本发明涉及食用菌种质鉴定技术领域，尤其涉及一种赤灵芝菌株鉴定方法。
背景技术：
灵芝在分类系统上隶属于真菌门(Eumycota)，担子菌亚门(Basidiomycotina)、层担子菌纲(Hymenomycetes)，无隔担子菌亚纲(Holobasidiomycetidae)、非褶菌目(Aphyllophorales)、灵芝菌科(Ganodermataceae)、灵芝属(Ganoderma)。赤灵芝学名为(Ganoderma lucidum(Leyss.ex.Fr.)Karst)。
对于赤灵芝菌种的鉴定，传统的鉴定方法主要是依赖于形态学观察，包括对灵芝子实体的形、色、气、味、质地等外观形状观察等。该方法简便易行，但主观性强，准确性完全依赖于检测者的经验判断。
从分子遗传学角度来看，物种表现型的差异归根结底应追溯到基因型的差异，即在DNA序列上的差异。后来出现了基于DNA序列的分子标记技术，常用的DNA分子标记技术包括RFLP、RADP、SSR、ISSR、AFLP等。DNA的分子标记技术可以弥补和克服传统鉴定方法的一些缺陷，在赤灵芝菌种的鉴定中也取得了良好的应用效果。
但是，现有的分子标记技术主要集中对特征序列的扩增及测序，而利用特征序列仅可以确定灵芝的种属。然而由于属于同一物种，当面对需要对赤灵芝的不同菌种进行鉴定时，现有的分子标记技术并不能满足需求。因此，进一步开发能够用于赤灵芝不同菌株的鉴定方法十分必要。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种赤灵芝菌株鉴定方法。利用存在于ITS1序列中的SNP位点，本发明提供的方法能够将赤灵芝菌种203与其他菌种区分，准确率可达100％。
本发明提供了ITS1序列的SNP位点在赤灵芝菌株鉴定中的应用；
ITS1序列的SNP位点位于ITS1序列5’端的第180位核苷酸。
本发明中，赤灵芝菌株为赤灵芝203。
本发明中，ITS1序列5’端的第180位核苷酸为T则所述赤灵芝菌株为赤灵芝203。
本发明中，利用ITS1序列SNP位点能够区分的赤灵芝菌株为赤灵芝203(Ganoderma lucidum 203)，东北赤灵芝(Ganoderma lucidum DB)，金寨乔康赤灵芝(Ganoderma lucidum JQ)，日本赤灵芝(Ganoderma lucidum RB)。
ITS序列是内源转录间隔区(Internally Transcribed Spacer)，位于真菌18S、5.8S和28S rRNA基因之间，分别为ITS 1和ITS 2。本发明的通过提取赤灵芝菌种及其制品的DNA，对ITS全长序列进行扩增及测序，将测序得到的ITS序列依据隐马尔科夫模型(Hidden Markov Models)使用HMMER suite软件进行比对注释，得到ITS1序列全长。将注释得到的ITS1序列在本地用DNAMAN软件比对。如果该ITS1序列从5’端开始的第180位为T则为赤灵芝菌种203，如果为C则不是该菌株。经分析，赤灵芝203菌种ITS1序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明还提供了由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物组成的引物组。
本发明提供的引物组能够对ITS序列进行全长扩增。然后通过分析其中ITS1序列中的SNP位点，从而实现对赤灵芝203菌种的鉴定。
所述引物组的退火温度为54℃。
本发明提供的引物组在制备鉴定赤灵芝菌株的产品中的应用。
本发明还提供了一种鉴定赤灵芝菌株的试剂盒，包括由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物组成的引物组。
本发明提供的试剂盒还包括PCR反应试剂。
所述PCR反应试剂包括Taq酶，dNTP，Mg2+、扩增缓冲液、ddH2O。
所述PCR反应试剂可混合，也可为混合试剂。优选为混合试剂。更优选，混合试剂中还包括DNA染色剂。优选的，DNA染色剂为Loading Dye。
本发明还提供了一种鉴定赤灵芝菌株的方法，以由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物组成的引物组对待测样品的DNA进行扩增，根据扩增所得片段的SNP位点判断赤灵芝的菌株种类；
扩增所得片段的SNP位点位于其5’端的第180位核苷酸。
本发明中判断具体为：所述扩增所得片段5’段第180位为T则待测样品来自赤灵芝203。
本发明提供的方法中对SNP位点基因型的鉴定可通过测序完成，也可通过采用特定酶切位点的酶切，然后观察所得片段对不同SNP位点基因型进行分辨。在本发明实施例中，采用测序对SNP位点的基因型进行鉴定。
本发明中提供方法能够区分的赤灵芝菌株为赤灵芝203(Ganoderma lucidum 203)，东北赤灵芝(Ganoderma lucidum DB)，金寨乔康赤灵芝(Ganoderma lucidum JQ)，日本赤灵芝(Ganoderma lucidum RB)。
如果该ITS1序列从5’端开始的第180位为T则样品含有赤灵芝203，如果为C则样品不含有赤灵芝203。
本发明所述待测样品包含赤灵芝菌丝体、赤灵芝孢子粉和/或赤灵芝子实体。
所述赤灵芝菌丝体、赤灵芝孢子粉和/或赤灵芝子实体可为新鲜样品也可经干燥或炮制。所述待测样品可仅为赤灵芝菌丝体、赤灵芝孢子粉和/或赤灵芝子实体；也可为包含赤灵芝菌丝体、赤灵芝孢子粉和/或赤灵芝子实体成分的物质。
SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物的工作浓度为10μmol/L。
SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物的工作浓度为10μmol/L。
所述扩增的体系包括：
所述扩增的程序为
待测样品的DNA的提取方法采用CTAB法。
具体的，对样品DNA提取的方法包括：
步骤1：样品以液氮研磨后，与CTAB溶液混合，室温25℃下处理60min后，冷却至室温；
步骤2：加入氯仿与异戊醇混合液(体积比24:1)，混匀后12000rpm/min离心10min；
步骤3：取上清液加入等体积无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000rpm/min离心10min，取沉淀；
步骤4：沉淀以体积分数为70％的乙醇水溶液洗涤后，晾干，以ddH2O溶解。
本发明提供了ITS1序列上SNP位点在在赤灵芝菌株鉴定中的应用，并提供了相应的引物、试剂盒和鉴定方法。本发明提供的鉴定方法简单，仅需一对引物对ITS序列进行全长扩增后，对扩增后片段的SNP位点进行鉴定即可有效鉴定赤灵芝203菌种及其相关制品，准确率可达100％。
附图说明
图1示不同赤灵芝菌种的ITS1序列比对图。
具体实施方式
本发明提供了一种赤灵芝菌株鉴定方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的材料、仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
取赤灵芝饮片，能够明确其中赤灵芝203 1份、东北赤灵芝1份、金寨乔康赤灵芝1份、日本赤灵芝1份。
1、分别提取DNA，并对各份DNA标记原始来源后，进行鉴定，每份样
品重复10次。具体方法为：
用去离子水冲洗样品三次，倒入液氮后研磨，磨碎后将样品转入含有CTAB溶液的离心管中，加热处理60min。冷却到室温后，加入氯仿/异戊醇(24:1)溶液，颠倒混匀后，12000rpm/min离心10min。将上清液转移至新的离心管中，按照体积比1:1加入无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000rpm/min离心10min。倒掉无水乙醇，加入0.5mL 70％的乙醇溶液，上下颠倒几次后将乙醇倒掉，室温晾干30min以上。加入50μL ddH2O，吸打混匀。
2、ITS序列的扩增、注释和比对
PCR反应体系的组成：
2.5μL模板DNA(含30ng DNA)，
25μL2×PCR MasterMix(含电泳Loading Dye，天根公司)
2.5μL引物ITS1F(5’-CTTGGTCATTTTAGAGGAAGTAA-3’,10μmol/L)，
2.5μL引物ITS4B(5’-CAGGAGACTTGTACACGGTCCA-3’,10μmol/L)，
用ddH2O将总体积补至50μL。
PCR扩增反应程序：
94℃预变性5min，94℃变性50s，54℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环，72℃延伸10min。
PCR产物直接送华大公司测序。
使用HMMER suite软件对公司测序得到的ITS序列全长进行ITS 1注释。将注释得到的ITS1序列在本地用DNAMAN软件注释。如果该ITS1序列从5’端开始的第180位为T则为赤灵芝203菌种，如果为C则不是该菌种(图1)。
10次重复鉴定结果皆显示，四种饮片均为赤灵芝，其中赤灵芝203 1份、东北赤灵芝1份、金寨乔康赤灵芝1份、日本赤灵芝1份，203能与其它灵芝有效区分。检测结果与样品实际情况完全相符，准确率为100％。
实施例2
取赤灵芝孢子粉，能够明确其中赤灵芝203 1份、东北赤灵芝1份、金寨乔康赤灵芝1份、日本赤灵芝1份。
1、分别提取DNA，并对各份DNA标记原始来源后，进行鉴定，每份样品重复10次。DNA的提取方法与实施例1相同。
2、ITS序列的扩增、注释和比对
PCR反应体系、反应程序也与实施例1相同。
PCR产物直接送华大公司测序。
使用HMMER suite软件对公司测序得到的ITS序列全长进行ITS 1注释。将注释得到的ITS1序列在本地用DNAMAN软件注释。如果该ITS1序列从5’端开始的第180位为T则为赤灵芝203菌种，如果为C则不是该菌种。
10次重复鉴定结果皆显示，赤灵芝孢子粉中赤灵芝203 1份、东北赤灵芝1份、金寨乔康赤灵芝1份、日本赤灵芝1份。检测结果与样品实际情况完全相符，准确率为100％。
实施例3
取赤灵芝菌丝体，能够明确其中赤灵芝203 1份、东北赤灵芝1份、金寨乔康赤灵芝1份、日本赤灵芝1份。
1、赤灵芝菌丝体的分离方法为
采收生长至八月份新鲜的不同品种赤灵芝子实体，于超净台中分离菌丝，将分离菌丝放置在已灭菌的PDA平板上，28℃培养15天。挑选菌丝生长良好的PDA平板，将菌种转至PDA斜面培养基上，28℃培养15天，挑选生长良好的试管，放置在4℃冰箱保藏，每4～6个月活化传代一次。另取菌丝生长良好的PDA平板，用1cm直径的打孔器打孔，将菌块转至PDA液体培养基中，28℃150μrpm/min，震荡培养15天。将培养好的菌丝体抽滤，并用去离子水冲洗三次。
2、分别提取各菌丝体的DNA，并对各份DNA标记原始来源后，，进行鉴定，每份样品重复10次。DNA的提取方法与实施例1相同。
3、ITS序列的扩增、注释和比对
PCR反应体系、反应程序也与实施例1相同。
PCR产物直接送华大公司测序。
使用HMMER suite软件对公司测序得到的ITS序列全长进行ITS 1注释。将注释得到的ITS1序列在本地用DNAMAN软件注释。如果该ITS1序列从5’端开始的第180位为T则为赤灵芝203菌种，如果为C则不是该菌种。
10次重复鉴定结果皆显示，赤灵芝菌丝体中赤灵芝203 1份、东北赤灵芝1份、金寨乔康赤灵芝1份、日本赤灵芝1份。检测结果与样品实际情况完全相符，准确率为100％。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 无限极（中国）有限公司
<120> 一种赤灵芝菌株鉴定方法
<130> MP1619195
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cttggtcatt ttagaggaag taa 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caggagactt gtacacggtc ca 22
<210> 3
<211> 199
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcgagttttg accgggttgt agctggcctt ccgaggcatg tgcacgccct gctcatccac 60
tctacacctg tgcacttact gtgggcttca gattgcgagg cacgctcttt accgggcttg 120
cggagcatat ctgtgcctgc gtttatcaca aactctataa agtaacagaa tgtgtattgt 180
gatgtaacac atctatata 199