咔唑含氮衍生物及其制备方法和用途与流程

本发明涉及咔唑含氮衍生物，特别是涉及咔唑含氮衍生物及其制备方法和用途。

背景技术：

富g序列中四个鸟嘌呤通过氢键可以形成g-四分体，由数个g-四分体堆积可形成g-四链体。g-四链体存在于人类基因的调控区域，包括人端粒末端(htg)和致癌基因启动子区如c-kit、bcl-2和c-myc等，所以可以通过稳定端粒或启动子区域g-四链体dna结构，抑制癌细胞的增殖。

c-kit、bcl-2和c-mycg-四链体dna位于原癌基因启动子区域，它们在癌细胞中过度表达，而且其相关蛋白会影响癌细胞的增殖和凋亡。htgdna位于端粒末端，是端粒酶的作用底物。由于端粒酶在正常体细胞中不表达活性或活性很低，而在85-90％的癌细胞中活性很高，所以通过小分子稳定端粒g-四链体结构会抑制端粒酶活性，进而抑制肿瘤细胞增殖。因此，g-四链体dnas对于人类抗癌药物的研究具有重要意义，也是国内外科学家关注的焦点。然而人细胞核中存在大量的双螺旋dna，所以开发能选择性识别双螺旋和g-四链体结构dnas的探针分子具有重要的理论及实际意义，本发明提供的一种咔唑含氮衍生物可以实现此两种不同二级结构dna的检测。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种咔唑含氮衍生物及其制备方法和用途。

本发明提供的一种咔唑含氮衍生物，其结构式如下：

其中:r为

本发明提供的咔唑含氮衍生物的合成路线如下：

本发明提供的咔唑含氮衍生物的制备方法，包括以下步骤：

一种咔唑含氮衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

室温下，按摩尔比3-乙基-2-甲基苯并噻唑碘盐﹕9-乙基-3-甲酰基咔唑＝1﹕1～1.05将这两种物质用无水甲醇溶解，搅拌待全溶后逐滴加入适量催化剂20％naoh水溶液，滴加完毕后继续搅拌10～11h，有红色沉淀生成，抽滤，用无水甲醇洗涤滤饼两次并干燥后得咔唑含氮衍生物。

一种咔唑含氮衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

室温下，先用无水甲醇将4-吡啶乙腈和9-乙基-3-甲酰基咔唑全溶，再用恒压滴液漏斗逐滴加入叔丁醇钾无水甲醇溶液，4-吡啶乙腈、9-乙基-3-甲酰基咔唑和叔丁醇钾的摩尔比为1﹕1～1.05﹕1.4～1.6；滴加完毕后继续搅拌5～6h，有黄色沉淀中间产物生成，抽滤，用无水甲醇洗涤滤饼两次后再用三氯甲烷溶解，全溶后边搅拌边缓慢滴加碘甲烷，中间产物与碘甲烷的摩尔比＝1﹕20～25，滴加完毕后继续搅拌5～6h，溶液渐变为橙红色，并有橙色沉淀生成，抽滤，用三氯甲烷洗涤滤饼两次，干燥得咔唑含氮衍生物。

本发明提供的咔唑含氮衍生物与双链dnas和g-四链体dnas的结合能力差异较大，而且咔唑含氮衍生物与双链dnas作用的荧光增强倍数和与g-四链体dnas作用的荧光增强倍数差异也较大，所以可用于此两种不同二级结构dna的检测。

与现有技术相比本发明具有以下有益效果：

本发明提供的咔唑含氮衍生物制备方法简单，反应条件温和，易于大量制备；本发明制备的咔唑含氮衍生物与g-四链体dnas的结合能力要大于双链dna；实施例1制备的咔唑含氮衍生物与双链dnas作用后的荧光增强倍数明显大于与g-四链体dnas作用后的荧光增强倍数；实施例2制备的咔唑含氮衍生物与g-四链体dnas作用后的荧光增强倍数明显大于与双链dnas作用后的荧光增强倍数；本发明制备的咔唑含氮衍生物和双螺旋以及g-四链体dnas作用后的结合能力和荧光增强倍数的差异性，可用于此两种不同二级结构dna的检测。

附图说明

图1实施例1咔唑含氮衍生物(10μm)与不同二级结构dnas相互作用的紫外可见吸收滴定谱图。箭头表示逐渐增加dna的浓度。图中：(a)+ct-dna；(b)+ds26；(c)+c-kit；(d)+bcl-2；(e)；+c-myc；(f)+htg(na缓冲体系)；(g)+htg(k缓冲体系)

图2实施例2咔唑含氮衍生物(15μm)与不同二级结构dnas相互作用的紫外可见吸收滴定谱图。箭头表示逐渐增加dna的浓度。图中：(a)+ct-dna；(b)+ds26；(c)+c-kit；(d)+bcl-2；(e)；+c-myc；(f)+htg(na缓冲体系)；(g)+htg(k缓冲体系)

图3实施例1咔唑含氮衍生物(5μm)与不同浓度双螺旋dnas以及g-四链体dnas作用的荧光增强倍数图。图中：(a)实施例1咔唑含氮衍生物(5μm)与不同浓度双螺旋dnas作用的荧光增强倍数图，其中+ds26(■)，+ct-dna(·)；(b)实施例1咔唑含氮衍生物(5μm)与不同浓度g-四链体dnas作用的荧光增强倍数图，其中+c-kit(■)，+htg(k)(·)，+htg(na)(▲)，+bcl-2(▼)，+c-myc(◆)。

图4实施例1咔唑含氮衍生物(5μm)与双螺旋dnas以及g-四链体dnas反应平衡时的荧光增强倍数图。

图5实施例2咔唑含氮衍生物(5μm)与不同浓度双螺旋dnas以及g-四链体dnas作用的荧光增强倍数图。图中：(a)实施例2咔唑含氮衍生物(5μm)与不同浓度双螺旋dnas作用的荧光增强倍数图，其中+ds26(■)，+ct-dna(·)；(b)实施例2咔唑含氮衍生物(5μm)与不同浓度g-四链体dnas作用的荧光增强倍数图，其中+c-kit(■)，+htg(k)(·)，+htg(na)(▲)，+bcl-2(▼)，

图6实施例2咔唑含氮衍生物(5μm)与双螺旋dnas以及g-四链体dnas反应平衡时的荧光增强倍数图。

具体的实施方式：

实施例1：一种咔唑含氮衍生物的制备

在室温下，依次将40ml无水甲醇、2.24g(7.35mmol)3-乙基-2-甲基苯并噻唑碘盐，和1.64g(7.35mmol)9-乙基-3-甲酰基咔唑加入250ml三口烧瓶中，搅拌溶解，全溶后逐滴加入1ml20％naoh水溶液，滴加完毕后继续搅拌10h，生成红色沉淀，减压抽滤，用无水甲醇洗涤滤饼两次后即得1.69g纯净的咔唑含氮衍生物，产率45.1％，结构式为：

其物理常数如下：

红色粉末，分子式：c25h23n2si(510.06212)；

esi(+)-ms(m/z)：[m-i]⁺，383.15865(100％)；

¹h-nmr(600mhz，dmso-d6)：δ(ppm)8.930(s，1h)，8.462(s，1h)，8.437～8.423(d，1h，j＝8.4hz)，8.282～8.239(m，3h)，8.048～8.022(d，1h，j＝13.2hz)，7.883～7.736(m，4h)，7.587～7.562(t，1h,j＝7.5hz)，7.370～7.345(t，1h，j＝7.5hz)，4.998～4.987(q，2h，j＝6.6hz)，4.558～4.546(q，2h，j＝7.2hz)，1.535～1.511(t，3h，j＝7.2hz)，1.390～1.367(t，3h，j＝6.9hz)。

¹³c-nmr(150mhz，dmso-d6)：δ(ppm)172.11，151.71，142.79，141.41，140.79，129.81，128.61，128.53，128.32，127.35，125.66，124.80，124.49，123.39，122.70，121.13，120.77，116.78，110.61，109.96，44.63，37.92，14.63，14.32。

实施例2：一种咔唑含氮衍生物的制备

(1)在室温下，向250ml三口烧瓶中依次加入60ml无水甲醇、0.86g(7.36mmol)4-吡啶乙腈和1.64g(7.35mmol)9-乙基-3-甲酰基咔唑，搅拌溶解，待全溶后用50ml恒压滴液漏斗逐滴加入1.22g(10.88mmol)溶于30ml无水甲醇的叔丁醇钾溶液，滴加完毕后继续搅拌5h，生成黄色沉淀，减压抽滤，用无水甲醇洗涤滤饼两次后即得0.64g中间产物ⅰ。

(2)在室温下，将0.64g(1.92mmol)中间产物ⅰ加入50ml的单口烧瓶中，用10ml三氯甲烷溶解，全溶后边搅拌边缓慢滴加2.5ml碘甲烷，滴加完毕后继续搅拌5h，溶液渐变为橙红色，并有橙色沉淀生成。抽滤，三氯甲烷洗涤滤饼两次，干燥滤饼即得目标产物0.32g(0.688mmol)，产率35.8％，结构式为：

其物理常数如下：

橙色粉末，分子式：c23h20n3i(465.06964)；

esi(+)-ms(m/z)：[m-i]⁺，338.16591(100％)；

¹h-nmr(600mhz，dmso-d6)：δ(ppm)9.403(s，1h)，8.985～8.976(d，2h,j＝5.4hz)，8.877～8.863(d，1h,j＝8.4hz)，8.810(s，1h)，8.512(s，1h)，8.269～8.256(d，1h，j＝7.8hz)，8.189～8.176(d，1h，j＝7.8hz)，7.905～7.891(d，1h，j＝8.4hz)，7.758～7.745(d，1h，j＝7.8hz)，7.596～7.570(t，1h，j＝7.8hz)，7.359～7.334(t，1h，j＝7.5hz)，4.565～4.542(t，2h，j＝6.9hz)，4.447(s，3h)，1.389～1.365(t，3h，j＝7.2hz)，1.372～1.349(t，3h，j＝6.9hz)；

¹³c-nmr(150mhz，dmso-d6)：δ(ppm)149.91，144.70，143.10，142.14，141.08，140.79，135.36，128.20，127.66，127.46，124.23，124.01，123.03，122.42，120.91，120.78，117.94，110.69，110.59，99.51，48.84，37.91，14.28。

实施例3咔唑含氮衍生物对不同二级结构dna结合能力的研究

应用紫外可见吸收滴定实验测试了咔唑含氮衍生物和不同二级结构dna的结合能力。结果如图1、图2和表1、表2所示。表1和表2分别列出了实施例1和实施例2咔唑含氮衍生物与不同二级结构dna相互作用的结合常数(kb)、最大吸收带的减色率(％)和红移值(nm)。结果表明，咔唑含氮衍生物既可以和双链dnas作用又可以和g-四链体dnas作用，但是与后者的结合常数较大。

本实验所用双螺旋dnas分别为：小牛胸腺dna(ct-dna)和ds26

(5’-caatcggatcgaattcgatccgattg-3’)。

本实验所用的g-四链体dnas分别为：

bcl-2(5’-gggcgcgggaggaagggggcggg-3’)；

c-kit(5’-cgggcgggcgcgagggagggg-3’)；

c-myc(5’-tgagggtggggagggtggggaa-3’)；

htg(5’-gggttagggttagggttaggg-3’)。

本实验所用缓冲体系为：k缓冲体系(10mmk2hpo4/kh2po4，100mmkcl，ph7.4)，na缓冲体系(10mmna2hpo4/nah2po4，100mmnacl，ph7.4)。

本实验中双螺旋dnas的浓度用碱基对表示，g-四链体dnas的浓度用g-四分体表示。

表1实施例1咔唑含氮衍生物与不同二级结构dna相互作用的结合常数(kb)、最大吸收带的减色率(％)和红移值(nm)

表2实施例2咔唑含氮衍生物与不同二级结构dna相互作用的结合常数(kb)、最大吸收带的减色率(％)和红移值(nm)

实施例4咔唑含氮衍生物和不同二级结构dnas作用后的荧光变化研究

应用荧光滴定实验研究了咔唑含氮衍生物和不同二级结构dnas作用后的荧光强度变化，结果分别如图3、图4、图5和图6所示。发现将不同二级结构的dnas逐滴加入咔唑含氮衍生物后，实施例1咔唑含氮衍生物与双链dnas作用的荧光增强倍数明显大于与g-四链体dnas作用的荧光增强倍数。当实施例1咔唑含氮衍生物与dna反应达到平衡时，与ds26和ct-dna两种双螺旋dna作用后荧光强度分别增大约14.7和13.8倍，与g-四链体dnasc-kit、htg(k缓冲体系)、htg(na缓冲体系)、bcl-2和c-myc作用后荧光强度分别增加约3.1、5.2、6.7、2.5和6.2倍；相反，实施例2咔唑含氮衍生物与g-四链体dnas作用后荧光增强倍数明显大于与双链dnas作用后的荧光增强倍数。当实施例2咔唑含氮衍生物与dna反应达到平衡时，与ds26和ct-dna两种双螺旋dna作用的荧光增强倍数分别为5.4和5.5，与g-四链体dnasc-kit、htg(k缓冲体系)、htg(na缓冲体系)、bcl-2和c-myc作用后荧光增强倍数分别为19.9、19.8、19.6、17.9和11.2。

本发明制备的咔唑含氮衍生物与双链dnas和g-四链体dnas的结合常数差异较大，而且实施例1咔唑含氮衍生物与双链dnas作用后的荧光增强倍数明显大于与g-四链体dnas作用后的荧光增强倍数，实施例2咔唑含氮衍生物与g-四链体dnas作用后的荧光增强倍数明显大于与双链dnas作用后的荧光增强倍数。利用此咔唑含氮衍生物与双螺旋dnas和g-四链体dnas作用后的亲合力大小和荧光增强倍数的差异性，可用于此两种不同二级结构dnas的检测。