本发明属于肿瘤生物制品技术领域，具体地，涉及过继免疫治疗中的一种嵌合抗原受体her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ及其基因和重组表达载体、工程化her2靶向性的nkt细胞(carher2-nkt细胞)及其制备方法和应用。
背景技术：
自然杀伤细胞(nkt)是一种特殊类型的t淋巴细胞亚群，其既表达t细胞表面标志，又表达nk细胞的表面标志。nkt细胞的抗原识别与传统的t细胞不同，其不能识别由经典的mhc-i、ⅱ类分子提呈的抗原肽，而只能够被非经典的mhc-i类分子cdid所提呈的糖脂抗原活化，并迅速产生多种细胞因子，如：il-4、ifn-γ，il-10、il-13等，从而能够识别和杀伤突变的肿瘤细胞和病毒感染细胞，而对正常自身组织细胞无毒性作用。nkt细胞通过自身表面的cd16与特异性抗体的fc段结合，发挥adcc(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity)作用。但在抗体依赖的细胞介导的杀伤作用过程中，由于抗体能与靶细胞上的相应抗原表位特异性结合，nkt细胞可杀伤任何已与抗体结合的靶细胞，虽然抗体与靶细胞上的抗原结合是特异性的，但nkt细胞对靶细胞的杀伤作用是非特异性的。通常情况下，输注的nkt细胞在患者体内半衰期为2周左右，有效期短暂，需要反复多次输注。另外，nkt细胞本身缺少特异性抗体，不足以在肿瘤周围或者瘤巢中富集，制约了nkt细胞对恶性肿瘤的靶向治疗。而且，研究表明，nkt细胞不是对所有的肿瘤都有杀伤效果，对部分实体瘤的杀伤作用比较弱，特异杀伤活性有待提高。
her2，是人类表皮生长因子受体(her)家族成员之一，在正常的细胞中，her2能够控制细胞的增殖、迁移、分化等来维持细胞的正常生物学活性。而her2过度激活后，能够通过影响基因的转录及影响蛋白的稳定性，引起基因表达的改变，激活增殖相关的信号通路，抑制细胞凋亡信号通路，从而增加肿瘤的发生、血管的形成以及肿瘤细胞的迁移等。研究发现在许多表皮肿瘤及癌症中，her2呈现普遍高表达的现象，包括胆管癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、食管癌、前列腺癌、胃癌或口腔癌等。her2高表达的患者，其肿瘤的侵润性、复发及预后不良程度也很高。基于以上现象，靶向her2的治疗策略研究具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术中nkt细胞对实体瘤的杀伤作用比较弱、特异杀伤活性有待提高的缺陷，提供一种嵌合抗原受体her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ及其基因和重组表达载体、工程化her2靶向性的nkt细胞(carher2-nkt细胞)及其制备方法和应用。
本发明的发明人在研究中意外发现，本发明的嵌合抗原受体her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ对nkt细胞具有高的感染效率，且感染后得到的carher2-nkt细胞在体外有高效的杀瘤活性，在治疗her2阳性实体瘤时，对肿瘤细胞具有一定的特异杀伤活性，尤其是在治疗进展期her2阳性的上皮肿瘤患者时，对上皮肿瘤具有一定的治疗效果。
因此，为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ，包括串联的cd8a信号肽、her2scfv、缩短cd8的铰链区(hinge区)和跨膜区、cd137的胞内信号结构域和cd3ζ的胞内信号结构域。
第二方面，本发明提供了编码上述嵌合抗原受体的基因。
第三方面，本发明提供了含有上述基因的重组表达载体。
第四方面，本发明提供了一种工程化her2靶向性的nkt细胞，所述nkt细胞是上述嵌合抗原受体her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ修饰的nkt细胞。
第五方面，本发明提供了一种工程化her2靶向性的nkt细胞的制备方法，所述方法包括：包装携带pwpt-her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ的慢病毒，得到病毒浓缩液；利用得到的病毒浓缩液感染nkt细胞，使nkt细胞表达嵌合抗原受体her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ。
第六方面，本发明提供了上述方法制备得到的工程化her2靶向性的nkt细胞。
第七方面，本发明提供了上述工程化her2靶向性的nkt细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的应用。
在治疗her2阳性实体瘤时，本发明的嵌合抗原受体her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ对nkt细胞具有高的感染效率，且感染后得到的carher2-nkt细胞，即工程化her2靶向性的nkt细胞，能够特异性识别并结合her2抗原，在体外具有高效的杀瘤活性，明显延长免疫细胞在患者体内的存活时间，增强免疫细胞靶向识别肿瘤细胞表面her2抗原的能力，加强对肿瘤细胞的特异杀伤活性。而且，有望避免采用her2的单克隆抗体治疗过程中引起的耐药性。本发明的工程化her2靶向性的nkt细胞为治疗her2阳性实体瘤提供了一种新的选择，具有良好的产业应用前景。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
图1为流式细胞术对分离培养的nkt细胞表型分析的结果。
图2为本发明的慢病毒表达载体pwpt-cd8-cd137-cd3ζ的限制性内切酶mlui/sali双酶切片段的电泳鉴定图。
图3为本发明的慢病毒表达载体pwpt-her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ的限制性内切酶bamhi/sali双酶切片段的电泳鉴定图。
图4为本发明的慢病毒表达载体pwpt-her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ的结构示意图，其中，逆时针序列为正向基因片度，顺时针为反向基因片段。
图5为流式细胞术检测含有嵌合抗原受体her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ的病毒浓缩液对nkt细胞的感染效率。
图6为流式细胞术检测嵌合抗原受体her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ修饰的nkt细胞(carher2-nkt细胞)表型鉴定的结果。
图7为本发明的carher2-nkt细胞对人实体瘤细胞杀伤作用的细胞毒性分析图。
图8为本发明的carher2-nkt细胞对进展期胆管癌和进展期胰腺癌患者治疗效果的分析图。
图9为本发明的carher2-nkt细胞对进展期胆管癌肝转移患者治疗的影像图变化。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ，包括串联的cd8a信号肽、her2scfv、缩短cd8的铰链区和跨膜区、cd137的胞内信号结构域和cd3ζ的胞内信号结构域。
优选情况下，嵌合抗原受体her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ由cd8a信号肽、her2scfv、缩短cd8的铰链区和跨膜区、cd137的胞内信号结构域和cd3ζ的胞内信号结构域串联构成。进一步优选地，嵌合抗原受体具有如seqidno.1所示的氨基酸序列，更进一步优选地，嵌合抗原受体的氨基酸序列如seqidno.1所示。
本发明提供了编码上述嵌合抗原受体的基因。优选情况下，所述基因具有如seqidno.2所示的核苷酸序列，进一步优选地，编码上述嵌合抗原受体的基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。
本发明提供了含有上述基因的重组表达载体。优选情况下，重组表达载体为慢病毒表达载体。对于慢病毒表达载体没有特别的限定，只要能够与辅助载体共转染包装细胞如293t包装细胞，获得病毒浓缩液及嵌合抗原受体her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ修饰的nkt细胞即可，优选情况下，慢病毒表达载体为pwpt-her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ。
对于慢病毒表达载体pwpt-her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ的制备方法没有特别的限定，可以为本领域技术人员能够想到的各种方法，优选情况下，慢病毒表达载体pwpt-her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ的制备方法包括以下步骤：
(1)从nkt细胞cdna中分别扩增cd8的hinge区和跨膜区、cd137的胞内信号结构域和cd3ζ的胞内信号结构域，并克隆至载体pwpt-gfp中，构建得到pwpt-cd8-cd137-cd3ζ；
(2)合成编码cd8a信号肽和her2scfv的核苷酸序列，并克隆至pwpt-cd8-cd137-cd3ζ中，经测序验证后得到序列正确的pwpt-her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ。
步骤(1)中，对于从nkt细胞cdna中分别扩增cd8的hinge区和跨膜区、cd137的胞内信号结构域和cd3ζ的胞内信号结构域的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种方法，例如可以为rt-pcr法。其中，nkt细胞可以通过分离人静脉血中的单个核细胞，然后进行培养获得。
具体地，得到pwpt-cd8-cd137-cd3ζ的方法可以包括：提取nkt细胞的总rna，逆转录获得nkt细胞cdna，以得到的nkt细胞cdna为模板，利用引物p1(seqidno.11)和p2(seqidno.12)进行pcr扩增获得cd8基因的hinge区和跨膜区(seqidno.3)；利用引物p3(seqidno.13)和p4(seqidno.14)进行pcr扩增获得cd137基因的胞内信号结构域(seqidno.4)；利用引物p5(seqidno.15)和p6(seqidno.16)进行pcr扩增获得cd3ζ基因的胞内信号结构域(seqidno.5)，将获得的pcr产物分别进行双酶切，然后与mlui/sali双酶切后的慢病毒表达载体pwpt-gfp连接。
步骤(2)中，对于合成编码cd8a信号肽和her2scfv的核苷酸序列的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种方法，例如可以通过全基因合成技术合成。
具体地，得到序列正确的pwpt-her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ的方法可以包括：通过全基因合成技术合成编码cd8a信号肽和her2scfv融合基因的核苷酸序列(seqidno.8)，克隆至载体pgsi中，得到pgsi-her2scfv；然后将pgsi-her2scfv进行bamhi/mlui双酶切，与bamhi/mlui双酶切后的步骤(1)得到的重组质粒pwpt-cd8-cd137-cd3ζ连接，经测序鉴定，得到序列正确的pwpt-her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ。其中，cd8a信号肽的核苷酸序列如seqidno.6所示，her2scfv核苷酸序列如seqidno.7所示。
本发明还提供了一种工程化her2靶向性的nkt细胞，所述nkt细胞是由上述嵌合抗原受体her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ修饰的nkt细胞(即carher2-nkt细胞)。
对于工程化her2靶向性的nkt细胞的制备方法没有特别的限定，可以为本领域技术人员能够想到的任何方法，优选情况下，该方法包括：包装携带pwpt-her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ的慢病毒，得到病毒浓缩液；利用得到的病毒浓缩液感染nkt细胞，使nkt细胞表达嵌合抗原受体her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ。
对于包装携带pwpt-her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ编码基因的慢病毒的方法没有特别的限定，可以为本领域技术人员常用的各种方法，优选情况下，将慢病毒表达载体pwpt-her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ与辅助质粒(如pspax2、pmd2.g)共转染293t包装细胞，转染48-72h时收集病毒上清，离心、过滤，在滤液中添加5×peg6000-nacl进行混匀，离心后弃上清，沉淀用0-4℃预冷的无菌pbs溶解，获得病毒浓缩液。
本发明的方法中，还包括通过如下方法制备nkt细胞：
(1)在cd3单克隆抗体、白介素-2和白介素-15存在下，将单个核细胞进行第一阶段培养；
(2)在白介素-2存在下，将所述第一阶段培养的细胞进行第二阶段培养。
优选情况下，所述第一阶段培养的实施方式包括：将单个核细胞培养于第一nkt细胞培养液中，所述第一nkt细胞培养液含有nkt细胞培养基、cd3单克隆抗体、白介素-2和白介素-15；进一步优选地，第一nkt细胞培养液中，所述cd3单克隆抗体的浓度为30-70ng/ml，和/或所述白介素-2的浓度为300-700u/ml，和/或所述白介素-15的浓度为30-70ng/ml。
优选情况下，所述第二阶段培养的实施方式包括：将所述第一阶段培养的细胞培养于第二nkt细胞培养液中，所述第二nkt细胞培养液中含有nkt细胞培养基和白介素-2；进一步优选地，第二nkt细胞培养液中，所述白介素-2的浓度为300-700u/ml。
对于nkt细胞培养基没有特别的限定，可以为本领域常用的各种用于培养nkt细胞的培养基，例如可以为gt-t551培养基。
在制备nkt细胞时，对于第一阶段培养和第二阶段培养的条件没有特别的限定，可以为本领域常用的各种条件，例如可以在30-37℃、饱和湿度为3-6％的co2培养箱中进行培养。本领域技术人员可以对培养的时间进行适应性调整，此为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。
本发明制备得到的nkt细胞中，cd3+细胞平均比率>90％，cd3+cd8+细胞占总cd3+细胞的平均比率>70％；cd3+cd56+细胞占总cd3+细胞的平均比率>15％。
对于感染nkt细胞的方法没有特别限定，可以为本领域常用的各种方法，优选情况下，该方法包括：
(1)在病毒浓缩液、鱼精蛋白和白介素-2存在下，将nkt细胞进行第一阶段感染培养；
(2)在cd3单克隆抗体、白介素-2和白介素-15存在下，将所述第一阶段感染培养的细胞进行第二阶段感染培养。
优选地，所述第一阶段感染培养的实施方式包括：将nkt细胞培养于第三nkt细胞培养液中，所述第三nkt细胞培养液含有nkt细胞培养基、病毒浓缩液、鱼精蛋白和白介素-2；进一步优选地，第三nkt细胞培养液中，所述白介素-2的浓度为300-700u/ml。
优选地，所述第二阶段感染培养的实施方式包括：将所述第一阶段感染培养的细胞培养于所述第一nkt细胞培养液中。第一nkt细胞培养液的具体组成可参见前述相应内容，在此不再赘述。
在感染nkt细胞时，对于第一阶段感染培养和第二阶段感染培养的条件没有特别的限定，可以为本领域常用的各种条件，例如可以在30-37℃、饱和湿度为3-6％的co2培养箱中进行培养。本领域技术人员可以对培养的时间进行适应性调整，此为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。
具体地，感染nkt细胞的方法包括：取1×107-5×107个nkt细胞，弃掉旧的培养液，加入2-4ml新鲜gt-t551培养液，再加入200-400μl病毒浓缩液、2-4μl1×10-6mg/ml鱼精蛋白和终浓度为300-700u/ml的il-2，置于30-37℃、饱和湿度为3-6％的co2培养箱中感染12-16h后，弃培养液，将细胞转至未包被的培养瓶中，加入20-50ml的gt-t551培养基，再加入终浓度为300-700u/ml的il-2、终浓度为30-70ng/ml的cd3单克隆抗体和终浓度为30-70ng/ml的白细胞介素15，于30-37℃、饱和湿度为3-6％的co2培养箱中培养12-18h，获得嵌合抗原受体cd133scfv-cd8-cd137-cd3ζ修饰的nkt细胞。
进一步优选地，感染nkt细胞的方法还包括：
(3)先在白介素-2存在下，将所述第二阶段感染培养的细胞进行体外诱导，待细胞的密度为80-90％时，再在cd3单克隆抗体、白介素-2和白介素-15存在下，将细胞进行扩增培养。
优选情况下，所述体外诱导的实施方式包括：将所述第二阶段感染培养的细胞培养于所述第二nkt细胞培养液中，所述扩增培养的实施方式包括：将细胞培养于所述第一nkt细胞培养液中。第一nkt细胞培养液和第二nkt细胞培养液的具体组成可参见前述相应内容，在此不再赘述。
具体地，感染nkt细胞的方法还包括：将第二阶段感染培养后获得的慢病毒感染的nkt细胞用il-2的终浓度为300-700u/ml的gt-t551培养液进行体外诱导，待细胞的密度为80-90％时将细胞转入细胞培养袋中，隔1.5-2.5天加入il-2的终浓度为300-700u/ml、cd3单克隆抗体的终浓度为30-70ng/ml、白细胞介素-15的终浓度为30-70ng/ml的新鲜gt-t551培养液进行扩增培养并将细胞扩增至总量为1×109-2×109个细胞。经过本发明的慢病毒对靶向her2抗原的嵌合抗原受体进行nkt细胞感染，其感染效率高达30％-60％，而获得的carher2-nkt细胞，其cd3+cd56+细胞占总cd3+细胞的比率在15％-40％范围之内。
嵌合抗原受体her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ修饰的nkt细胞表达的嵌合抗原受体的成熟蛋白氨基酸序列如seqidno.1所示。其中，本领域技术人员应该理解的是，嵌合抗原受体前体蛋白由cd8a信号肽、her2scfv、缩短cd8的hinge区和跨膜区、cd137的胞内信号结构域和cd3ζ的胞内信号结构域串联构成，蛋白质翻译后在细胞内粗面型内质网切除信号肽后成为成熟嵌合抗原受体蛋白，分泌输出后并定位于nkt细胞的细胞膜上。该嵌合抗原受体的成熟蛋白氨基酸序列对应的基因编码序列如seqidno.2所示。该嵌合抗原受体以基因cd8的hinge区和跨膜区及cd137和cd3ζ的胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，其氨基酸序列如seqidno.9所示，对应的基因编码序列如seqidno.10所示。
本发明还提供了上述方法制备得到的工程化her2靶向性的nkt细胞。
本发明还提供了工程化her2靶向性的nkt细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的应用。优选情况下，肿瘤是指her2阳性实体瘤，尤其是指复发难治的her2阳性实体瘤；进一步优选地，肿瘤为胆管癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、食管癌、前列腺癌、胃癌或口腔癌。
本发明的应用中，对于用于治疗her2阳性的肿瘤的制剂的组成没有特别的限定，只要含有本发明所述carher2-nkt细胞或是由carher2-nkt细胞制备而成即可，制剂的具体组成和制备方法为本领域技术人员所熟知，在此不再赘述。
本领域技术人员应该理解的是，上皮肿瘤为胆管癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、食管癌、前列腺癌、胃癌或口腔癌等时，本发明的carher2-nkt细胞能够识别her2阳性的肿瘤细胞，并发挥靶向杀伤活性，从而对her2阳性上皮瘤均有杀伤作用。
实施例
以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到，其中：
nkt细胞培养基gt-t551购自takara公司。
淋巴细胞分离液购自tbd公司。
重组纤维连接蛋白(retronectin)购自takara公司。
cd3、cd4、cd8、cd56单克隆抗体均购自bd公司。
重组人蛋白干扰素-γ、重组人白介素2、重组人白介素15购自protech公司。
总rna提取试剂盒rnaisoreagent、高保真dna聚合酶(
revertaidtmfirststrandcdnasynthesiskit购自fermentas公司。
bglⅱ、ecori、mlui、bamhi、sali购自fermentas公司。
琼脂糖凝胶dna回收试剂盒、普通dna产物纯化试剂盒、质粒小提试剂盒均购自天根生化科技有限公司。
pwpt-gfp、pspax2、pmd2.g均购自addgene公司。
pgsi购自北京天一辉远生物科技有限公司。
trans1-t1phageresistant化学感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。
lipofectaminetm2000transfectionreagent转染试剂购自invitrogen公司。
293t包装细胞购自美国atcc。
peg6000-nacl中peg6000终浓度为25.5质量％，nacl终浓度为1.2m，peg6000和nacl均购自上海索莱宝生物科技有限公司。
胎牛血清购自德国paa公司。
her2阳性的人乳腺癌细胞skbr3、人胃癌细胞sgc-7901、人卵巢癌细胞skov-3、不表达her2的hela细胞均购自美国atcc。
cellcountingkit-8(cck8)试剂盒购自北京沃比森科技有限公司。
所有引物均由北京天一辉远生物科技有限公司合成。
实施例1nkt细胞的制备
(1)取人静脉血于含肝素的真空管中。采用淋巴细胞分离液，通过密度梯度离心方法分离获得单个核细胞(pbmcs)。
(2)pbmcs洗三次后，采用含有0.6体积％的人自体血清的nkt细胞培养基gt-t551调整细胞终浓度为2×106个细胞/ml；将细胞接种于预先经过终浓度为10μg/ml的retronectin包被的75cm2细胞培养瓶中。然后在培养基里加入终浓度为500u/ml的重组人白介素2、50ng/mlcd3单克隆抗体和50ng/ml的重组人白介素-15，在37℃、饱和湿度为5％的co2培养箱中培养。
(3)培养第4天，将细胞转移至未包被的培养瓶中，每2天按照细胞生长数量加入nkt细胞培养基gt-t551，控制细胞浓度为1×108个细胞/ml，并加入终浓度为500u/ml的重组人白介素2；培养至第12天，得到nkt细胞，流式细胞术对nkt细胞表型进行分析。结果见图1，其中cd3+：95.04％；cd3+cd8+：90.99％；cd3+cd56+：24.12％；cd8+cd56+：24.63％。
实施例2慢病毒表达载体pwpt-her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ的构建
(1)nkt细胞cdna的制备
离心沉淀实施例1培养得到的nkt细胞，用总rna提取试剂盒rnaisoreagent提取细胞的总rna，-80℃保存备用。提取的总rna用逆转录试剂盒revertaidtmfirststrandcdnasynthesiskit逆转录得nkt细胞cdna，-20℃保存备用。
(2)慢病毒质粒pwpt-cd8-cd137-cd3ζ的制备
设计并合成如下引物序列(其中，下划线标记为保护碱基，方框为酶切位点)：
以步骤(1)中nkt细胞cdna为模板，用引物p1和p2进行pcr扩增，得到长227bp的cd8的hinge区和跨膜区，核苷酸序列如seqidno.3所示，两端分别含有mlui和bglⅱ酶切位点和保护碱基；用引物p3和p4进行pcr扩增，得到长146bp的cd137胞内信号结构域，核苷酸序列如seqidno.4所示，两端分别含有bglⅱ和ecori酶切位点及保护碱基；用引物p5和p6进行pcr扩增，得到长359bp的cd3ζ的胞内信号结构域，核苷酸序列如seqidno.5所示，两端分别含有ecori和sali酶切位点及保护碱基。各步pcr扩增反应体系相同，以扩增cd137胞内信号结构域为例，进行pcr扩增，pcr反应条件参照
双蒸水：32.5μl
5×反应buffer：10μl
dntp混合物(每种2.5mm)：4μl
p3(10mm):1μl
p4(10mm):1μl
nkt细胞cdna(200ng/ul)：1μl
将上述pcr产物用1％的琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒进行dna片段回收。得到片段后分别进行双酶切反应，酶切产物用普通dna产物纯化试剂盒回收备用。
慢病毒表达载体pwpt-gfp用mlui/sali双酶切，酶切产物经1％的琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收大的载体片段，然后与之前回收的cd8、cd137、cd3ζ片段通过t4dna连接酶连接，连接产物转化trans1-t1phageresistant化学感受态细胞，37℃培养16h后挑取单克隆，37℃，250rpm培养12h后用质粒小提试剂盒提取质粒。提取的质粒经限制性内切酶mlui和sali双酶切鉴定，鉴定电泳图见图2，其中，m1：dna分子量标记d4500；1泳道：质粒pwpt-cd8-cd137-cd3ζ的未酶切片段；2泳道：质粒pwpt-cd8-cd137-cd3ζ的酶切片段(672bp)；m2：dna分子量标记d2000。将鉴定正确的质粒送北京天一辉远生物科技有限公司对插入的融合基因片段进行测序。将测序结果正确的重组质粒命名为pwpt-cd8-cd137-cd3ζ,，其中，cd8的hinge区和跨膜区的核苷酸序列如seqidno.3所示，cd137的胞内信号结构域的核苷酸序列如seqidno.4所示，cd3ζ的胞内信号结构域的核苷酸序列如seqidno.5所示。
(3)慢病毒质粒pwpt-her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ的制备
全基因合成编码cd8a信号肽和her2scfv融合基因的核苷酸序列，序列如seqidno.8所示，由北京天一辉远生物科技有限公司合成，其5’端含有bamhi、kozak序列，3’端含有mlui酶切位点，将前述融合基因克隆在质粒pgsi中，命名为pgsi-her2scfv。质粒经bamhi/mlui双酶切，酶切产物经1％琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收目的片段备用。
pwpt-cd8-cd137-cd3ζ质粒经限制性内切酶bamhi/mlui酶切，酶切产物经1％琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收载体片段备用。然后与回收的含有cd8a信号肽和her2scfv的dna片段通过t4dna连接酶进行连接，具体方法见说明书。将连接产物转化trans1-t1phageresistant化学感受态细胞，37℃培养16h后挑取单克隆，37℃，250rpm培养12h后，用质粒小提试剂盒提取质粒。提取的质粒经限制性内切酶bamhi/sali双酶切鉴定，鉴定结果如图3所示，其中，1泳道：质粒pwpt-her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ的酶切片段(1485bp)；2泳道：质粒pwpt-her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ未酶切片段(10114bp)；m2：dna分子量标记d2000。将鉴定正确的质粒送北京天一辉远生物科技有限公司对插入的融合基因片段进行测序。将测序结果正确的重组质粒命名为pwpt-her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ，其结构示意图如图4所示，其中包括cd8a信号肽(核苷酸序列如seqidno.6所示)、抗her2单链抗体(核苷酸序列如seqidno.7所示)、cd8的hinge区和跨膜区及cd137的胞内信号结构域和cd3ζ的胞内信号结构域，其中，该嵌合抗原受体以基因cd8的hinge区和跨膜区及cd137和cd3ζ的胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，其氨基酸序列如seqidno.9所示，对应的基因编码序列如seqidno.10所示。
实施例3嵌合抗原受体her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ修饰的nkt细胞的制备
(1)慢病毒的包装和浓缩
用分光光度计分别测定慢病毒表达质粒pwpt-her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ和辅助质粒pspax2、pmd2.g的浓度，三种质粒以4:2:1的质量比用lipofectaminetm2000transfectionreagent转染试剂共转染293t包装细胞。分别在转染48h、72h时收集病毒上清于50mlep管中，4℃，2000g离心10min，转移两次得到的上清至新ep管中，用4.5μm滤器过滤病毒上清；过滤的病毒上清与5×peg6000-nacl按照4:1的体积比混匀，4℃静置2h，然后4℃，10000g离心20min，弃上清，沉淀用1ml的4℃预冷的无菌pbs溶解，即得嵌合抗原受体的病毒浓缩液，按每管100μl进行分装，-80℃保存备用。
按照上述方法，利用慢病毒表达质粒pwpt-gfp和辅助质粒pspax2、pmd2.g共转染293t包装细胞，收集病毒上清，浓缩，获得表达gfp绿色荧光蛋白的慢病毒浓缩液。
(2)慢病毒感染nkt细胞及感染后细胞的扩增培养
取实施例1的在75cm2培养瓶中培养的1×107个nkt细胞，弃掉旧的培养液，加入2ml新鲜nkt细胞培养基gt-t551、200μl步骤(1)得到的病毒浓缩液、2μl1×10-6mg/ml鱼精蛋白，终浓度为500u/ml的重组人白介素2，置于37℃、饱和湿度为5％的co2培养箱中感染12小时后，弃培养液。同时用表达gfp绿色荧光蛋白的慢病毒浓缩液对nkt细胞进行同步感染(得到的nkt细胞称为cart-gfp细胞)，用于计算该病毒的感染效率。将感染后的细胞转至未经cd3和retronectin包被的75cm2培养瓶中，加入20ml的nkt细胞培养基gt-t551，再加入终浓度为500u/ml的重组人白介素2、终浓度为50ng/ml的cd3单克隆抗体和终浓度为50ng/ml的重组人白介素15，于37℃、饱和湿度为5％的co2培养箱中培养18h，得到的nkt细胞称为carher2-nkt细胞。按照cn105384823a中公开的方法制备car33-nkt细胞作为mock细胞。用流式细胞术检测该病毒的感染效率，结果如图5所示，carher2-nkt细胞的感染效率为55.32％。
(3)体外诱导扩增carher2-nkt细胞群
将上述培养后的nkt细胞用重组人白介素2的终浓度为500u/ml的nkt细胞培养基gt-t551进行体外诱导，待细胞的密度为85％时将细胞转入细胞培养袋中，隔2天加入重组人白介素2的终浓度为500u/ml、cd3单克隆抗体的终浓度为50ng/ml、重组人白介素15的终浓度为50ng/ml的新鲜nkt细胞培养基gt-t551进行扩增培养，待细胞扩增到总量为1.5×109个细胞左右后，采用流式细胞仪对感染的细胞群体进行鉴定，细胞表型一般达到cd3阳性细胞比例＞90％；cd3cd8阳性细胞比例>70％；cd3cd56双阳性细胞比例>15％，结果见图6，cd3+:95.43％；cd3+cd8+:82.44％；cd3+cd56+:20.65％；cd8+cd56+:19.97％。
实施例4carher2-nkt细胞对人肿瘤细胞杀伤作用的细胞毒性分析
分别取her2阳性的人乳腺癌细胞skbr3、人胃癌细胞sgc-7901、人卵巢癌细胞skov-3及不表达her2的hela细胞接种于96孔板，37℃培养箱培养过夜后，取实施例3中制备的carher2-nkt细胞、car33-nkt细胞和实施例1中培养的nkt细胞，以效靶比(杀伤细胞：靶细胞)1:1，5:1，10:1，20:1与上述her2阳性的人乳腺癌细胞skbr3、人胃癌细胞sgc-7901、人卵巢癌细胞skov-3及不表达her2的hela细胞进行共培养，经过4h的共培养后，每个孔加入10μl的cck8进行染色。同时设置杀伤细胞对照组分别为实施例3中制备的carher2-nkt细胞、car33-nkt细胞和实施例1中培养的nkt细胞，并加入相同量的cck8进行染色；以及设置靶细胞对照组为未加入免疫细胞杀伤处理的人乳腺癌细胞skbr3、人胃癌细胞sgc-7901、人卵巢癌细胞skov-3及hela细胞，并加入相同量的cck8进行染色。酶标仪对细胞凋亡情况进行检测，细胞凋亡的量根据下面的公式计算：凋亡率＝{1-[(实验组-杀伤细胞对照组-靶细胞对照组)/实验组]}×100％，该公式中，杀伤细胞对照组为只有杀伤细胞而未加靶细胞测得的吸光值，靶细胞对照组为只有靶细胞而未加杀伤细胞测得的吸光值；实验组为加入相对应的效靶比(杀伤细胞：靶细胞)的免疫细胞杀伤处理后测得的吸光值，见图7。结果表明嵌合抗原受体her2scfv-cd8-cd137-cd3ζ修饰的nkt细胞对her2阳性的肿瘤细胞具有特异杀伤活性，且carher2-nkt细胞的特异杀伤活性明显优于nkt细胞和mock细胞(car33-nkt细胞)。
实施例5本发明的carher2-nkt细胞对her2阳性的上皮肿瘤(以胆管癌和胰腺癌为代表)患者治疗效果
取carher2-nkt细胞，经过100ml生理盐水稀释后，连续三天以剂量递增的形式静脉回输到her2阳性的进展期胆管癌和胰腺癌患者(在利用本发明的carher2-nkt细胞进行靶向免疫治疗前，已经过多次治疗(如放疗、化疗及其他药物对症治疗等)，但均无明显疗效)体内，连续三天细胞回输总量为0.8×107/kg，回输后对患者的治疗状况进行评估。
表1为carher2-nkt细胞治疗进展期胆管癌和进展期胰腺癌患者的毒副反应分析图，分别显示了预处理化疗阶段的不良反应，细胞输注阶段的不良反应和细胞回输后的延迟不良反应。如表1所示，患者输注引起的血液系统的毒副反应主要为轻微的贫血和血小板水平的降低，毒副反应较低，患者可耐受；其他毒副反应如回输相关的高热、疲劳、寒战、乏力等，患者耐受性良好，通过给予解热镇痛制剂得以缓解。
表1
图8为11例胆管癌和胰腺癌患者的治疗反应图，其中，一位患者治疗第一周期后疾病出现完全缓解\部分缓解；5位患者治疗第一周期后疾病稳定；剩余5例患者治疗后疾病进展。说明car133-nkt细胞对胆管癌和胰腺癌患者有一定的治疗效果。
图9为carher2-nkt细胞对进展期胆管癌肝转移患者的治疗效果图，由图9可知，与治疗前基线相比，治疗四周后胆管癌患者肝转移病灶明显缩小。说明carher2-nkt细胞对胆管癌患者有一定的治疗效果。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
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<110>广州百尼夫生物技术有限公司
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