有效抑制牦牛CAPN1基因表达的shRNA及其应用的制作方法

技术特征：

1.有效抑制牦牛CAPN1基因表达的shRNA，其特征在于：所述shRNA为以下（1）-（3）中的任意一条，每一条shRNA分子由上下游两条DNA互补单链组成：

。

2.权利要求1所述的shRNA在有效抑制牦牛CAPN1基因表达中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：是将一条shRNA分子中的两条互补单链经退火形成双链的shRNA分子后，连接到慢病毒干扰载体上，构建得到shRNA慢病毒重组载体；然后将shRNA慢病毒重组载体与CAPN1表达质粒共转染293T细胞。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述慢病毒干扰载体为miRZip慢病毒干扰载体。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述shRNA慢病毒重组载体的具体构建方法为：

（1）取100pmol的两条互补单链核苷酸各2μl，加入2μl 10×退火缓冲液和14μl灭菌超纯水，反应程序：95℃ 5min 72℃ 10min，在室温下放置 60min；然后取5ul加水95ul作为退火产物工作浓度；

（2）将miRZip慢病毒干扰载体经BamHI和EcoRI双酶切后回收线性化质粒，与步骤（1）得到的退火产物4℃过夜连接，将连接产物转化DH5a感受态细胞，用含氨苄青霉素100μg/μl的LB平板筛选，将筛选阳性克隆经测序正确后，提取纯化重组质粒。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：将shRNA慢病毒重组载体与CAPN1表达载体共转染293T细胞的具体方法为：

将shRNA慢病毒重组载体2μg与2μg的CAPN1表达质粒混合，加入生理盐水混匀，室温孵育5min，再加入6μl浓度为1mg/ml的聚乙烯亚胺，混匀后，室温孵育10min；最后加入293T细胞中进行细胞转染，充分的摇匀后放入37℃、5％CO₂、95%相对湿度的培养箱中培养；感染6小时后，吸走孔内的培养基，换成新鲜的2ml含10％胎牛血清的 DMEM完全培养基，放入37℃、5％CO₂、95%相对湿度的培养箱中培养；待细胞长满后，收集细胞。

7.一种有效抑制牦牛CAPN1基因表达的方法，其特征在于：是将一条shRNA分子中的两条互补单链经退火形成双链的shRNA分子后，连接到慢病毒干扰载体上，构建得到shRNA慢病毒重组载体；然后将shRNA慢病毒重组载体与CAPN1表达质粒共转染293T细胞；作为优选，所述慢病毒干扰载体为miRZip慢病毒干扰载体。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述shRNA慢病毒重组载体的具体构建方法为：

（1）取100pmol的两条互补单链核苷酸各2μl，加入2μl 10×退火缓冲液和14μl灭菌超纯水，反应程序：95℃ 5min 72℃ 10min，在室温下放置 60min；然后取5ul加水95ul作为退火产物工作浓度；

（2）将miRZip慢病毒干扰载体经BamHI和EcoRI双酶切后回收线性化质粒，与步骤（1）得到的退火产物4℃过夜连接，将连接产物转化DH5a感受态细胞，用含氨苄青霉素100μg/μl的LB平板筛选，将筛选阳性克隆经测序正确后，提取纯化重组质粒。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：将shRNA慢病毒重组载体与CAPN1表达载体共转染293T细胞的具体方法为：

将shRNA慢病毒重组载体2μg与2μg的CAPN1表达质粒混合，加入生理盐水混匀，室温孵育5min，再加入6μl浓度为1mg/ml的聚乙烯亚胺，混匀后，室温孵育10min；最后加入293T细胞中进行细胞转染，充分的摇匀后放入37℃、5％CO₂、95%相对湿度的培养箱中培养；感染6小时后，吸走孔内的培养基，换成新鲜的2ml含10％胎牛血清的 DMEM完全培养基，放入37℃、5％CO₂、95%相对湿度的培养箱中培养；待细胞长满后，收集细胞。