。提供用于保护植物，特别是玉米或其他作物植物免受有害生物的取食损害的改良方法是有用的。如果这种方法会降低对传统化学杀有害生物剂所需的施用率，并且还将限制作物种植和栽培所需的单独田间作业的数量，这将是特别有用的。另外，具有部署转基因庇护所的方法将是有用的，该方法消除了上述关于依从性的、淡化或消除许多抗性治理策略的功效的问题。一个实施例涉及减少抗性有害生物发展的方法，该方法包括向植物提供植物保护组合物(bt毒素、转基因杀昆虫蛋白、其他杀昆虫蛋白、化学杀昆虫剂、杀昆虫生物学昆虫病原体等)，以及使该植物有害生物与沉默元件(即，属于靶向如seqidnos.：1-53或107-254中所示的一个或多个多核苷酸的沉默元件)接触，其中所述沉默元件(即，属于靶向如seqidnos.：1-53或107-254中所示的一个或多个多核苷酸的沉默元件)使靶标有害生物中的序列中的一个或多个的表达减少，并通过昆虫不育化或sit来防治所述有害生物和有害生物群体。另外的实施例涉及增加植物有害生物组合物的持久性的方法，该方法包括向植物提供植物保护组合物(bt毒素、转基因杀昆虫蛋白、其他杀昆虫蛋白、化学杀昆虫剂、杀昆虫生物学昆虫病原体等)，以及使该植物有害生物与不育化沉默元件(即，属于如seqidno.：1-53或107-254中所示一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如seqidno.：1-53或107-254中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸的沉默元件)接触，使靶标有害生物中的序列中的一个或多个的表达减少，并通过昆虫不育化或昆虫不育技术来防治所述有害生物和有害生物群体。在另一个实施例中，作为条、块种植或与所述性状种子整合的所述庇护所包含进一步包含不育化沉默元件(例如，靶向如seqidno.：1-53或107-254中所示一个或多个多核苷酸的沉默元件)的植物。在仍另外的实施例中，可以通过施加到非庇护所植物的不育化沉默元件的存在而减少或消除所需的庇护所。在另一个实施例中，所述庇护所或非庇护所可以包括作为喷雾剂、诱饵、引诱物，或者作为不同的转基因植物的沉默元件，即，属于如seqidno.：1-53或107-254中所示一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如seqidno.：1-53或107-254中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸的沉默元件。在另外的实施例中，向有害昆虫饲喂如下饲料，该饲料包含如seqidno.：1-53或107-254中所示一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如seqidno.：1-53或107-254中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸的沉默元件，并且所述昆虫在饲喂后第1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天被释放到植物上。在仍另外的实施例中，所述有害昆虫是雌性有害昆虫。在又另外的实施例中，所述有害昆虫是有害昆虫，并且在幼虫或成虫阶段饲喂所述有害昆虫。昆虫不育化可能由雄性或雌性不育，不育昆虫的交配，精子量、产卵量或卵生活力降低导致。在某些实施例中，本文披露的通过rnai技术靶向不育基因并将编码本文披露的沉默元件的多核苷酸与杀昆虫蛋白堆叠在转基因植物中的组合物和方法，可以提供对鞘翅目的有效防治并且可能延长鞘翅目杀昆虫性状的持久性。延长的持久性可能是最小化从鞘翅目甲虫传播抗性等位基因的结果，所述鞘翅目甲虫当以表达本文披露的一种或多种杀昆虫蛋白和rnai不育性状的堆叠的转基因根为食时能够完成其发育生命周期。目前的irm策略需要高剂量的bt毒素以便使昆虫抗性发展最小化。由于植物毒性，可能难以达到所需的高剂量。借助不同的昆虫防治手段进行有害生物综合治理(ipm)可用于延迟暴露于次最优剂量的蛋白毒素(例如bt毒素)的昆虫抗性。可以将rnai介导的sit作为ipm策略的一部分进行部署。如本文所使用的，术语“杀有害生物的”用于指针对有害生物(例如crw)的毒性作用，并且包括外部供应的杀有害生物剂和/或由作物植物产生的试剂中的任一者或两者的活性。如本文所使用的，术语“不同的杀有害生物作用模式”包括一种或多种抗性性状的杀有害生物效果，其中无论是通过转化或传统育种方法，例如将由所述作物植物产生的杀有害生物毒素与玉米根虫的肠膜中不同的结合位点(即不同的毒素受体和/或同一毒素受体上的不同位点)结合或通过rna干扰，将所述抗性性状引入所述作物植物中。xi.施用方法在一个实施例中，可以将如seqidno.：1-53或107-254中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如seqidno.：1-53或107-254中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物直接施用于种子。例如，在本文披露的组合物和方法中使用的如seqidno.：1-53或107-254中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如seqidno.：1-53或107-254中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件可以在没有附加组分和不进行稀释的情况下施用。在一个实施例中，喷雾剂、诱饵、引诱物、引诱剂和种子处理可以包含如seqidno.：1-53或107-254中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如seqidno.：1-53或107-254中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物。在另一个实施例中，将如seqidno.：1-53或107-254中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如seqidno.：1-53或107-254中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物以合适的制剂形式施用于种子。用于处理种子的合适的制剂和方法是本领域技术人员已知的并且例如描述于以下文献中：us4,272,417a、us4,245,432a、us4,808,430a、us5,876,739a、us2003/0176428a1、wo2002/080675a1、wo2002/028186a2。可以将如seqidno.：1-53或107-254中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如seqidno.：1-53或107-254中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物转化为常规的拌种制剂(例如溶液、乳剂、悬浮剂、粉剂、泡沫剂、浆剂或其他种子包衣材料)和ulv制剂。以已知的方式，通过将如seqidno.：1-53或107-254中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如seqidno.：1-53或107-254中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物与常规添加剂(例如，常规增充剂以及溶剂或稀释剂、着色剂、润湿剂、分散剂、乳化剂、消泡剂、防腐剂、二次增稠剂、粘合剂、赤霉素和水)混合来制备这些制剂。在另一个实施例中，可能存在于拌种制剂中的合适的着色剂包括常用于此类目的的所有着色剂。可以使用在水中溶解性很低的颜料和可溶于水的染料二者。可以提及的实例包括名称为罗丹明b(rhodamineb)、c.i.颜料红112(c.i.pigmentred112)、和c.i.溶剂红1(c.i.solventred1)的已知着色剂。在另一个实施例中，可存在于所述拌种制剂中的合适的润湿剂包括促进润湿且常用于活性农用化学物质的制剂中的所有物质。优选地，有可能使用烷基萘磺酸盐，如二异丙基萘磺酸盐或二异丁基萘磺酸盐。在仍另一个实施例中，可存在于所述拌种制剂中的合适的分散剂和/或乳化剂包括常用与活性农用化学物质的制剂中的所有非离子、阴离子和阳离子分散剂。在一个实施例中，可以使用非离子或阴离子分散剂或者非离子或阴离子分散剂的混合物。在一个实施例中，非离子分散剂包括但不限于环氧乙烷-环氧丙烷嵌段聚合物、烷基酚聚乙二醇醚和三苯乙烯苯酚聚乙二醇醚，以及它们的磷酸化或硫酸化衍生物。在仍另一个实施例中，可以存在于根据本发明使用的拌种制剂中的消泡剂包括常用于具有农用化学活性的化合物的制剂中的所有泡沫抑制性化合物，但不限于硅酮消泡剂、硬脂酸镁、硅酮乳剂、长链醇、脂肪酸及其盐，以及有机氟化合物及其混合物。在仍另一个实施例中，可存在于所述拌种制剂中的二次增稠剂包括可用于农业化学组合物中的此类目的的所有化合物，包括但不限于纤维素衍生物、丙烯酸衍生物、多糖类(例如黄原胶或硅酸铝镁(veegum))、改性粘土、层状硅酸盐(如绿坡缕石和膨润土)、以及精细分散的硅酸。可存在于待根据本发明使用的拌种制剂中的合适的粘合剂包括可用于拌种的所有常规粘合剂。聚乙烯吡咯烷酮、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇和侵填体(tylose)可以作为优选的被提及。在另一个实施例中，如seqidno.：1-53或107-254中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、或者包含如seqidno.：1-53或107-254中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物在第一次施用步骤中施用于土壤、在第二次施用中施用于种子、并且在第三次施用中施用于植物的叶面区域。如本文所使用的，将如seqidno.：1-53或107-254中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如seqidno.：1-53或107-254中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物施用于种子、植物、或植物部分包括将所述种子、植物、或植物部分直接和/或间接与所述如seqidno.：1-53或107-254中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如seqidno.：1-53或107-254中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物接触。在一个实施例中，如seqidno.：1-53或107-254中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如seqidno.：1-53或107-254中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物可以直接作为喷雾剂、冲洗剂(rinse)或粉剂，或其任何组合来施用。在另一个方面，如seqidno.：1-53或107-254中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如seqidno.：1-53或107-254中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物可以作为粉剂直接施用于植物或植物部分。如本文所使用的，粉剂是由大量非常细的颗粒组成的干燥或接近干燥的散装固体，其在振动或倾斜时可自由流动。本文披露的干燥或接近干燥的粉末组合物优选地含有低百分比的水，例如在各个方面，小于按重量计的5％、小于2.5％、或小于1％。在另外的实施例中，可以通过本领域技术人员已知的转化技术将如seqidno.：1-53或107-254中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如seqidno.：1-53或107-254中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物导入细菌、酵母或真菌中，并将所述经转化的细菌、酵母或真菌施用于植物、该植物正在生长的土壤、水培介质、种子或按照如上文所述的前述施用方法中的任一种所施用的任何一项。在一个实施例中，可通过封装技术来配制如seqidno.：1-53或107-254中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如seqidno.：1-53或107-254中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物，以提高稳定性。在一个实施例中，所述封装技术可以包含随时间推移定时释放的珠状聚合物。在一个实施例中，可以将所述封装的如seqidno.：1-53或107-254中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如seqidno.：1-53或107-254中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物以沿犁沟单独施用珠的方式施用于种子。在另一个实施例中，可以将所述封装的如seqidno.：1-53或107-254中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如seqidno.：1-53或107-254中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物与种子同时共同施用。可用于包封实施例的缓释微粒的包衣剂可以是用于用其上待负载的物质对该微粒形式进行包衣的物质。一般可以使用能够形成所述负载物质难以透过的包衣的包衣剂，而没有任何特别的限制。例如，可以使用饱和度更高的脂肪酸、蜡、热塑性树脂、热固性树脂等。有用的饱和度更高的脂肪酸的实例包括硬脂酸、硬脂酸锌、硬脂酸酰胺和亚乙基双硬脂酸酰胺；蜡的实例包括合成蜡，如聚乙烯蜡、碳蜡、赫斯特(hoechst)蜡和脂肪酸酯；天然蜡，如巴西棕榈蜡、蜂蜡和日本蜡；以及石油蜡，如固体石蜡和凡士林。热塑性树脂的实例包括聚烯烃，例如聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯和聚异丁烯；乙烯基聚合物，例如聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯；二烯聚合物，例如丁二烯聚合物、异戊二烯聚合物、氯丁二烯聚合物、丁二烯-苯乙烯共聚物、乙烯-丙烯-二烯共聚物、苯乙烯-异戊二烯共聚物、mma-丁二烯共聚物和丙烯腈-丁二烯共聚物；聚烯烃共聚物，例如乙烯-丙烯共聚物、丁烯-乙烯共聚物、丁烯-丙烯共聚物、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、乙烯-丙烯酸共聚物、苯乙烯-丙烯酸共聚物、乙烯-甲基丙烯酸共聚物、乙烯-甲基丙烯酸酯共聚物、乙烯-一氧化碳共聚物、乙烯-乙酸乙烯酯-一氧化碳共聚物、乙烯-乙酸乙烯酯-氯乙烯共聚物和乙烯-乙酸乙烯酯-丙烯酸共聚物；以及氯乙烯共聚物，例如氯乙烯-乙酸乙烯酯共聚物和偏二氯乙烯-氯乙烯共聚物。热固性树脂的实例包括聚氨酯树脂、环氧树脂、醇酸树脂、不饱和聚酯树脂、酚醛树脂、脲-三聚氰胺树脂、尿素树脂和硅酮树脂。在以上各项中，优选的是热塑性丙烯酸酯树脂、丁二烯苯乙烯共聚物树脂、热固性聚氨酯树脂和环氧树脂，并且在所述优选的树脂中，特别优选的是热固性聚氨酯树脂。这些包衣剂可以单独使用或者两种或更多种组合使用。在一个实施例中，可以将如seqidno.：1-53或107-254中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如seqidno.：1-53或107-254中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物配制成进一步包含昆虫病原体。在一个实施例中，本公开的方法和组合物涉及如下组合物，该组合物包含如seqidno.：1-53或107-254中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如seqidno.：1-53或107-254中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物和一种或多种生物防治剂。如本文所使用的，术语“生物防治剂”(“bca”)包括一种或多种细菌、真菌或酵母，原生动物，病毒，昆虫病原线虫和植物提取物，或由微生物产生的产物(包括蛋白质或次级代谢产物)，以及具有以下特征中的一种或两种的接种剂(innoculant)：(1)抑制或减少病原体、有害生物或昆虫(包括但不限于致病性真菌、细菌和线虫)以及节肢动物有害生物(如昆虫、蜘蛛纲动物、蜈蚣、双足动物)的植物侵染和/或生长，或者抑制植物病原体、有害生物或昆虫的组合的植物侵染和/或生长；(2)提高植物性能；(3)提高植物产量；(4)提高植物活力；以及(5)提高植物健康。xii.使用cas/crispr敲除靶基因在一个实施例中，可以使用基因组编辑技术将如seqidno.：1-53或107-254中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如seqidno.：1-53或107-254中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸的沉默元件、以及包含所述序列的组合物引入到植物的基因组中，或者可以使用基因组编辑技术对先前导入的编码植物基因组中本文披露的沉默元件的多核苷酸进行编辑。例如，可以通过使用双链断裂技术(如talen、大范围核酸酶、锌指核酸酶、crispr-cas等)将披露的多核苷酸引入植物基因组中期望的位置上。例如，为了位点特异性插入的目的，可以使用crispr-cas系统将所披露的多核苷酸引入基因组中期望的位置上。植物基因组中期望的位置可以是任何对于插入来说期望的靶标位点，例如适于育种的基因组区域，或者可以是位于具有现有的目的性状的基因组窗口中的靶标位点。现有的目的性状可能是内生性状或先前引入的性状。在另一个方面，在所披露的编码沉默元件的多核苷酸先前已经被引入到基因组中的情况下，可以使用基因组编辑技术来改变或修饰引入的多核苷酸序列。可以引入披露的编码沉默元件组合物的多核苷酸中的位点特异性修饰包括使用用于引入位点特异性修饰的任何方法产生的修饰，该方法包括但不限于通过使用基因修复寡核苷酸(例如美国公开2013/0019349)，或通过使用双链断裂技术，如talen、大范围核酸酶、锌指核酸酶、crispr-cas等。此类技术可用于通过在引入的多核苷酸内的核苷酸的插入、缺失或取代来修饰先前引入的多核苷酸。可替代地，可以使用双链断裂技术向引入的多核苷酸中添加另外的核苷酸序列。可以添加的另外的序列包括另外的表达元件(例如增强子序列和启动子序列)。在另一个实施例中，可以使用基因组编辑技术在植物基因组内定位紧邻本文披露的多核苷酸组合物的另外的杀昆虫活性蛋白，以产生杀昆虫活性蛋白质的分子堆叠物。“改变的靶标位点”、“改变的靶标序列”、“修饰的靶标位点”、和“修饰的靶标序列”在本文中可互换地使用，并且意指如本文披露的靶标序列，当与非改变的靶标序列相比时，该靶标序列包括至少一种改变。例如，此类“改变”包括：(i)至少一个核苷酸的替代、(ii)至少一个核苷酸的缺失、(iii)至少一个核苷酸的插入、或(iv)(i)-(iii)的任意组合。在一个实施例中，这些方法包括产生昆虫或其群落，其中编码靶基因，这样使得其不再起作用，从而产生不育昆虫。靶基因的多核苷酸序列可以用于通过本领域技术人员已知的手段来敲除昆虫中的靶基因多核苷酸，这些手段包括但不限于talen、大范围核酸酶、锌指核酸酶、crispr-cas等。参见ma等人(2014)，scientificreports[科学报告]，4：4489；daimon等人(2013)，development，growth，anddifferentiation[发育，生长和分化]，56(1)：14-25；以及eggleston等人(2001)bmcgenetics[bmc遗传学]，2：11。一个实施例包含具有如seqidno.：1-53中所示的一种或多种多核苷酸中的经编辑的多核苷酸的昆虫，其中所述编辑使非功能性多肽的表达降低并且通过昆虫不育化和昆虫不育技术来防治有害生物和有害生物群体。本说明书中提到的所有出版物和专利申请都表明本发明所属领域的技术人员的水平。将所有出版物和专利申请通过引用并入本文，其程度就像明确且个别指出通过引用将每一篇个别出版物或专利申请并入一样。虽然为了清楚理解的目的，已经通过说明和实例的方式对前述实施例进行了详细描述，但是在所附权利要求的范围内可以实施某些改变和修改。以下实例是通过说明的方式但不是通过限制的方式来提供的。实验实例1：核酸序列。本文披露的核酸序列包含以下核酸序列。某些序列是示例性的，并且使用如下所示实例2、3和6中所述的测定方法显示出其对玉米根虫具有昆虫不育化活性。此类序列或其互补序列可以用于本文上述和下述的方法中。用于制备抑制性序列的方法是本领域已知的。本文所述的dna构建体、载体、转基因细胞、植物、种子或产物可以包含一种或多种以下核酸或氨基酸序列，或者一种或多种本披露的的序列中的一部分。靶标多核苷酸、或者其变体和片段、及其互补序列的非限制性实例列于下表1中，包括例如seqidno.：1-53或107-254、及其变体和片段、及其互补序列。本文所提及的序列(seqidno.：1-53和107-254)表包括在下文中。表1：vgrrnai靶标片段。*“转录物”表示该序列是全长mrna转录物序列。**“orf”表示该序列对应于可读框序列。实例2：通过vgrdsrna使西方玉米根虫(wcrw)成虫不育化。使用改进的方案来制备wcrw成虫的人工饲料(rangasamym等人，(2012).pestmanag.sci.[有害生物管理科学]68(4)：587-91；和nowatzkitm等人，(2006)jecon.entomol.[经济昆虫学期刊]99(3)：927-30)。设计改进的饲料用于下文所述的饲料并入生物测定法(25μl测试样品：75μl制备的饲料)中，并使用标准96孔微量滴定板进行生产。wcrw成虫在24小时内消耗了大部分的饲料，并且在2-3周的研究期间，对照死亡率仍然＜15％。对于本文描述的所有生物测定，将wcrw生命阶段(成虫和幼虫)保持在标准条件下，例如，jackson，j.j.(1986)，第25-48页，krysanj.l.和millert.a.(编辑)：methodsforthestudyofpestdiabrotica.springer-verlag，newyork.[有害生物叶甲的研究方法，施普林格出版社，纽约]第260页，以及branson，t.f.等人，(1988)，j.econ.entomal.[经济昆虫学杂志]81(1)：410-414(1988)。将来自同一批次的甲虫分为两组。第一个试验组由雄性和＜10天龄(2-5天龄)的雌性(以下简称“幼龄雌性”)组成。幼龄雌性处于其产卵前期(第一次产卵前的时期)。第二组由＞11天龄并经交配的雌性(以下简称“老龄雌性”)组成，并且它们处于产卵期(雌性准备好产卵)。对于幼龄雌性组，100只甲虫(50只雌性和50只雄性)，和对于老龄雌性组，50只交配的雌性，被安排用于每种处理。比较以下三种处理：1)无菌di水(对照)；2)gfpdsrna(阴性对照，基因库登录号ay233272.1；本文中的seqidno：104)；和3)vgrdsrna片段2(seqidno：4)。使用饲料结合方法进行生物测定。分别制备gfpdsrna和vgrdsrna的测试样品，并在96孔微量滴定板每孔中将25μl各自的样品并入75μl改进的wcrw成虫人工饲料中，以得到终浓度为100ppm。对于对照，每孔中将25μl无菌di水并入75μl改进的wcrw成虫人工饲料中。使用具有单一饲料丸(25μl测试样品和75μl改进的wcrw成虫人工饲料的混合物)的32细胞托盘(c-d国际公司，皮特曼，新泽西州)的单个孔限制对单个wcrw甲虫成虫的作用，持续24小时。24小时后，收集经处理的成虫，计数并转移到其各自的笼子中，并且提供标准的scrw干成虫饲料和水源直到研究期结束(22天至25天)。从老龄雌性组和幼龄雌性组分别暴露后24小时或7天开始每天收集wcrw卵，持续13天至14天。用产卵盘收集卵。在加工前，将收集的卵在具有受控的照明/黑暗循环(16小时光照：8小时黑暗)的热量和湿度受控的生长室(25℃，65％±5％相对湿度(rh))中孵育12天至14天。根据给定天数获得的卵的数量，将几个小的等分的卵-琼脂悬浮液分配到孵化板(含有2％水琼脂和两层滤纸的培养皿)上进行计数和/或孵化试验。对于所述卵孵化试验，将每个含有25μl的卵-琼脂悬浮液的样品(1-6)分配到如上所述的孵化板上，并用微孔胶带固定盖子以避免幼虫逃走。在孵育之前计数每个25μl样品中的总卵数。然后将卵孵化板在具有受控的照明/黑暗循环(16小时光照：8小时黑暗)的热量和湿度受控的生长室(25℃，65％±5％rh)中孵育三天。通过计算显示幼虫羽化孔的卵的数量，在三天期间计数卵孵化。对于每种处理，分别在老龄雌性组和幼龄雌性组暴露后的第4天和第8天，抽样4只经处理的雌性和雄性甲虫(幼龄雌性组)和4只雌性(老龄雌性组)检测基因抑制。对于dsrna体外转录物(“ivt”)产生，使用靶标特异性正向和反向引物(参见下表2)(在每个引物的5′末端具有t7启动子序列)进行pcr。使用ambionmegascript高产量转录试剂盒(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific)，格兰德岛，纽约)从pcr模板产生dsrna样品。运行琼脂糖凝胶以检查产量和产物大小。对于实时qrtpcr测定，使用mirvanamirna分离试剂盒提取总rna，用turbodnase试剂盒进行处理，根据制造商的说明书通过iii一步qrt-pcr试剂盒和rox进行测定(赛默飞世尔科技公司)。使用wcrwrps10作为参考(即本文中分别为us2011/0054007中的seqidno：8；还有seqidno：102和103、orf以及转录物)，通过deltadeltact方法得出相对表达(livak，k.j.和t.d.schmittgen(2001).methods[方法]25(4)：402-408)。表2：引物序列ivt的产生。使用这些方法获得的数据显示在图1a-1d中。具体而言，图1a示出了在13-14天内由处理组和年龄组产生的卵的总数。在图1a中所示的实验中，幼龄雌性组包含50对雄性和雌性甲虫，而老龄雌性组包含50只交配的雌性甲虫。图1a中的数据显示摄取vgrdsrna显著减少了测试期间产生的卵的总数。图1b显示了在13-14天产卵期期间，由处理组和年龄组每只雌性/天产生的卵的平均数量。该箱线图显示了4个四分位数、平均值、和平均数的95％置信区间。数据显示，在幼龄和老龄雌性中，摄取vgrdsrna减少了每天产生的卵的平均数量。图1c显示了各种处理对整体平均卵孵化率的影响。数据代表13-14天的卵收集期；n＝6个重复/处理/天；5-45个卵/重复，取决于天数(p＜0.001)。基因抑制分析如图1d所示，用于在处理幼龄组雌性和雄性昆虫后8天和处理老龄组雌性昆虫后4天在wcrw甲虫成虫上进行的分析。使用wcrwrps10基因作为参照和未处理的老龄甲虫作为正规化子，从每种处理的4只单个昆虫中显示vgr的相对表达。该箱线图显示了处理组和年龄组的4个四分位数、平均值、中值和平均数的95％置信区间。实例3：通过用vgrdsrna处理3龄幼虫使wcrw不育化。评估通过vgrdsrna(vgrdsrna片段2)处理幼虫对wcrw不育化的效果。使用从玉米垫收获并在标准wcrw幼虫饲料中适应24小时的3龄幼虫进行研究。使用上述饲料结合方法(25μldsrna和75μl人工wcrw幼虫饲料)，将大约192只幼虫暴露于水和75ppmvgrdsrna片段2(seqidno.：4)持续1天。将经处理的幼虫置于蛹化介质中15天。收集羽化的成虫，计数并转移到其各自的笼子中，并且提供具有水源的标准scrw干成虫饲料直到研究期结束(22天-25天)。将甲虫笼子保持在室温(通常从22℃至25℃)，没有rh控制。没有刻意的光照/黑暗控制，但笼子获得大致16：8黑暗和光照的条件。甲虫笼子每周清洁维修两次，并且每次这些甲虫收到新的食物和水琼脂。甲虫成虫喂养总共26天。每个笼子在10天产卵前期后收到产卵盘，并且在16天的产卵期时间内收集卵，并按照上述方法进行处理。这个研究的代表性数据示于图2a和2b中。图2a中示出了每只雌性产卵的平均总数和每只雌性产生的有活力卵的平均数量。对每个指定的处理计数来自15至42只雌性甲虫成虫的卵。该箱线图显示了针对每种处理的4个四分位数、平均值、中值和平均数的95％置信区间。数据显示，对于暴露于vgrdsrna的组，在整个研究期间有活力的卵的产量一直非常低。应该指出的是，用vgrdsrna处理不影响成虫羽化，并且vgrdsrna组中甲虫成虫的死亡率可以忽略不计。vgr基因抑制分析的代表性数据示于图2b中。获得的数据针对10日龄(n＝4)和28日龄(n＝15)甲虫，分别代表处理3龄幼虫后的第40天和第58天。通过qrtpcr的相对表达的箱线图显示了在10天龄和28天龄甲虫中针对每种处理的4个四分位数、平均值、中值和平均数的95％置信区间。将数据标准化为未经处理的3龄幼虫。数据显示在两个年龄组中vgr的相对表达降低。实例4：通过vgrdsrna处理，wcrw不育化和基因抑制的剂量响应。在幼龄和老龄成虫雌性中测定dsrna处理的剂量响应效应。收集较年长雌性组(＞11天龄)，并使用上述饲料结合方法将其暴露于vgrdsrna。将处理组暴露24小时。vgrdsrna与seqidno：3互补，并且测试的浓度如下：0、0.01ppm、0.1ppm、1ppm、10ppm和75ppm。处理组由每个剂量水平约40只至48只雌性组成。暴露后24小时开始评估产卵量并持续18天。对于每种处理，用于产卵的雌性甲虫总数范围为40只至48只(第1天-第6天)和20只至28只(第7天-第18天)。按照上述方法处理和加工卵。暴露6天后，从每种处理中取回20只经处理的雌性，并用于基因抑制分析。针对每个剂量处理组的细节(例如分析的总卵数、有活力的卵的数量、以及产卵力的净下降)在图3a中给出。收集卵并在18天的产卵期时间内进行计数。使用以下公式估算vgrdsrna处理的雌性相对于对照(暴露于水的雌性)的产卵力的净降低(nrf)：nrf(％)＝[1-(nvet/nvewc)]*100，其中“nrf”代表产卵力净降低百分比；“nvet”代表处理组中有活力卵的数量；和“nvewc”代表水(对照)处理组中有活力卵的数量。数据显示暴露于vgrdsrna10天后产卵量显著降低(见图3a中的卵/雌性，第10天-第18天)。数据进一步表明，产卵量和卵生活力与vgrdsrna剂量呈负相关。产卵力的净降低与增加的vgrdsrna剂量呈正相关。图3b显示了针对18天的采卵期；n＝1-4个重复/处理/天；5-478个卵/重复(取决于天数和卵的可用性)根据剂量的整体卵孵化率的百分比的箱线图。图3c中的数据显示，以不同剂量的vgrdsrna处理后第6天，vgr相对表达的箱线图。图3c中的数据显示了增加剂量与vgr表达的较大降低之间的相关性。将处理组数据标准化为未处理甲虫的表达。实例5：vgr片段的基因抑制分析。评估了五种不同的vgrdsrna靶标片段的作用。图4a示意性地显示了与seqidno：2比对的测试的不同片段的相对位置。测试的靶标片段如下：frag1是vgr片段1(seqidno：3)；frag2是vgr片段2(seqidno：4)；frag3是vgr片段3(seqidno：5)；frag4是vgr片段4(seqidno：6)；以及frag5是vgr片段5(seqidno：7)。使用上述饲料结合方法和在饲料活塞中具有100ppm的vgrdsrna的wcrw雌性甲虫测试每个vgrdsrna片段。将这些甲虫单独处理一天，并用不含dsrna的标准饲料再饲喂六天。然后收集单个甲虫并在液氮中快速冷冻。对于qrtpcr测定，使用下表3中指示的引物序列，针对每个处理组使用至少3只昆虫。图4b显示了，使用5′qrtpcr测定，用所指示的dsvgr片段或对照处理(即，如所示，ddh2o和dsgus(本文中的seqidno：105))替代饲料中的vgrdsrna)处理后第6天的相对vgr表达的箱线图。该箱线图显示了四个四分位数、平均值(水平实线)、中值(水平虚线)和平均数的95％置信区间。用mid-和3′-qrtpcr测定也得到类似的结果。将处理组中的数据标准化为从来自未处理的3龄幼虫的qrtpcr获得的数据。表3：引物序列基因抑制分析。实例6：通过基因抑制分析进行wcrwvgr片段筛选。评估覆盖整个seqidno：2的编码dna序列的另外的vgrdsrna片段抑制vgr表达的能力。图5a显示了与seqidno：2比对的测试的片段，并且各种序列名称对应于表1所示的片段id。使用上述饲料结合方法和在饲料活塞中具有100ppm的vgrdsrna的wcrw雌性甲虫测试每个vgrdsrna片段。将这些甲虫单独处理一天，并用不含dsrna的标准饲料再饲喂六天。然后收集单个甲虫并在液氮中快速冷冻。对于qrtpcr测定，针对每个处理组使用至少6只昆虫。图5b-5d使用5′qrtpcr测定，用所指示的dsvgr片段处理或对照处理(即，如所示，ddh2o和dsgus替代饲料中的vgrdsrna)后第6天的相对vgr表达的箱线图。将处理组中的数据标准化为从来自水处理的甲虫的qrtpcr获得的数据。使用两种qrtpcr测定(5′-和mid-qrtpcr测定)来避免vgr片段和pcr扩增子的重叠。实例7：农杆菌介导的玉米的转化对于用本发明的沉默元件对玉米进行的农杆菌介导的转化，采用了zhao的方法(美国专利号5,981,840，和pct专利公开wo98/32326；其内容通过引用并入本文)。例如，构建体可以例如表达表1中所示的靶标序列的长双链rna。这样的构建体可以与启动子连接。简言之，从玉米中分离未成熟的胚胎，并将胚胎与农杆菌的悬浮液接触，其中该细菌能够将包含沉默元件的多核苷酸转移至这些未成熟的胚胎中的至少一个的至少一个细胞中(步骤1：侵染步骤)。在该步骤中，将未成熟胚胎浸泡在农杆菌悬液中，引发接种。使这些胚胎与农杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。在该侵染步骤之后，将这些未成熟胚胎在固体培养基上进行培养。在此共同培养期之后，设想任选的“静置”步骤。在该静置步骤中，将这些胚胎在已知抑制农杆菌生长的至少一种抗生素的存在下孵育，而不添加植物转化子的选择剂(步骤3：静置步骤)。将这些未成熟的胚胎在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并用于经侵染的细胞的静置期。接着，在含有选择剂的培养基上培养经接种的胚胎，并且回收生长的经转化的愈伤组织(步骤4：选择步骤)。在含选择剂的固体培养基上培养这些未成熟胚胎，使经转化的细胞选择性生长。然后将愈伤组织再生成植物(步骤5：再生步骤)，并将生长在选择培养基上的愈伤组织在固体培养基上培养以再生植物。实例8：wcrwvgr转基因饲喂生物测定。使用上文所述的方法产生针对vgrfrag1、frag2和frag3的转基因玉米植物，并且在成虫饲喂生物测定中用于如上所述的wcrw甲虫中的基因抑制分析。使用体外转录(ivt)产物作为对照，在叶子样品中测定植物vgr片段的表达水平。根据制造商的说明书进行表达分析(quantigene2.0测定，昂飞公司(affymetrix)，圣克拉拉，ca95051)。叶中的平均vgr片段表达水平(pgvgr片段/mg新鲜植物重量)显示在图6a和6b中的每个图下面。图6a显示了从针对非转基因对照(ntg)植物或表达所指示片段vgrfrag1(seqidno：3)、frag2(seqidno：4)和frag3(seqidno：5)的指示的转基因植物在约v4生长阶段从三个幼株获得的数据。试验植物在笼中被至少14只幼龄雌性甲虫侵染。饲喂后第8天收集甲虫并用于基因抑制分析。将数据标准化为在暴露于甲虫的ntg植物中获得的表达水平。图6b显示了使用非转基因对照植物或表达所指示vgrdsrna片段的转基因植物获得的结果。单个r1玉米植物在笼中被至少6只幼龄雌性甲虫侵染。饲喂后第12天收集甲虫用于vgr表达分析。每个片段和对照由2个用于饲喂的植物和超过12只用于基因抑制分析的昆虫代表，并且将数据标准化为从暴露于类似条件的非转基因对照植物获得的数据。实例9：wcrw成虫ver转基因暴露生物测定。将至少32对新羽化的甲虫成虫暴露于t1转基因转殖项或非转基因(ntg)对照植物的地上植物部分8天。重新收集甲虫，并且在笼子中安排至少13只-37只雌性甲虫用于每种处理，并保持15天以进行产卵力评估。转基因构建体表达vgrfrag1(seqidno：3)、frag2(seqidno：4)或frag3(seqidno：5)。对于每个构建体，测试2个至4个转殖项(图7)。每个笼子每天和/或以2天至4天的间隔接受产卵盘，并按照实例2所述的方法加工卵。实例10：wcrw幼虫vgr转基因暴露生物测定。将表达沉默元件(靶向seqidno：3、4和5)的玉米t1植物从培养板移植到含有fafardsuperfine盆栽混合土的温室平板中。将三株阳性单株植物(属于同一转殖项)移植并保持在温室(80°f，15小时光照：9小时黑暗)中并根据需要浇水。当植物达到v2叶子阶段时，用200个非滞育中的玉米根萤叶甲的卵对每个盆进行侵染。每天监测植物，以观察首次出现甲虫。在温室中以与以下文献中所述的相似的方式确定产生自每个盆的玉米根萤叶甲成虫的数量：meihls等人，(2008)pnas105：19177-19182。每隔2天或3天如实例9中那样收集从t1转基因转殖项和非转基因(ntg)对照植物羽化的甲虫成虫，并喂养15天用于产卵力评估。针对每个转殖项，安排包含至少8对至14对雄性和雌性甲虫的三个重复笼子。每个笼子每5天接受产卵盘，并按照实例2所述的方法加工卵(图8)。实例11：通过靶向boule的dsrna处理，暴露的wcrw成虫的不育化生物测定和基因抑制。通过在含有蛹化介质的50ml福尔肯(falcon)管中单独饲养3龄幼虫获得未交配过的甲虫成虫。甲虫在羽化后确定性别；饥饿24小时并使用饲料并入法暴露在100ppm的靶向boule靶基因(dv-boule-frag1，seqidno.：164)的dsrna或对照(无菌水或gusdsrna)中一天。向经处理的甲虫提供未经处理的饲料，并再单独喂养5天。在液氮中收集至少12只混合性别的甲虫用于基因抑制分析。针对每种处理安排至少14对(雄性和雌性)用于后续交配和产卵力评估。由于交配延迟，在羽化后第19天开始产卵，并评估产卵量，持续10天。如图9a所示，高剂量成虫暴露于靶向boule(bouledsrna，seqidno.：164)的dsrna不影响产卵量和卵孵化率。图9b显示了bouledsrna(seqidno：164)处理后甲虫中的基因表达。如之前的实例那样进行通过qrtpcr测定的相对表达。实例12：使幼虫暴露于表达靶向boule的dsrna的t1转基因植物，进行wcrw甲虫计数。将使用dv-boule-frag1(seqidno：164)表达靶向boule的dsrna的v2叶子阶段t1转基因转殖项的三个玉米幼苗和非转基因(ntg)对照植物在温室中每盆用200个wcr卵侵染。大约在侵染后一个月，在10天内每隔2天或3天捕获从每个盆中羽化的甲虫。显示了针对来自每个转殖项至少9个盆和10个ntg对照盆的总体和每个性别(雄性和雌性)的平均甲虫数目。该箱线图显示了四个四分位数、平均值(水平虚线)、中值(水平实线)和平均值的95％置信区间。结果表明，当与ntg植物相比时，wcrw幼虫暴露于表达dv-boulefrag1(seqidno：164)dsrna的转基因转殖项不影响成虫羽化模式(图10)。如实例8中所述使用体外转录(ivt)产物作为对照，在根部样品中测定针对每个转殖项的植物boule片段的平均表达水平。实例13：使wcrw幼虫暴露于表达靶向boule的dsrna的转基因t1植物，导致成虫不育化。将从表达dv-boule-frag1(seqidno：164)dsrna的t1转基因转殖项和非转基因(ntg)对照植物羽化的甲虫保持25天用于产卵力评估。针对每个转殖项，安排包含至少8对至14对雄性和雌性甲虫的三个重复笼子。每个笼子每5天接受产卵盘，并按照实例2所述的方法加工卵，除了卵孵化持续时间延长至8天。图11a显示了幼虫暴露于表达dv-boule-frag1(seqidno：164)dsrna的转基因植物对来自羽化的甲虫的每只雌性的平均产卵量和每只雌性产生的平均有活力的卵的影响。图11b显示了幼虫暴露于表达dv-boule-frag1(seqidno∶164)dsrna的转基因植物对从羽化的甲虫获得的卵的孵化率的影响。图11c表明了幼虫暴露于表达dv-boule-frag1(seqidno：164)dsrna的转基因植物相对于ntg对照对羽化的甲虫成虫的产卵力的净降低的影响。实例14：暴露于1ppm的靶向mael、nclb和cul3的dsrna，3龄wcrw不育化生物测定。按照实例3中所述方法，将超过400只3龄幼虫暴露于1ppm的各自的dsrna样品(dv-mael-frag1，seqidno：46；dv-nclb-frag1，seqidno：45；和dv-cul3-frag1，seqidno：44)中。将水和gus处理纳入作为实验对照。将经处理的幼虫分成四组，每组含有约95只至100只经处理的幼虫，并置于蛹化介质中15天。收集蛹化的成虫，计数并转移到其各自的笼子中，并且如实例3所述进行处理。10天的产卵期后，将每个重复笼中的甲虫数量调整到至少12对至16对(雄性和雌性)，并评估产卵力，持续15天。针对每种处理，设置至少2个至3个重复笼子。图12中示出了每只雌性产卵的平均总数、每只雌性产生的有活力卵的平均数量、平均卵孵化率、产卵量的平均下降以及产卵力的净降低(均相对于水对照)。实例15：通过以50ddm的3龄不育化生物测定进行wcrw不育基因筛选。使用3龄评估幼虫的处理对通过靶向各种目的基因(goi)的dsrna的wcrw不育化的效果。一次测试一组8个至14个dsrna样品，包括水和gus对照。使用从玉米垫收获并在标准wcrw幼虫饲料中适应24小时的10日龄3龄幼虫进行研究。使用饲料结合法用于将幼虫暴露于终浓度为50ppm的6孔板的每孔2ml中的各自的测试dsrna样品。为每个样品准备总共三个6孔板，并将约312只幼虫暴露于水或50ppm的靶dsrna片段(goi)1天(约104只幼虫/板；16只至18只幼虫/孔)。暴露后，取样约10只3龄幼虫用于基因抑制分析，并将剩余的处理的幼虫置于蛹化介质中15天。收集羽化的成虫，计数并转移到其各自的笼子中，并且提供具有水源(水琼脂)的标准scrw干成虫饲料直到研究期结束(约26天)。将甲虫笼子保持在室温(通常从22℃至25℃)；16：8黑暗和照明条件下，没有相对湿度控制。在10天的产卵前期后，对于每种处理，根据甲虫密度将雄性和雌性对的数量调整到16对至20对，并且每只笼子都接受产卵盘，并在持续15天的产卵期时间内收集卵，并且按照实例2所述的方法进行加工。在羽化后第10天和第25天，对一组三只雄性和三只雌性进行取样用于基因抑制。表4显示了针对活性wcrw基因靶标的产卵量、卵孵化以及产卵量和产卵力的降低的综合总结。第1栏表示goi(目的基因)，第2栏和第3栏分别表示在15天产卵期期间的总产卵量/雌性和总的有活力卵/雌性；第4-5栏表示累积的平均卵孵化(±sem)；第6栏和第7栏表示产卵量的平均降低(％)(±sem)；第8栏和第9栏表示产卵力的平均净降低(％)(±sem)。需要注意的是，对照(水和gus)的值是11个独立实验的累积平均值，每个实验运行持续15天的产卵期。表4通过以50ppm＊的3龄不育化生物测定进行wcrw不育基因筛选*第1栏表示goi(目的基因)，第2栏和第3栏分别表示在15天产卵期期间的总产卵量/雌性，以及总的有活力卵/雌性；第4-5栏表示累积的平均卵孵化(±sem)；第6栏和第7栏表示产卵量的平均降低(％)(±sem)；第8栏和第9栏表示产卵力的平均净降低(％)(±sem)。需要注意的是，对照(水和gus)的值是11个独立实验的累积平均值，每个实验运行持续15天的产卵期。序列表<110>先锋良种国际有限公司e.i.内穆尔杜邦公司hu,xukernodle,blissmcmahon,molliekassa,adaneniu,xipingpresnail,jameslu,albertrichtman,ninarobeson,jonathan<120>用以防治昆虫有害生物的组合物和方法<130>6030wopct<160>254<170>patentin版本3.5<210>1<211>5612<212>dna<213>玉米根虫<400>1tggtcagttcgtcctttaaaactgtgcgtgttaaactttttgaatatcttgtaaagtatg60ttaattttgttctttgtgctttcaacgttattaaatgcagtcgtttcaacgaataataat120gattgccctccacatcagtttagatgcacaaattcaaaatgtatagactttcaacaaaga180tgtgatggttccgacaattgtggagatggatcggatgaactggattgtgatcataaatgt240catgaacattttttcaattgtcgaaatggaagatgtataagcgaagcattcctgtgtgat300ggtgaaaatgattgtaataactttttggatgaaaaagactgtaagggtcaaacggtgcta360actctcgaaactgatggccattgcgaagatggtcattggaagtgtgccgataaattgtgt420attccacttgacatggtatgtaatggcgcacctgaatgtttggatggatcagatgaaact480attggatgcagtaacaagatcgtttgtgatggatttaaatgtaaaaatggccattgcata540ccaactgaatgggcttgcgacggtcttgatgattgtggtgataaaactgatgaacaagat600tgcgcaaaccacgtaccacttgatcaatgcactttggataaaagaaaattcttgtgtagt660aacaataaaacttgcatagatcttcactcggtctgtgataataagttagattgtcccgat720tattctgatgaaggaaaacagtgcaattcgtctgcaatatcatgtaacaataacaaatgt780tctcatacatgtatatcacttccaacgggtccaaaatgtctgtgtccgaatggttaccat840acgcttgatgattcgaattgtttggatattaatgaatgtacaacttatggaatttgtgac900caaaaatgtagaaatcttcctggatcatacgaatgctactgtgatgataagtacacactc960caagccgataaaaaaacatgtaaagcaactggcggaagcggaataatgatctttagttcc1020aagcaggaaattcgagctttaaccttagattctttagattattttacagtggctaaagat1080ttaaatcaagtagtgggaatagcatacgatggacatcatatttactggacagacgtattt1140actggacatgaaactatatcgaggtctattgaagatggatcggaaagggaggtattggta1200acatctggactcagtctaccagaggatctagcgtatgattggttaactggtaatatttat1260ttcaccgatgctctcaaacaacatgttggagtgtgttccaatgatggtcaccattgtaca1320gttctagtcaacaaagatattcgaaaaccacgtgggattgttgttaatgtggaagctgga1380gatatgtattggtctgattggggtgtaccagcagcaattggatattcacttatggatgga1440tcccaggacaaaccgttcgtcaccaataatatacactggcccaatggtttggctctagat1500caacctaactctagactttattggactgatgctaaaaagatgacactagaaagtattaat1560ttagacggaactgatcaaaggatcgttttggaaggaatagtgaaacatccatatgccatc1620gctgtgtttgaaaacaaactttattggtcagattgggactcccataccattcaaacttgt1680gataagtttaatggtaaaaatcatcatacactcgtggaagaacataaaaatttaatctat1740ggaatcagtatttttcactatgctctcgaaaagcgtctagtgaatccttgtgagcatgct1800tcctgtagtgacatttgtttattgaaggctcagtcatatgcttgtgcgtgcccagagaat1860aaagttttggatacggatggtcatacgtgcaaagaagtacaaccaacgcaagcacttgta1920ggaggaactggacacgtgttggtatcaattaaacatcaatttctaggcaaacacgatgta1980acattcctaccagacctggcgaaacacgtaggaagcttagcatttgatag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