一种用于表观遗传分析的设备和方法与流程

本发明涉及表观遗传学技术领域，具体为一种用于表观遗传分析的设备和方法。

背景技术：

表观遗传(epigenetics)是指DNA序列不发生变化，但基因表达却发生了可遗传的改变。这种改变是细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质发生的改变，且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递。用于表观遗传测试的当前方法涉及全分子分析。结果代表来自遗传物质的多个拷贝的复合信号，这不同于单分子分析。组蛋白修饰通常使用染色质免疫沉淀反应(ChIP)来探测，在ChIP中，修饰特异性抗体用于免疫沉淀相关的DNA，该DNA然后通过杂交至微阵列(Ren等人(2000)Scienc，290，2306-2309)(ChIP-ChIP)或深度测序(Barski等人(2007)Cell，129，823-837)(ChIP-seq)来探测。DNA甲基化还可以通过使用甲基胞嘧啶抗体的免疫沉淀反应(Weber等人(2005)Nature Genetics，37，853-862)或采用提供DNA甲基化状态的更全面分析的亚硫酸氢盐测序(Zhang等人(2006)Cell，126，1189-1201)来探测。使用抗体的全基因组表观遗传分析常常使用大约106至107个细胞。ChIP使用少至100个细胞，然而，使用该少的细胞，分析是基因座特异性的而不是全基因组的(O′Neill等人(2006)NatureGenetics，38，835-841)。当研究设法确定两个或更多个表观遗传标记是否在基因组内重合或是否存在于单件遗传物质例如单一染色质上时，遭遇更多显著局限性。每一个表观遗传标记的分析需要独立的免疫沉淀反应。当用不同的抗体使染色质从细胞总体沉淀时，难以从总体内的多个种群的存在区分被探测的标记的真正重合，每一个具有不同的表观遗传特征。这可以用序列ChIP来稍微克服，序列ChIP中通过一种抗体沉淀的材料用第二抗体再ChIP(Bernstein等人(2006)Cell，125，315-326)。然而，这些技术经不起全基因组分析或调查多于两种表观遗传标记的研究。此外，全分析技术报告种群的平均值且并不考虑单分子水平的变化形式。因此，对提供更可靠的全基因组表观遗传分析的可选择的方法和组合物仍存在相当大的需求。本发明满足该需求并提供相关的优点，鉴于上述提到的问题，本发明设计一种用于表观遗传分析的设备和方法，以解决上述提到的问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于表观遗传分析的设备和方法，以解决上述背景技术中提出的这些技术经不起全基因组分析或调查多于两种表观遗传标记的研究，全分析技术报告种群的平均值且并不考虑单分子水平的变化形式的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于表观遗传分析的设备，包括箱体，所述箱体的内腔设置有通道，所述通道的内腔顶部设置有光源装置，所述通道的内腔底部设置有接触装置，所述箱体的顶部左右两侧分别设置有控制器和显示屏，所述箱体的左侧设置有激光器，所述控制器分别与光源装置、接触装置、显示屏和激光器电性连接。

优选的，所述通道为亚微米通道。

优选的，所述激光器的右壁安装有激发滤光器。

优选的，所述接触装置为微流控设备。

一种用于表观遗传分析的方法，该种用于表观遗传分析的方法步骤如下：

S1：提取染色质样品：挑单菌落，接种于YPD培养基中过夜培养，将YPD培养基置于25-30℃下保存，取一只150mL烧瓶，将过夜培养的菌液稀释至40-60mL,然后将烧瓶在25-30℃下培养，用终浓度为2％的甲醛交联细胞30-40min，加入终浓度为125mM的甘氨酸，反应4-10min，使反应猝熄，收集细胞，用20-30mL的PBS缓冲液清洗菌体1-2次，重悬菌体，取一只15mL的圆锥试管，将菌体重悬于组成的溶液中，加入终浓度为0.20-0.30mg/mL的酵母裂解酶进行震荡，得到原生质体，向原生质体溶液中加入微球菌核酸酶稀释，再加入SDS和EDTA终止反应，在60-70℃过夜保存，再用氯仿抽取DNA，用无水乙醇沉淀DNA，再加入80-100μl的TE溶解DNA，-20℃保存备用；

S2：序列特异性探针标记染色质：先用适量的DNaseI在二价镁离子存在下，在双链染色质上打开单个单链缺口，利用DNA聚合酶的核酸外切酶活性在切处将旧链从末端逐步切除，同时在DNA聚合酶活性的作用下，顺序将特异性探针连接到切口的末端氢氧基上，以互补的DNA单链为模板合成新的DNA单链；

S3：MBD1标记染色质：将MBD1的甲基化敏感的结合域MBD被克隆到pET-30b质粒，以产生在IPTG诱发下表达的His-tag融合蛋白，溶解IPTG诱发的大肠杆菌，且纯化并在镍柱上再折叠融合蛋白，在纯化之后，使用标记游离胺的微刻度标记试剂盒用Alexa488来标记融合蛋白，进行三次另外的树脂纯化循环以更好地将游离标记纯化掉，用Southwestern槽的印迹来测定所标记的MBD探针的完整性，以50ng/μL悬浮在1x的Tris缓冲盐水中的甲基化的DNA和未甲基化的DNA的混合物中，我们使用TOTO-3来进行DNA染色，然后，将约1μg的经标记的DNA稀释到包含具有2％牛血清蛋白和0.1％TritonX-100(v/v)的1x的TBS的20μL的缓冲液中，然后，将以280ng/μL储存的且用AlexaFluor488标记的1μL的MBD1的容积添加到DNA以便在摩尔过量的条件下进行结合反应；结合反应在室温下发生2-3小时；

S4：染色质样品与通道接触：将样品保持在它们相应的储存缓冲液中，直到DNA标记和MBD结合反应，在这些反应之后，连续地将样品稀释在1x的TBE，89mM的TRIS硼酸盐和2mM的EDTA，最终的稀释将样品悬浮在600pM的估计浓度，标称为对于染色质样品为1-2ng/μL，且对于甲基化的DNA样品为约0.25ng/μL，缓冲液中的聚合物添加剂用于限制电渗流并防止与流控通道壁的非特异性相互作用而不使得蛋白质变性，我们将50μL的样品溶液加载到流控通道阵列的输入储器中，且然后连接到阴极，输出储器仅包含缓冲液溶液，且连接到阳极，对于所有的染色质样品，在偏置电压下，且对于所有的甲基化的DNA样品，在偏置电压下，使得样品在20-30min的预流时间期间建立稳定的电动流动，以确保在数据收集之前已经实现稳态流条件，检查每一种样品达总计15min，总是使用阵列内的相同流控通道，在单分子探测之后，在加载下一个样品之前，反复冲洗流控通道阵列达总计30min，且然后检查以验证荧光标记的分子的消失；

S5：测试与分析：将序列特异性探针标记的染色质和MBD1标记的染色质流过通道，利用光源装置照亮通道以产生多个探询容积，每一个探询容积由通道的壁和光束限制，探测来自多个的相同或不同探询容积的至少一个标记和一个其他标记，以产生至少一个标记和至少一个其他标记的时间相关的分辨率，利用激光器在通道内的溶液中的DNA样品流动、用高斯形状的激光剖面照亮样品和探测表示组蛋白或DNA组分的荧光事件，控制器被编程为提供来自一个或多个探询容积的至少两种类型的信号的实时的时间相关的分辨率，由此表征物体，显示屏其配置成接收来自处理器的数据和显示数据，其中数据包括关于来自一个或多个探询容积的至少两种类型的信号的信息。

优选的，所述步骤S1中组成的溶液为50mM的TRIS、山梨醇、和10mM的β-巯基乙醇。

优选的，所述步骤S3中的1x的TBS为50mM晶体氯化氢和138mM氯化钠和2.7mM氯化钠。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：该种用于表观遗传分析的设备和方法，结构简单，增设了全基因组分析或调查多于两种表观遗传标记的研究，提供了更可靠的全基因组表观遗传分析可选择的方法，满足了组合物的需求，大大减少了成本，使得人们在表观遗传学上更好的进行进一步的研究。

附图说明

图1为本发明结构示意图；

图2为本发明分析方法步骤图。

图中：1 箱体、2 通道、3 光源装置、4 接触装置、5 控制器、6 显示屏、7 激光器。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-2，本发明提供一种技术方案：一种用于表观遗传分析的设备，包括箱体1，箱体1的内腔设置有通道2，其配置成保持所述物体，通道2的内腔顶部设置有光源装置3，其配置成照亮所述通道以产生一个或多个探询容积，通道2的内腔底部设置有接触装置4，箱体1的顶部左右两侧分别设置有控制器5和显示屏6，控制器5被编程为提供来自所述一个或多个探询容积的所述至少两种类型的信号的实时的时间相关的分辨率，由此表征所述物体，显示屏6为用户界面，其配置成接收来自所述处理器的数据和显示所述数据，其中所述数据包括关于来自所述一个或多个探询容积的所述至少两种类型的信号的信息，箱体1的左侧设置有激光器7，其配置成探测表示来自所述一个或多个探询容积的所述物体的两种不同的特性的至少两种类型的信号，控制器5分别与光源装置3、接触装置4、显示屏6和激光器7电性连接。

其中，通道2为亚微米通道，其配置成保持所述物体，激光器7的右壁安装有激发滤光器，接触装置4为微流控设备。

一种用于表观遗传分析的方法，该种用于表观遗传分析的方法步骤如下：

S1：提取染色质样品：挑单菌落，接种于YPD培养基中过夜培养，将YPD培养基置于25-30℃下保存，取一只150mL烧瓶，将过夜培养的菌液稀释至40-60mL,然后将烧瓶在25-30℃下培养，用终浓度为2％的甲醛交联细胞30-40min，加入终浓度为125mM的甘氨酸，反应4-10min，使反应猝熄，收集细胞，用20-30mL的PBS缓冲液清洗菌体1-2次，重悬菌体，取一只15mL的圆锥试管，将菌体重悬于组成的溶液中，加入终浓度为0.20-0.30mg/mL的酵母裂解酶进行震荡，得到原生质体，向原生质体溶液中加入微球菌核酸酶稀释，再加入SDS和EDTA终止反应，在60-70℃过夜保存，再用氯仿抽取DNA，用无水乙醇沉淀DNA，再加入80-100μl的TE溶解DNA，-20℃保存备用；

S2：序列特异性探针标记染色质：先用适量的DNaseI在二价镁离子存在下，在双链染色质上打开单个单链缺口，利用DNA聚合酶的核酸外切酶活性在切处将旧链从末端逐步切除，同时在DNA聚合酶活性的作用下，顺序将特异性探针连接到切口的末端氢氧基上，以互补的DNA单链为模板合成新的DNA单链；

S3：MBD1标记染色质：将MBD1的甲基化敏感的结合域MBD被克隆到pET-30b质粒，以产生在IPTG诱发下表达的His-tag融合蛋白，溶解IPTG诱发的大肠杆菌，且纯化并在镍柱上再折叠融合蛋白，在纯化之后，使用标记游离胺的微刻度标记试剂盒用Alexa488来标记融合蛋白，进行三次另外的树脂纯化循环以更好地将游离标记纯化掉，用Southwestern槽的印迹来测定所标记的MBD探针的完整性，以50ng/μL悬浮在1x的Tris缓冲盐水中的甲基化的DNA和未甲基化的DNA的混合物中，我们使用TOTO-3来进行DNA染色，然后，将约1μg的经标记的DNA稀释到包含具有2％牛血清蛋白和0.1％TritonX-100(v/v)的1x的TBS的20μL的缓冲液中，然后，将以280ng/μL储存的且用AlexaFluor488标记的1μL的MBD1的容积添加到DNA以便在摩尔过量的条件下进行结合反应；结合反应在室温下发生2-3小时；

S4：染色质样品与通道接触：将样品保持在它们相应的储存缓冲液中，直到DNA标记和MBD结合反应，在这些反应之后，连续地将样品稀释在1x的TBE，89mM的TRIS硼酸盐和2mM的EDTA，最终的稀释将样品悬浮在600pM的估计浓度，标称为对于染色质样品为1-2ng/μL，且对于甲基化的DNA样品为约0.25ng/μL，缓冲液中的聚合物添加剂用于限制电渗流并防止与流控通道壁的非特异性相互作用而不使得蛋白质变性，我们将50μL的样品溶液加载到流控通道阵列的输入储器中，且然后连接到阴极，输出储器仅包含缓冲液溶液，且连接到阳极，对于所有的染色质样品，在偏置电压下，且对于所有的甲基化的DNA样品，在偏置电压下，使得样品在20-30min的预流时间期间建立稳定的电动流动，以确保在数据收集之前已经实现稳态流条件，检查每一种样品达总计15min，总是使用阵列内的相同流控通道，在单分子探测之后，在加载下一个样品之前，反复冲洗流控通道阵列达总计30min，且然后检查以验证荧光标记的分子的消失；

S5：测试与分析：将所述序列特异性探针标记的染色质和MBD1标记的染色质流过通道2，利用光源装置3照亮所述通道2以产生多个探询容积，每一个探询容积由所述通道2的壁和光束限制，探测来自所述多个的相同或不同探询容积的至少一个标记和一个其他标记，以产生所述至少一个标记和所述至少一个其他标记的时间相关的分辨率，利用激光器7在通道2内的溶液中的DNA样品流动、用高斯形状的激光剖面照亮样品和探测表示组蛋白或DNA组分的荧光事件，控制器5被编程为提供来自所述一个或多个探询容积的所述至少两种类型的信号的实时的时间相关的分辨率，由此表征所述物体，显示屏6其配置成接收来自所述处理器的数据和显示所述数据，其中所述数据包括关于来自所述一个或多个探询容积的所述至少两种类型的信号的信息。

其中，所述步骤S1中组成的溶液为50mM的TRIS、山梨醇、和10mM的β-巯基乙醇，所述步骤S3中的1x的TBS为50mM晶体氯化氢和138mM氯化钠和2.7mM氯化钠。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。