用于检测和区分多种以犬为终末宿主的常见大中型绦虫的检测试剂盒的制作方法

本发明涉及寄生虫区分及检测技术领域，具体涉及用于检测和区分多种以犬为终末宿主的常见大中型绦虫的检测试剂盒。

背景技术：

寄生于畜禽的绦虫种类多、数量大，隶属于扁形动物门(Platyhelminthes)绦虫纲(Cestoidea)，其中只有圆叶目(Cyclophyllidea)和假叶目(Pseudophyllidea)绦虫对畜禽和人具有感染性。绦虫的分布极其广泛，成虫和中绦期(Metacestode)幼虫 - 绦虫蚴都能对人、畜造成严重的危害，引起严重的公共卫生问题。成虫寄生于脊椎动物，幼虫主要寄生于脊椎动物，也可寄生于无脊椎动物，如圆叶目有多种绦虫是以犬为终末宿主的。隶属于圆叶目带科的多头带绦虫 (T. multiceps,Tm)、棘球绦虫（Echinococcus）等是重要的人兽共患寄生虫，可分别引起人类或家畜的脑包虫病（cenuriasis）和肝肺包虫病（hydatid disease），对人类健康造成巨大危害，并严重阻碍畜牧业的发展。

多头带绦虫、泡状带绦虫 (T. hydatigena, Th)、豆状带绦虫 (T. pisiformis, Tp)等绦虫是常见的以犬科动物为终末宿主的大型绦虫。其中，多头带绦虫和泡状带绦虫的幼虫，即脑多头蚴和细颈囊尾蚴可寄生于人和牛、羊、猪等多种动物，豆状带绦虫的幼虫，即豆状囊尾蚴主要寄生于兔子的内脏引起豆状囊尾蚴病，这三种绦虫的成虫均寄生在犬等犬科动物的小肠内，虫卵随粪便排出，污染食物、饮水和周围环境，构成主要传染源。犬科动物通过采食含蚴的动物脏器而感染，人在误食虫卵后感染而发病。

犬复孔绦虫 （Dipylidium caninum, Dc）是犬和猫的常见寄生虫。偶可感染人体，引起复孔绦虫病。 成虫为中型绦虫，长10～15cm，宽0.3～0.4cm。成虫寄生于犬、猫的小肠内，其孕节单独或数节相连地从链体脱落，随粪便排出，并沿地面蠕动。节片破裂后虫卵散出，如被中间宿主蚤类的幼虫食入，则在其肠内孵出六钩蚴，然后钻过肠壁，进入血腔内发育。约在感染后30天，当蚤幼虫经蛹羽化为成虫时发育成似囊尾蚴。随着成蚤到终末宿主犬、猫体表活动似囊尾蚴进一步成熟。一个蚤体内的似囊尾蚴可多达56个，受染的蚤活动迟缓，甚至很快死亡。当终末宿主犬、猫舔毛时病蚤中的似囊尾蚴得以进入，然后在其小肠内释出，经2～3周，发育为成虫。人体感染常因与猫、犬接触时误食病蚤引起。犬栉首蚤、猫栉首蚤和致痒蚤是重要的中间宿主。

多种绦虫在同一地区混合分布或流行，有时也存在混合感染的情况。因此，及时、准确地检测流行区终末宿主这几种绦虫的感染情况和对感染动物进行强制驱虫，对控制绦虫病的流行、综合防控措施实施和防治效果的评价等都具有十分重要的意义。

目前，已建有对绦虫感染犬进行单一检测的方法，包括常规检测法（槟榔碱导泻法和剖检法)、DNA-PCR检测法和ELISA检测方法。Al-Sabi, M. N., Kapel, C. M. Multiplex PCR identification of Taenia spp. in rodents. Parasitol Res, 2011, 109(5):1293-1298. 安晓雪，等. 多头带绦虫Tm7基因的表达及间接ELISA检测方法的建立. 畜牧兽医学报, 2011, 42(9):1302-1308。

上述方法中，常规检测法具有感染人和污染周围环境的危险，其它几种方法均无法在一个反应内对多种绦虫（多头带绦虫、泡状带绦虫、豆状带绦虫、犬复孔绦虫）进行虫种检测，存在检测过程繁琐和浪费材料的问题。

技术实现要素：

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了用于检测和区分多种以犬为终末宿主的常见大中型绦虫的检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：用于检测和区分多种以犬为终末宿主的常见大中型绦虫的检测试剂盒，所述试剂盒内包括有四对特异引物，分别为泡状带绦虫特异性上、下游引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，多头带绦虫特异性上、下游引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，豆状带绦虫特异性上、下游引物SEQ ID No.5和SEQ ID No.6，犬复孔绦虫特异性上、下游引物SEQ ID No.7和SEQ ID No.8。

具体为：

SEQ ID No.1：5'- AGT TCC ATA TTA TTT ACA GTT TTG TTA TTA C -3'；

SEQ ID No.2：5'- TAA CAT AAT ACT TGA AGA CAC CCC CA -3'；

SEQ ID No.3：5'- GTT GTT GAT GTG GCT TAA GTT TTT GTG T -3'；

SEQ ID No.4：5'- TCT ATA AAA TAA ACA CAT ACA CAA CAA TCC T -3'；

SEQ ID No.5：5'- TGT GGG AAG GTT TAG GTG AAT CAT -3'；

SEQ ID No.6：5'- GTT AAC ATC AAT ATC TTC TAG CTC TGA CAC T -3'；

SEQ ID No.7：5'- CTA TTG ATT GCG TTT ATT GTT TTG TGT -3'；

SEQ ID No.8：5'- GAA AAG AAA TCA AAT ACA GTT AAA CGG T-3'。

进一步的，上述的用于检测和区分多种以犬为终末宿主的常见大中型绦虫的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还有：Taq DNA聚合酶，10×PCR Buffer，2.5 mmol/μL的dNTP ，25 mmol/μL的MgCl₂，无菌双蒸水。

本发明是建立在病原分子生物学基础上，基于多头带绦虫、泡状带绦虫、豆状带绦虫、犬复孔绦虫的线粒体基因，分别对四种病原设计特异性扩增引物，并建立复合PCR方法用于定种检测四种病原的单独或混合感染。本发明中建立的复合PCR技术，系统设计了针对中国存在的四种以犬为终末宿主的大中型绦虫的四对特异性检测引物用于其感染的单独和复合检测，为此四种病原定种检测的首创。本复合PCR技术包含普通PCR技术的所有优点，包括检测结果特异性高，检测反应敏感，检测快速和高通量检测等，也具有复合PCR的高效性、系统性和经济简便性等优点，适用于临床和实验室进行快速准确的病原学鉴定。

本发明的有益效果为：

本发明是一种应用复合PCR方法对四种以犬为终末宿主的大中型绦虫的检测试剂盒，应用本发明试剂盒中的四对特异引物对被检样品进行PCR扩增，然后对扩增后的产物进行电泳，根据电泳图中是否出现特异性条带确定出被检样品是否被感染，以及确定感染了多头带绦虫、泡状带绦虫、豆状带绦虫和犬复孔绦虫这四种寄生虫中的具体种类。采用这种试剂盒既可以用于中间宿主的感染检测，也可以用于终末宿主的感染检测，而且能对终末宿主可能的多重感染进行检测。

与本发明相关的操作过程包括从终末宿主粪便中提取全基因组DNA，或从四种绦虫感染的中间宿主病灶组织（包囊及其内容物）中提取全基因组DNA，配制含四对引物和全基因组模板的复合PCR反应体系，进行PCR反应后琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果，并根据目的条带的大小判定所感染绦虫的种类。用本发明的四对特异性PCR检测引物，用以犬为终末宿主的其他常见五种绦虫，即泡尾带绦虫（T. taeniaeformis, Tae），细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus, Eg)、多房棘球绦虫(E. mutilocularis, Em)和石渠棘球绦虫(E. shaquacus, Es)基因组DNA为模板进行特异性验证扩增，均未见有PCR扩增产物，表明这四对检测引物特异性高。本发明的四对引物同时在一个PCR反应体系内使用而互不干扰，表明其具有高效性、系统性和经济简便性等优点，适用于临床和实验室进行快速准确的病原学鉴定。

附图说明

图1显示为本发明的四种绦虫特异性检测引物混合后分别对以犬为终末宿主的常见单一寄生虫病原DNA模板进行扩增时的PCR结果。

其中：1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8依次为四对引物扩增Th, Tm, Tp, Dc, Tae, Eg, Em, Es基因组DNA模板时的PCR结果；9为未加任何物种基因组DNA模板时的PCR结果；M为DNA分子量标准DL2000。

图2显示为本发明的四种绦虫的混合检测引物以一种、两种、三种及四种绦虫DNA混合模板进行扩增时的复合PCR结果。

其中：1-4依次为四对引物扩增Th, Tm, Tp, Dc基因组模板时的PCR结果；5-10分别为四种混合检测引物扩增以下两种绦虫基因组模板时的PCR结果： Th+Tm，Th+Tp，Th+Dc Tm+Tp，Tm+Dc，Tp+Dc；11-14分别为四种混合检测引物扩增同时检测以下三种绦虫基因组模板时的PCR结果：Th+Tm+Tp，Th+Tm+Dc，Th +Tp+Dc，Tm+Tp+Dc；15为四种混合检测引物扩增四种绦虫基因组模板时的PCR结果，即Th+Tm+Tp+Dc；16为未加任何物种基因组DNA模板时的PCR结果；M为DNA分子量标准DL2000。

具体实施方式

实施例1：

在本实施例中，选取犬粪便进行泡状带绦虫等四种绦虫感染检测。取适量犬粪（2-5g），用饱和盐水漂浮法漂浮犬粪中虫卵和虫体残片，离心收集后采用粪DNA提取试剂盒提取全基因组DNA，测定提取DNA浓度后备用。在PCR反应管内配制复合PCR反应液，采用50 μL反应体系，包含10×PCR Buffer 5 μL，MgCl₂(25 mmol/μL) 5 μL，用于泡状带绦虫特异性检测的上游引物F1：5'- AGT TCC ATA TTA TTT ACA GTT TTG TTA TTA C -3' （Th NO.1）1 μL（50 μmol/mL）和下游引物R1：5'- TAA CAT AAT ACT TGA AGA CAC CCC CA -3'（ThNO.2）1 μL（50 μmol/mL），用于多头带绦虫特异性检测的上游引物F2：5'- GTT GTT GAT GTG GCT TAA GTT TTT GTG T -3'（Tm NO.1）1 μL（50 μmol/mL）和下游引物R2：5'- TCT ATA AAA TAA ACA CAT ACA CAA CAA TCC T -3'（Tm NO.2）1 μL（50 μmol/mL），用于豆状带绦虫特异性检测的上游引物F3：5'- TGT GGG AAG GTT TAG GTG AAT CAT -3'（Tp NO.1）1 μL（50 μmol/mL）和下游引物R3：5'- GTT AAC ATC AAT ATC TTC TAG CTC TGA CAC T -3'（Tp NO.2）1 μL（50 μmol/mL），用于犬复孔绦虫特异性检测的上游引物F4：5'- CTA TTG ATT GCG TTT ATT GTT TTG TGT -3'（Dc NO.1）1 μL（50 μmol/mL）和下游引物R4：5'- GAA AAG AAA TCA AAT ACA GTT AAA CGG T-3'（Dc NO.2）1 μL（50 μmol/mL），dNTP (2.5 mmol/μL) 1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，犬粪全基因组DNA模板量为100 ng，用水补足50 μL。在热循环仪内完成PCR反应过程，反应程序为：95℃预变性4 min，94℃变性50 S，55℃退火30S，72℃延伸40 S，35个循环，72℃加长延伸10 min，反应完成后4℃保存。PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察扩增结果，并对结果进行判定和分析，泡状带绦虫、多头带绦虫、豆状带绦虫和犬复孔绦虫的特异性扩增条带大小分别为592bp、385bp、283bp和190bp。

本发明的具体检测过程如下：

1、 犬粪的的采集获取

在流浪犬、家养犬、牧羊犬活动区域收集新鲜犬粪，或给犬投喂含氢溴酸槟榔碱的食物导泻后收集犬粪。

2、犬粪全基因组DNA的提取

1）将获取的犬粪便的于-70^°C冻存1周。

2）粪DNA的制备：根据粪DNA提取试剂盒说明书提取粪DNA。

3、PCR扩增体系的建立

在PCR反应管内配制复合PCR反应液，采用50 μL反应体系，加入10×PCR Buffer 5 μL，MgCl₂(25 mmol/μL) 5 μL，引物Th NO.1、Th NO.2、Tm NO.1、Tm NO.2、Tp NO.1、Tp NO.2、Dc NO.1、DC NO.2各1 μL（50 μmol/mL），dNTP (2.5 mmol/μL) 1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，犬粪全基因组DNA模板量为100 ng，用水补足50 μL。

4、PCR扩增条件

PCR反应程序为：95℃预变性5 min，94℃变性50 S，52℃退火30 S，72℃延伸40 S，35个循环，72℃加长延伸10 min，反应完成后4℃保存。

5、PCR扩增结果观察

PCR反应产物在1.5% (w/v)琼脂糖凝胶（含0.5 μg/mL溴化乙锭）中进行电泳，紫外凝胶成像系统观察扩增结果，并对结果进行判定和分析。结果如图1和图2。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 用于检测和区分多种以犬为终末宿主的大中型绦虫的检测试剂盒

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 泡状带绦虫特异性上游引物

<400> 1

agttccatat tatttacagt tttgttatta c 31

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 泡状带绦虫特异性下游引物

<400> 2

taacataata cttgaagaca ccccca 26

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 多头带绦虫特异性上游引物

<400> 3

gttgttgatg tggcttaagt ttttgtgt 28

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 多头带绦虫特异性下游引物

<400> 4

tctataaaat aaacacatac acaacaatcc t 31

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 豆状带绦虫特异性上游引物

<400> 5

tgtgggaagg tttaggtgaa tcat 24

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 豆状带绦虫特异性下游引物

<400> 6

gttaacatca atatcttcta gctctgacac t 31

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 犬复孔绦虫特异性上游引物

<400> 7

ctattgattg cgtttattgt tttgtgt 27

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 犬复孔绦虫特异性下游引物

<400> 8

gaaaagaaat caaatacagt taaacggt 28

序 列 表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 用于检测和区分多种以犬为终末宿主的大中型绦虫的检测试剂盒

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 泡状带绦虫特异性上游引物

<400> 1

agttccatat tatttacagt tttgttatta c 31

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 泡状带绦虫特异性下游引物

<400> 2

taacataata cttgaagaca ccccca 26

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 多头带绦虫特异性上游引物

<400> 3

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<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 多头带绦虫特异性下游引物

<400> 4

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<211> 24

<212> DNA

<213> 豆状带绦虫特异性上游引物

<400> 5

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<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 豆状带绦虫特异性下游引物

<400> 6

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<213> 犬复孔绦虫特异性上游引物

<400> 7

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<212> DNA

<213> 犬复孔绦虫特异性下游引物

<400> 8

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