本发明提供了一种靶向cd20抗原嵌合抗原受体的序列组分，及其修饰t细胞(cart20)的制备方法和活性鉴定；本发明鉴定出了一种治疗cd20阳性b细胞淋巴瘤的嵌合性抗原受体结构。
背景技术：
血液系统的恶性肿瘤占人类恶性肿瘤约10％，95％血液系统的恶性肿瘤是b淋巴细胞来源的。传统的化疗和放疗对治疗血液系统的恶性肿瘤起着重要作用，有的病人亦疗效显著，但大部份都难以治愈。新的、有效的治疗方法一直是这一领域探索的热点。
过继性t细胞治疗针对恶性肿瘤的临床治疗中已经显示了其强大疗效和光明前景。这其中，多个中心独立开展的利用嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，car)修饰的t细胞靶向表达cd19的b细胞复发、难治性恶性肿瘤取得了前所未有的成功。尤其是在宾夕法尼亚大学医学院开展的一项利用cart19治疗复发、难治性急性b细胞淋巴瘤(r/rb-all)的临床试验中有高达94％的患者达到了完全缓解。尽管此项临床试验的初始反应率很高，但有近40％的患者在治疗1个月达到完全缓解之后又出现了复发，并且复发的患者中高于60％比例的患者出现了cd19阴性肿瘤细胞的逃逸。因此，迫切需要筛选出靶向除cd19之外的b细胞淋巴瘤相关抗原的cart结构，来治疗恶性淋巴瘤患者。
cd20是糖基化蛋白，是第一个被确定的b细胞膜标识，也被称为b1，由ms4a基因编码。cd20分子是有四个跨膜的疏水区，其n段和c端均位于胞质一侧，从而在胞外形成两个闭环，分别称为大环和小环。cd20特异性地表达在95％以上的正常和癌变的b细胞，这些细胞处于前b细胞及之后的发育阶段，直至分化为浆细胞cd20才停止表达。因此，cd20是理想的b细胞恶性肿瘤免疫治疗的靶点。
细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发、增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。本领域技术人员一直致力于开发新的细胞免疫疗法，以提高细胞免疫疗法的效果，并降低其副作用。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种cd20靶向性的嵌合抗原受体及其制法和应用。
本发明涉及靶向cd20嵌合抗原受体结构的构建、靶向cd20嵌合抗原受体工程化t细胞的制备方法及其活性鉴定。
本发明的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体(car)(序列)，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域(即，scfv)包括seqidno.12所示的抗体重链可变区，和seqidno.14所示的抗体轻链可变区。
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域(scfv)如下式i或式ii所示：
vh－vl,(i)；vl－vh,(ii)
其中，vh为抗体重链可变区；vl为抗体轻链可变区；“－”为连接肽或肽键。
在另一优选例中，所述连接肽的氨基酸序列如seqidno.16所示。
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的结构如下式所示：
l－scfv－h－tm－c－cd3ζ
其中，
l为任选的引导序列(leadersequence，即信号肽序列)；
scfv为抗原结合结构域；
h为绞链区；
tm为跨膜结构域；
c为共刺激信号受体酪氨酸激活基序(共刺激分子)；
cd3ζ为源于cd3ζ的胞浆信号传导序列；
所述抗原结合结构域和“－”分别如上所述。
在另一优选例中，所述共刺激信号受体酪氨酸激活基序包括4-1bb来源的共刺激信号受体酪氨酸激活基序，和/或cd28来源的共刺激信号受体酪氨酸激活基序。
在另一优选例中，l的序列如seqidno.32所示。
在另一优选例中，h的序列如seqidno.18或20所示。
在另一优选例中，tm的序列包括源于cd8的跨膜区，优选地tm的序列如seqidno.22所示。
在另一优选例中，tm的序列包括源于cd28的跨膜区，优选地tm的序列如seqidno.24所示。
在另一优选例中，所述4-1bb来源的共刺激信号受体酪氨酸激活基序的氨基酸序列如seqidno.26所示。
在另一优选例中，所述cd28来源的共刺激信号受体酪氨酸激活基序的氨基酸序列如seqidno.28所示。
在另一优选例中，cd3ζ的序列如seqidno.30所示。
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的序列如seqidno.1、4、6、8或10所示。
本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的嵌合抗原受体(car)。
在另一优选例中，所述核酸分子包含选自下组的编码所述铰链区核酸序列：
(a)编码如seqidno.18或20所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如seqidno.19或21所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与seqidno.19或21所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，并且编码seqidno.18或20所示氨基酸序列的多核苷酸；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述核酸分子包含选自下组的编码所述cd8的跨膜区的核酸序列：
(a)编码如seqidno.22所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如seqidno.23所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与seqidno.23所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，并且编码seqidno.22所示氨基酸序列的多核苷酸；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述核酸分子包含选自下组的编码所述cd28的跨膜区的核酸序列：
(a)编码如seqidno.24所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如seqidno.25所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与seqidno.25所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，并且编码seqidno.24所示氨基酸序列的多核苷酸；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述核酸分子包含共刺激信号受体酪氨酸激活基序编码序列，所述共刺激信号受体酪氨酸激活基序编码序列包括4-1bb来源的共刺激信号受体酪氨酸激活基序编码序列，和/或cd28来源的共刺激信号受体酪氨酸激活基序编码序列，其中
所述4-1bb来源的共刺激信号受体酪氨酸激活基序编码序列选自下组：
(a)编码如seqidno.26所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如seqidno.27所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与seqidno.27所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，并且编码seqidno.26所示氨基酸序列的多核苷酸；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸；
所述cd28来源的共刺激信号受体酪氨酸激活基序编码序列选自下组：
(a)编码如seqidno.28所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如seqidno.29所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与seqidno.29所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，并且编码seqidno.28所示氨基酸序列的多核苷酸；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述核酸分子包含选自下组的编码所述cd3ζ的胞内信号结构域的核酸序列：
(a)编码如seqidno.30所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如seqidno.31所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与seqidno.30所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，并且编码seqidno.31所示氨基酸序列的多核苷酸；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述核酸分子包含选自下组的核酸序列：
(a)编码如seqidno.1、4、6、8或10所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如seqidno.2、3、5、7、9或11所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与seqidno.2、3、5、7、9或11所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)，并且编码seqidno.1、4、6、8或10所示氨基酸序列的多核苷酸；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述核酸分子为分离的。
在另一优选例中，所述核酸分子还包括编码前导序列(引导序列，信号肽)的多核苷酸，所述前导序列的氨基酸序列如seqidno.32所示；优选地所述编码前导序列(信号肽)的多核苷酸如seqidno.33所示。
在另一优选例中，所述核酸分子的序列如seqidno.2、3、5、7、9或11所示。
本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的核酸分子。
在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。
本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明第三方面所述的所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第二方面所述的核酸分子。
在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。
在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。
在另一优选例中，所述细胞为t细胞。
本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，所述组合物含有药学上可接受的载体以及本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的细胞。
本发明的第六方面，提供了本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的细胞的用途，用于制备治疗肿瘤的药物或制剂。
在另一优选例中，所述的肿瘤包括cd20阳性肿瘤。
本发明的第七方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的细胞、或本发明第五方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述疾病为肿瘤。
本发明的第八方面，提供了一种制备car-t细胞(car-修饰的t细胞)的方法，所述car-t细胞表达本发明第一方面所述的嵌合抗原受体，
所述方法包括步骤：将本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的载体转导入t细胞内，从而获得所述car-t细胞。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1.靶向cd20嵌合型抗原受体结构图。所设计car结构各元件如图所示，所列元件包括：前导序列、抗原识别序列(leu16)、铰链区、跨膜区、共刺激因子信号区和cd3zeta信号传导区。其中,car-t20.17和car-t18分别是car-t20.9和car-t20.12在igg4hinge-ch2-ch3连接区的l235e-n297q突变形式。
图2.靶向cd20嵌合型抗原受体工程化t细胞转染效率的检测。proteinl方法鉴定培养到第7天(a)和第11天(b)的car-t20s细胞中car基因编码蛋白在t细胞膜表面的表达水平。
图3.依次取1*105培养到第6天的cart-20细胞，分别与cd20阳性的raji和ramos肿瘤细胞系，以及cd20阴性的molt-4肿瘤细胞系或不添加肿瘤细胞，在200μlgt-551培养基中按照1:1比例与图示car-t20细胞分别共培养18h后检测t细胞膜表面cd137的表达水平(a)和培养上清中ifnγ的分泌水平(b)。
图4.依次取1*105培养到第13天的cart-20细胞，分别与cd20阳性的raji和ramos肿瘤细胞系，以及cd20阴性的molt-4肿瘤细胞系或不添加肿瘤细胞，在200μlgt-551培养基中按照1:1比例与图示car-t20细胞分别共培养18h后检测t细胞膜表面cd137的表达水平(a)和培养上清中ifnγ的分泌水平(b)。
图5.cart-20诱导肿瘤细胞早期凋亡水平的检测。分别取1*104经过cfse标记的cd20阴性(molt-4)或cd20阳性的(raji，ramos)肿瘤细胞系，在200μlgt-551培养基中按照图示比例与培养到第11天的各种car-t20细胞分别共培养4h后离心收集细胞沉淀，细胞经pbs洗两遍后用annexinv-apc染料按1:50的比例100μl染液中染色30min，pbs洗1遍后在流失细胞仪上分析cfse阳性细胞中annexinv阳性细胞的比例。图示结果显示了annexinv阳性细胞在相应共培养样品中的统计分析结果。
图6.cart-20诱导肿瘤细胞晚期凋亡水平的检测。a图显示所分析样品cart阳性细胞比率；分别取1*104经过cfse标记的cd20阴性(molt-4)或cd20阳性的(raji，ramos)肿瘤细胞系，在200μlgt-551培养基中按照图示比例与相应的t细胞分别共培养4h后离心收集细胞沉淀，细胞经pbs洗两遍后用pi染料(pi/rnasestainingbuffer)在100μl染液中染色30min，pbs洗1遍后在流失细胞仪上分析cfse阳性细胞中annexinv阳性细胞的比例。b图显示了pi阳性细胞在相应共培养样品中的统计分析结果。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，以cd20鼠源单克隆抗体leu16的序列为基础构建了靶向cd20抗原的多种类型的嵌合型抗原受体，并对这些嵌合型抗原受体在原代t细胞中的表达水平、体外活化能力及肿瘤细胞杀伤效能等层面的分析与鉴定。最终发现了抗肿瘤活性较好的嵌合型抗原受体为临床应用car-t治疗cd20阳性的白血病和淋巴瘤提供了新的有效方法和制剂。
鉴于靶向cd20治疗性抗体亲和力、杀伤机制等方面的不同，以及不同的跨膜结构域、胞内结构域对嵌合抗原受体活性的显著影响，在本发明中，利用多种抗cd20抗体可变区氨基酸序列构结合不同的跨膜和胞内部分，建了靶向cd20的系列嵌合性抗原受体，并完成了这类嵌合性抗原受体在原代t细胞中的表达，建立了受体表达强度的检测方法，鉴定了这些car-t细胞体外、体内识别cd20抗原的能力，及其体外杀伤和体内清除携带cd20抗原的恶性肿瘤的活性差异，为临床应用car-t治疗cd20阳性的白血病和淋巴瘤提供了新的有效方法和制剂。
嵌合抗原受体
本发明提供了包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域的嵌合抗原受体(car)。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。
在car的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在car的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。
在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供的car的胞外结构域包括靶向cd20的抗原结合结构域。本发明的car当在t细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与4-1bb信号传导结构域、和cd3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。
在一个实施方式中，本发明的cd20靶向性car包括本发明特定信号传导结构域(cd8的跨膜区、cd137和cd3ζ的胞内信号结构域串联而成)。与其他方式的cd20靶向性car相比，本发明的信号传导结构域显著增加了抗肿瘤活性和car-t细胞的体内持久性。
在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体(car)的氨基酸序列如下：
(car-t20.9和car-t20.10，seqidno.1)：
car-t20.9的编码dna序列如下：
car-t20.10的编码dna序列：
在本发明的另一个优选地实施方式中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如下：
(car-t20.11)
car-t20.11的编码dna序列如下：
在本发明的另一个优选地实施方式中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如下：
(car-t20.12)
car-t20.12的编码dna序列为：
在本发明的另一个优选地实施方式中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如下：
(car-t20.17)
car-t20.17的编码dna序列如下：
在本发明的另一个优选地实施方式中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如下：
(car-t20.18)
car-t20.18的编码dna序列如下：
抗原结合结构域
在一个实施方式中，本发明的car包括被称为抗原结合结构域的靶-特异性结合元件。本发明car的抗原结合结构域为靶向cd20的特异性结合元件。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述抗原结合结构域包括抗cd20抗体的重链可变区和轻链可变区。
在另一优选例中，所述抗体重链可变区的氨基酸序列如下：
其编码dna序列如下：
在另一优选例中，所述抗体轻链可变区的氨基酸序列如下：
其编码dna序列如下：
在本发明的一个优选地实施方式中，重链可变区与轻链可变区之间的氨基酸连接序列如下：
ggggsggggsggggs15(seqidno.16)
其编码dna序列如下：
ggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatct45(seqidno.17)
绞链区和跨膜区
对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，car可被设计以包括融合至car的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与car中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
在本发明的一个优选的实施方式中，绞链区包括以下氨基酸序列(igg4hinge-ch2-ch3铰链区)：
其编码dna序列如下：
或者，所述绞链区包括以下氨基酸序列(igg4hinge-ch2-ch3(l235e，n297q))：
其编码dna序列如下：
在本发明的一个优选的实施方式中，本发明的car中跨膜区为cd28来源的跨膜区(cd28tm)或cd8来源的跨膜区(cd8tm)。
在本发明的一个优选的实施方式中，cd8来源的跨膜区(cd8tm)氨基酸序列如下：
iyiwaplagtcgvlllslvitlyc24(seqidno.22)
其编码dna序列如下：
在本发明的一个优选的实施方式中，cd28来源的跨膜区(cd28tm)氨基酸序列如下：
fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwv27(seqidno.24)；
cd28来源的跨膜区(cd28tm)编码dna序列：
胞内结构域
本发明的car中的胞内结构域包括4-1bb的信号传导结构域和cd3ζ的信号传导结构域。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述car的胞内结构域还包括cd28的信号传导结构域。
优选地，4-1bb的胞内信号传导结构域包含如下氨基酸序列：
krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel42(seqidno.26)
其编码dna序列如下:
优选地，cd28来源的胞内信号传导结构域包含如下氨基酸序列：
rskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs41(seqidno.28)
其编码dna序列如下:
优选地，cd3ζ的胞内信号传导结构域包含如下氨基酸序列：
其编码dna序列如下：
载体
本发明还提供了编码本发明car序列的dna构建体。
编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。
本发明也提供了其中插入本发明的dna构建体的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。
简单概括，通常通过可操作地连接编码car多肽或其部分的核酸至启动子，并将构建体并入表达载体，实现编码car的天然或合成核酸的表达。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。
该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如sambrook等(2001,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,newyork)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，wo01/96584；wo01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(ef-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复(ltr)启动子、momulv启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(epstein-barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估car多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段dna上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在dna已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因(例如，ui-tei等，2000febsletters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如sambrook等(2001,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,newyork)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用dna和rna载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒i、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(deliveryvehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。
在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(exvivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/dna或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述dna构建体中还包括信号肽编码序列。优选地，所述信号肽序列连接在所述抗原结核结构域核酸序列的上游。优选地所述信号肽为人源cd8a信号肽。
优选地，所述信号肽氨基酸序列如下：
cd8前导序列(cd8leadersequence)的氨基酸序列：
malpvtalllplalllhaarp21(seqidno.32)
cd8前导序列(cd8leadersequence)的编码dna序列序列：
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccagg60
ccg63(seqidno.33)。
治疗性应用
本发明包括用编码本发明car的慢病毒载体(lv)转导的细胞(例如，t细胞)。转导的t细胞可引起car-介导的t-细胞应答。
因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的t细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：施用给哺乳动物表达本发明car的t细胞。
在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，其中t细胞被基因修饰以表达本发明的car，和car-t细胞被注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。不像抗体疗法，car-t细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
在一个实施方式中，本发明的car-t细胞可经历稳固的体内t细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，car介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中car-修饰t细胞诱导对car中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，抗cd20car-t细胞引起抗表达cd20的细胞的特异性免疫应答。
尽管本文公开的数据具体公开了包括抗-cd20scfv、铰链和跨膜区、和4-1bb和cd3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。
可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的car治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。
实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌、。
本发明的car-修饰t细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。
对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩展细胞，ii)将编码car的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。
离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的car的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。car-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和car-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。
除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。
通常地，如本文所述活化和扩展的细胞可用于治疗和预防无免疫应答的个体中产生的疾病。特别地，本发明的car-修饰的t细胞用于治疗ccl。在某些实施方式中，本发明的细胞用于治疗处于形成ccl风险中的患者。因此，本发明提供了治疗或预防ccl的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的car-修饰的t细胞。
本发明的car-修饰的t细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如il-2、il-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的t细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。t细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如rosenberg等，neweng.j.ofmed.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的t细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的t细胞组合物优选通过i.v.注射施用。t细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。
在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将t细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ara-c)或对ms患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对pml患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的t细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和fk506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(xrt)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×106个至1×1010个本发明经修饰的t细胞(如，car-t20细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。
本发明的优点包括：
(1)本发明的嵌合抗原受体，其细胞外抗原结合结构域为特定的抗cd20scfv，该特定的抗cd20scfv结合特定的绞链区和胞内结构域形成的car显示出了极大的对肿瘤细胞的杀伤能力，而且细胞毒性较小，副作用低。
(2)本发明提供的嵌合抗原受体可在携带car基因的慢病毒感染t细胞后实现car蛋白的稳定表达和膜定位；
(3)本发明的car修饰的t细胞在体内存活时间较长，且抗肿瘤效力较强；对igg4hinge-ch2-ch3连接区优化后的car，能够避免fc受体的结合及后续的adcc作用(抗体依赖性细胞毒作用)。
实施例1慢病毒表达载体的构建
编码质粒为委托上海博益生物科技有限公司做全长dna合成和克隆构建。克隆载体选用的是pwpt慢病毒载体，克隆位点为bamhi和sali位点。具体序列结构如图1所示。各元件的氨基酸和核苷酸序列如上所述。
实施例2car-t细胞的制备
(1)取健康人静脉血，密度梯度离心方法分离获得单个核细胞(pbmcs)。
(2)第0天，pbmcs采用含2％人血白蛋白的gt-t551细胞培养基培养，调整细胞终浓度为2×106cell/ml。将细胞接种于预先经过终浓度为5μg/mlcd3单克隆抗体(okt3)及终浓度为10μg/ml的retronectin(购自takara公司)包被的细胞培养瓶。培养基里添加终浓度为1000u/ml的重组人白介素2(il-2)，在37℃，饱和湿度为5％co2培养箱培养。
(3)第2天，加入新鲜培养液，浓缩纯化的car20s慢病毒液，protaminesulfate(12ug/ml)，以及终浓度为1000u/mlil-2。置于37℃，5％co2培养箱中感染12小时后，弃培养液，加入新鲜的培养基，于37℃，5％co2培养箱继续进行培养。
(4)第6天开始，可取cart20s细胞做相应的活性检测试验。
实施例3car基因在t细胞基因组整合率及其编码蛋白在膜表面表达水平的检测。
(1)分别取0.5×106实施例2中培养到第7天(图.2a)和第11天(图.2b)的cart-20s细胞样品，经过proteinl染色在流式细胞仪上分析car20蛋白在t细胞膜表面的表达水平。结果显示：本研究中所设计的car结构均可在其相应修饰的t细胞中表达并完成细胞膜表面定位。
实施例4car-t20s体外激活能力的检测
(1)采用实施例2中培养到第6天car-t20s细胞作细胞被激活水平指标蛋白cd137和ifnγ的检测。依次取1*105培养到第6天的cart-20细胞，分别与cd20阳性的raji和ramos肿瘤细胞系，以及cd20阴性的molt-4肿瘤细胞系或不添加肿瘤细胞，在200μlgt-551培养基中按照1:1比例培养18h后流逝方法检测t细胞膜表面cd137的表达水平(图.3a)，elisa方法检测培养上清中ifnγ的分泌水平(图.3b)。
(2)采用实施例2中培养到第13天car-t20s细胞作细胞活化水平指标蛋白cd137和ifnγ的检测。图4，依次取1*105培养到第6天的cart-20细胞，分别与cd20阳性的raji和ramos肿瘤细胞系，以及cd20阴性的molt-4肿瘤细胞系或不添加肿瘤细胞，在200μlgt-551培养基中按照1:1比例培养18h后流逝方法检测t细胞膜表面cd137的表达水平(图.4a)，elisa方法检测培养上清中ifnγ的分泌水平(图.4b)。
(3)从图.3和图.4中的结果我们可以得出如下结论：以leu-16序列为基础的三代car比二代car有更好的cd137活化水平和ifnγ释放水平；leu16vh-vl或者vl-vh的顺序对以leu-16抗体序列为基础构建的cart20的体外活性并没有明显的ifngamma释放和cd137表达的差异。
实施例5car-t20s细胞诱导肿瘤细胞早期凋亡活性的检测
(1)采用实施例2中培养到第11天car-t20s细胞按图示比例分别与1*104经过cfse标记的cd20阴性(molt-4)或cd20阳性的(raji，ramos)肿瘤细胞系，在200μlgt-551培养基中共培养4h，离心收集细胞沉淀，细胞经pbs洗两遍后用annexinv-apc染料按1:50的比例100μl染液中染色30min，pbs洗1遍后在流失细胞仪上分析cfse阳性细胞中annexinv阳性细胞的比例。
(2)图.5的结显示leu16序列为基础构建的三代car相较于二代car可以更好地诱导cd20阳性肿瘤细胞的早期凋亡。
实施例6car-t20s细胞诱导肿瘤细胞晚期凋亡活性的检测
(1)实施例2中方法制备的另一批car-t20细胞(图.6a),按图.6b所示比例分别与1*104经过cfse标记的cd20阴性(molt-4)或cd20阳性的(raji，ramos)肿瘤细胞系，在200μlgt-551培养基中共培养4h，离心收集细胞沉淀，细胞经pbs洗两遍后用pi染料按1:50的比例100μl染液中染色30min，pbs洗1遍后在流失细胞仪上分析cfse阳性细胞中pi阳性细胞的比例。
(2)图.6b所示结果说明以leu16序列为基础构建的三代car(car-t20.9，car-t20.17相较于二代car(car-t20.12，car-t20.18)可以更好地诱导cd20阳性肿瘤细胞的晚期凋亡。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
序列表
<110>西比曼生物科技（上海）有限公司
西比曼生物科技（无锡）有限公司
<120>一种靶向cd20的car的构建及其工程化t细胞的活性鉴定
<130>p2016-1976
<160>33
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>715
<212>prt
<213>人工序列
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thrphethrsertyrasnmethistrpvallysglnthrproglygln
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glyleuglutrpileglyalailetyrproglyasnglyaspthrser
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serserthralatyrmetglnleuserserleuthrsergluaspser
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phepheaspvaltrpglyalaglythrthrvalthrvalsersergly
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glyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyseraspile
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valleuthrglnserproalaileleuseralaserproglyglulys
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valthrmetthrcysargalaserserservalasntyrmetasptrp
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trpalaproleualaglythrcysglyvalleuleuleuserleuval
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lysmetalaglualatyrsergluileglymetlysglygluargarg
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leuserleuglylys
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arg
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