一株具解磷促生能力的不动杆菌属细菌NJAU-3及其应用的制作方法

本发明属于农业微生物领域，具体涉及一株有效促进作物生长的具解磷能力的不动杆菌属促生细菌NJAU-3及其研制的生物育苗基质。

背景技术：

磷是限制植物生长的主要营养元素之一，施入的磷肥当季作物利用率为5％～25％。大部分磷与土壤中的Ca²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Al³⁺结合，形成难溶性磷酸盐(Abd-Alla M H,1994)，因而大部分磷肥以难溶的无效态在土壤中积累。植物根际促生菌(Plant Growth-Promoting Rhizobacteria,PGPR)指生存于植物根际、根表并能直接或间接地促进与调节植物生长的微生物(Ahmad et al,2008)，其中解磷细菌能够将难溶性磷酸盐，如磷矿粉中的磷转化为水溶性态，从而供植物吸收利用(朱颖等，2009)。该类细菌既能活化土壤中难溶性磷素，还可以通过影响植物根系分泌物的种类和数量，增加植物根系对周围K、Ca、Mg、Fe、Zn等营养元素的吸收，提高植物的抗逆性，使植物能够在酸性、缺磷等胁迫生境下生长。

因此，有必要从自然条件下的植株根际筛选高效解磷菌株，并制成解磷微生物有机肥，以在提供营养的同时活化土壤中难溶性磷素，促进农作物对磷的吸收。

申请人前期筛选到一株不动杆菌属解磷促生细菌Y40，并申请了专利CN104974962A。该菌株分离于马铃薯根际，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年12月25日，保藏编号为CGMCC NO.10241。摇瓶实验结果表明，菌株能够有效降低溶液pH并溶解溶液中难溶性磷；灌菌盆栽试验结果表明，该菌株能够有效促进番茄和茄子植株的生长，同时菌株能够在植株根际大量定殖，存活于根际发挥促生作用。但是该细菌对茄科植物如番茄、茄子等植物具有较好的促生作用，但对葫芦科植物如黄瓜的促生作用并不理想。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，提供一株具有解磷能力的不动杆菌属促生细菌。

本发明的另一目的是提供该细菌制备的育苗基质及其应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一株用于促进作物生长的促生菌株NJAU-3，菌株分离自河北玉米大田根际土壤，分类命名为不动杆菌(Acinetobacter sp.)属细菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年5月9日，保藏编号为CGMCC No.12423。

菌株NJAU-3在LB平板上的菌落较小，呈淡黄色，并能产生黄色色素，边缘平滑，具有一定的黏性，不易挑起(图1)。在显微镜下所观察到的营养体细胞，革兰氏染色阴性，菌体着色均匀，呈球杆状，两端钝平，呈不规则形状。淀粉水解反应，V.P反应，接触酶反应，利用柠檬酸盐反应，甲基红反应，明胶液化反应均呈阳性，葡萄糖，阿拉伯糖，葡萄糖酸盐，癸酸，己二酸，苹果酸，苯乙酸利用均呈阳性。7％NaCl生长。用NJAU-3菌株的16S rDNA序列(登录号为KX611128)所构建发育树表明，菌株NJAU-3与醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)(AJ888983)同源性达到99.9％。结合菌株的形态特征、理化特征并结合16S rDNA序列分析，将菌株NJAU-3初步鉴定为不动杆菌属细菌(图2)。

本发明所述不动杆菌属细菌NJAU-3在解无机磷或促进黄瓜生长中的应用。

本发明所述不动杆菌属细菌NJAU-3在制备促进黄瓜生长的育苗基质中的应用。

由本发明所述不动杆菌属细菌NJAU-3制备的生物育苗基质。

所述的生物育苗基质优选主要通以下方法制备：将保藏号为CGMCC No.12423的不动杆菌属细菌NJAU-3接种到LB液体培养基中，进行液体发酵生产，发酵生产的条件为：pH 7.0，发酵温度范围30～35℃，转速为170r/min，发酵时间为48h，使发酵液中含菌量≥1×10⁹CFU/mL。所用LB培养液配制方法为，以配制1L培养基为例：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂20g，定容至1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。

所述的育苗基质进一步优选将得到的发酵液按照常规方法制备为其他生物肥料常用剂型，优选制备为粉剂。

本发明所述的生物育苗基质在解无机磷和促进黄瓜生长的应用。

所述的促进黄瓜生长应用，优选将所述的发酵液将按5％(体积质量比)添加至普通育苗基质中，混合均匀。

有益效果：

本发明主要利用分离筛选出的能够解无机磷和根际有效定殖的不动杆属细菌NJAU-3的施用，显著提高黄瓜植株的生长，促进作物对土壤中养分的吸收利用，从而促进作物生长。本发明促生菌NJAU-3在两季育苗试验中表现出的稳定促生。

附图说明

图1菌株NJAU-3、Y40的形态、理化特征的比较

图2基于菌株NJAU-3的16S rDNA基因序列采用邻接法建立的系统发育树

图3第一季黄瓜育苗效果图

图4第二季黄瓜育苗效果图

生物材料保藏信息

菌株NJAU-3，分类命名为不动杆菌Acinetobacter sp，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2016年5月9日，保藏编号为CGMCC No.12423。

具体实施方式

实施例1、功能菌株的分离及鉴定

将玉米根在自来水下轻轻冲洗2min，去掉根际表面黏着土。然后用无菌水冲洗干净，将根剪下，加入带玻璃珠并装有100mL无菌水的250mL锥形瓶中，25℃、170r/min振荡20min形成土壤悬液，分别吸取10^-2、10^-3、10^-4、10^-5稀释倍数的土壤悬液0.1mL，涂布于无机磷培养平板上，每个浓度3个重复，28℃培养5天后，在平板上挑选周围产生溶磷圈的菌落纯化5次以上，选取仍然有溶磷圈的菌落转至斜面培养，4℃保藏备用。

将纯化后的菌种接种于改良的PVK培养基上，置于30℃培养箱培养7天以后，测量透明圈和菌落直径，并计算出透明圈和菌落直径的比值(D/d值)。

选择透明圈直径较大或其与菌落直径比值较大菌株，接种到NBRIP培养基中，30℃、170r/min培养，48h取样测定培养液中有效磷浓度，7天后，测定培养液中有效磷和全磷含量，设不接菌对照，处理与对照均设3个重复。

其中所用分离培养基(改良后的PVK培养基)配制方法为，以配制1L培养基为例：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，硫酸镁0.3g，氯化钠0.3g，氯化钾0.2g，硫酸铁0.03g，硫酸锰0.03g，磷酸三钙5g，蒸馏水1000mL，pH 6.5～7.0。115℃灭菌30min。

所用筛选培养基采用国际植物研究所磷酸盐生长培养基(NBRIP)配制方法为，以配制1L培养基为例：葡萄糖10g，磷酸三钙5g，氯化镁5g，硫酸镁0.25g，氯化钾0.2g，硫酸铵0.1g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。115℃灭菌30min。

通过定性和定量筛选最终获得一株细菌命名为NJAU-3，菌株NJAU-3在LB平板上的菌落较小，呈淡黄色，并能产生黄色色素，边缘平滑，具有一定的黏性，不易挑起。革兰氏染色阴性，菌体着色均匀。D-果糖、麦芽糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖利用均呈阳性，发酵葡萄糖产酸不产气，7％NaCl生长。用NJAU-3菌株的16S rDNA序列(登录号为KX611128)所构建发育树表明，菌株NJAU-3与醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)(AJ888983)同源性达到99.9％。结合菌株的形态特征、理化特征和16S rDNA序列分析，将菌株NJAU-3初步鉴定为不动杆菌属细菌。将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12423。申请人前期申请了专利CN104974962A，在其中公开了一株不动杆菌属解磷促生细菌Y40，从图2系统发育树可以看出两种细菌并不属于同种，从表1和图也可看出两种细菌在形态和功能方面也相差很大。

表1

实施例2、功能菌菌悬液的产生

将-80℃甘油管保存的NJAU-3菌种于LB固体培养基平板划线活化，37℃培养箱培养12小时。挑取NJAU-3单菌落于3ml液体LB试管，37℃，170r min^-1震荡培养10小时，菌液作为种子液。以1％(v/v)的接种量将NJAU-3种子液转接至液体LB摇瓶中，37℃，170r min^-1培养至对数中期(OD600＝1.0)，4℃离心收集菌体，菌体用蒸馏水洗涤3次，等体积蒸馏水重悬备用。

所用LB培养液配制方法为，以配制1L培养基为例：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂20g，定容至1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。。

实施例3、生物育苗基质在黄瓜(第一季、第二季)上的应用效果

生物育苗基质育苗试验在国家有机类肥料工程技术研究中心温网室内进行，黄瓜品种为新津研7号，将黄瓜种子浸泡在常温水中4h，放置在湿润的纱布上于30℃培养箱中催芽1～2d，待75％以上种子萌发后，选取露白的种子移至育苗盘育苗。试验设置三个处理：1)CK，只施用蒸馏水；2)处理NJAU-3，施用NJAU-3的菌悬液；3)处理Y40，施用Y40的菌悬液。每个处理15颗苗，每个育苗盘装300g育苗基质，菌悬液的添加量均为5％(质量百分比，以300g育苗基质为基准)，常规管理，20d左右后测量植株的生理指标。

第一季黄瓜促生效果如图3、生物量情况如表2所示，育苗培养20d后，施用NJAU-3菌悬液(NJAU-3)后使得黄瓜植株的株高、茎粗均显著高于单施蒸馏水(CK)处理(p<0.05)。与CK相比，施用NJAU-3菌悬液处理在株高、茎粗、地上部鲜重和地下部鲜重方面分别增加了10.53％、38.56％、41.73％、107.70％。施用Y40菌悬液(Y40)后使得黄瓜植株的株高、茎粗、地上部鲜重、地下部鲜重与单施蒸馏水(CK)处理相比均高于对照，但无显著差异(p<0.05)。

第二季黄瓜促生效果如图4、生物量情况如表3所示，育苗培养20d后，施用NJAU-3菌悬液后使得黄瓜植株的株高、茎粗、地上部鲜重均显著高于单施蒸馏水(CK)、(p<0.05)。与CK相比，施用NJAU-3菌悬液的处理在株高、茎粗、地上部鲜重、地下部鲜重、分别增加了16.79％、31.12％、46.34％、37.2％。施用Y40菌悬液(Y40)后使得黄瓜植株的株高、茎粗、地上部鲜重、地下部鲜重与单施蒸馏水(CK)处理相比均高于对照，但无显著差异(p<0.05)。

综上两季育苗结果表明，施用NJAU-3菌悬液处理与蒸馏水(CK)处理的黄瓜株高、茎粗、地上部鲜重、地下部鲜重之间差异明显，说明NJAU-3对黄瓜有明显的促生效果。

表2、第一季黄瓜促生育苗试验生物量情

注：CK，未接菌空白对照。表中数据表示平均值±标准偏差。下同。

表3、第二季黄瓜育苗促生试验生物量情况