本发明涉及一种利用鱼加工下脚料皮制备天然胶原膜的方法，属于食品加工技术领域。
背景技术：
随着生活水平的提高，对于环保问题的关注越来越多，包装材料的大量使用引起的污染问题也受到了人们的重视。传统的包装材料通常由塑料或者纸制品制成，存在着不易降解、不能食用和安全性的问题，利用胶原或者明胶的成膜性能和可生物降解的特性，将其制成绿色包装材料如胶原肠衣的研究越来越多，扩展了胶原在食品领域的应用。
近年来，随着鱼类养殖技术和规模的提高，水产加工业发展迅速，中国水产品总产量超过6000万吨，位居全球第一，在鱼产品加工过程中会产生大量的头、鳞片、骨和皮等下脚料，约占总量的40～50％，如果将其将废弃物丢弃或者加工成饲料、肥料等低附加值产品使用，会造成资源的浪费，同时会产生一定的环境污染。使用鱼皮作为胶原和明胶提取的原料，和陆生动物胶原相比具有更高的安全性并且可以避免一些穆斯林等人群的宗教禁忌，提升鱼皮材料附加值的同时避免环境污染，具有更广的应用范围。
目前关于鱼皮胶原膜制备的研究，有以下两种方式：
(1)利用鱼皮制备得到明胶，直接干燥成膜或者添加其他外源物质(如多糖、无机物、蛋白、纳米材料等)对明胶进行改性后，得到明胶膜。中国专利CN101341977A公布了一种含有鱼皮胶原蛋白的可食膜及其生产方法，通过酸碱二元法处理鱼皮去除非胶原蛋白及色素，采用热水(55～75℃)浸提鱼皮得到鱼皮胶原蛋白液，然后与大豆蛋白及甘油共混干燥制备鱼皮胶原膜。中国专利101942204A公开了一种胶原蛋白膜的生产方法，将鱼骨、鱼皮、鱼鳞及鱼筋等鱼类加工下脚料脱脂、脱腥、脱灰、去除非胶原蛋白等步骤处理后使用热水(60～100℃)浸提、提纯后得到胶原蛋白液，然后加入甘油共混干燥后得到胶原蛋白膜。中国专利105348819A公开了从罗非鱼皮中提取明胶然后加入戊二醛和海藻酸钠进行改性，然后干燥后得到胶原蛋白膜。然而，在这些研究中较高温度的处理得到的是胶原蛋白液已经发生变性，分子量和天然胶原蛋白分子相比大大降低，天然胶原的三螺旋结构被破坏，得到的膜实际上不能称之为胶原膜而是明胶膜。而纯明胶膜质脆易碎，和未变性胶原蛋白形成的膜相比力学性能差。通过添加改性剂能够改善明胶膜的性能。同时，外源物质的引入可能对于可食用包装膜的使用存在安全风险。
(2)通过鱼皮制备得到未变性的天然胶原蛋白，然后干燥成膜或者添加外源物质(如戊二醛、TG酶等)对其进行改性后成膜。如Tang等人(Lanlan Tang,Shulin Chen,Wenjin Su,Wuyin Weng,Kzafumi Osako,Munehiko Tanaka.Physicochemical properties and film-forming ability of fish skin collagen extracted from different freshwater species,Process Biochemistry 50(2015)148-155)通过去除杂蛋白、脱脂、纯化等处理后，用0.5mol/L醋酸从罗非鱼、草鱼和银鲤鱼皮中分离出胶原蛋白，然后将20％的甘油溶液加入到10mg/mL的胶原溶液在25℃，50％湿度条件下干燥，得到鱼皮胶原膜。Elango等人(Jeevithan Elango,Yongshi Bu,Bao Bin,Jeyasekaran Geevaretnam,Jeya Shakila Robinson,Wenhui Wu.Effect of chemical and biological cross-linkers on mechanical and functional properties of shark catfish skin collagen films,Food Bioscience 17(2017)42-51)对巨型鲶鱼皮脱脂和去除非胶原蛋白处理后，用0.5mol/L醋酸提取纯化得到胶原蛋白，然后通过甘油、戊二醛、六亚甲基二异氰酸酯、TG酶、卡拉胶对胶原进行改性后干燥制备得到鱼皮胶原膜。通过此种方法制备的胶原蛋白未发生变性，然而在胶原的提取过程中会产生大量未被酸溶解的鱼皮残渣，这些鱼皮残渣没有被充分利用，会造成了资源的二次浪费，还会产生环保问题。此外，鱼皮中含有较多的色素，会导致制备的胶原膜含有颜色，影响其应用。交联剂等外源物质的引入可能对于可食用包装膜的使用存在安全风险。
利用鱼皮制备胶原膜作为可食用包装材料存在着鱼皮材料利用不完全会造成二次污染；明胶已经发生变性失去了天然胶原稳定的三螺旋结构，用其制备的膜质脆；外源物质的引入会引起安全风险等问题。因此，开发一种充分利用鱼皮的纯净胶原膜对拓展鱼皮材料的应用和降低环境污染有着重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种利用鱼加工下脚料皮制备天然胶原膜的方法，其特点是以淡水鱼类加工下脚料皮为原料，通过酸法提取未变性天然胶原蛋白，热提法提取鱼皮明胶，再将两种材料共混制备鱼皮胶原膜，制备得到的鱼皮胶原膜能够被生物降解，降低环境污染，实现了对鱼皮材料的充分利用，提升鱼皮材料的应用。
本发明的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外，均为重量份数。
利用鱼加工下脚料皮制备天然胶原膜的方法包括以下步骤：
(1)鱼皮原料预处理
将新鲜鱼皮去除鳞片、表面粘液、皮下组织，洗净沥干后将鱼皮剪成0.2×0.2cm的小块，置于料液比为1∶10～30(w/v)，质量浓度为5～10％的碳酸氢钠或碳酸钠溶液中搅拌24～48h，每隔8～12h换一次液，温度20～40℃水洗，置于料液比为1∶10～30(w/v)，体积浓度为10～15％的异丙醇溶液中搅拌24～48h，每隔8～12h换一次液，温度20～40℃水洗，置于料液比为1∶10～30(w/v)，体积浓度为3～6％的非离子脱脂剂AXAUT AP或AXAUT-50溶液中搅拌24～48h，每隔8～12h换一次液，温度20～40℃水洗；
(2)脱色处理
将步骤(1)中所得的鱼皮置于料液比为1∶10～30(w/v)，体积浓度为0.5～4％，pH为10～12的过氧化氢溶液中搅拌12～24h，每隔8～12h换一次液，蒸馏水洗；
(3)去除杂蛋白
将步骤(2)所得鱼皮加入料液比为1∶10～30(w/v)，pH为7.5，0.05～0.2mol/L的Tris-HCl缓冲溶液中搅拌12～24h，每隔8～12h换一次液，蒸馏水清洗；
(4)未变性天然胶原的提取及明胶的制备
将步骤(3)所得鱼皮置于料液比为1∶20～50(w/v)，浓度为0.1～0.5mol/L酸溶液中，在冰水浴下搅拌提取48～72h，获得未变性鱼皮胶原溶液，用8000～20000rpm冷冻高速离心机分离，上清液加入氯化钠至最终浓度为0.7mol/L，离心取沉淀用0.5mol/L醋酸溶解，透析冷冻干燥后得到鱼皮胶原；未被酸溶解的鱼皮残渣用1∶10～30(w/v)去离子水在温度40～50℃提取12～24h，干燥后得到鱼皮明胶；
(5)鱼皮胶原膜的制备
将步骤(4)所得鱼皮胶原溶解在0.01mol/L的醋酸得到鱼皮胶原溶液，明胶粉末加入去离子水在温度20～30℃下溶解得到鱼皮明胶溶液，然后将鱼皮胶原溶液和明胶溶液混合，置于室温条件下成膜，得到鱼皮胶原膜。
所述鱼皮为新鲜的淡水草鱼、鲶鱼、黑鱼或/和鲤鱼中的至少一种。
所述Tris-HCl缓冲液中含有氯化钠，氯化钠的质量浓度为5～10％。
所述用于成膜的胶原溶液的浓度为5～20mg/mL，明胶溶液的浓度为10～30mg/mL，胶原溶液中明胶的含量为20％～50％。
所述利利用鱼皮经过酸处理得到未变性胶原蛋白，未被酸溶解的残渣制备鱼皮明胶。
所述利用鱼加工下脚料皮制备天然胶原膜的方法制备得到的天然鱼皮胶原膜。
所述天然鱼皮胶原膜用于食品包装材料或可食性食品包装材料。
性能测试：
将不同胶原和明胶混合比例的胶原膜样品裁剪成45mm×10mm大小，贴于比色皿内表面，以空气作为参比，在500nm处测量其透过率，表征其透明度，结果如图1所示。
本发明具有以下优点：
1、利用鱼类加工过程中产生的下脚料皮制备天然胶原膜，将下脚料变废为宝，提升鱼皮附加值的同时保护了环境。
2、将提取鱼皮胶原后未被酸溶解的残渣制备为明胶，并且将鱼皮胶原和明胶共混制备为可食用胶原膜，充分利用了鱼皮材料，不会产生二次污染。
3、所制备的鱼皮胶原膜所用原料均从鱼皮中获取，不会引入外源物质，替代塑料或者纸制品作为食品的包装材料，是一种环境友好型的天然材料。
附图说明
图1为不同鱼皮明胶/胶原比例共混胶原膜的透光率曲线图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容对本发明作出一些非本质性的改进和调整。
实施例1
将市场上购买的新鲜黑鱼，去除肉、鳞片、粘液后，充分水洗沥干后将鱼皮剪成0.2×0.2cm的小块，用料液比为1∶10(w/v)，质量浓度为5％的碳酸钠溶液搅拌48h，每隔12h换一次液，温度20℃水洗，用料液比为1∶10(w/v)，体积浓度为10％的异丙醇搅拌24h，每隔8h换一次液，20℃水洗，用料液比为1∶10(w/v)，体积浓度为3％的AXAUT AP非离子脱脂剂搅拌24h，每隔8h换一次液，温度20℃水洗；然后将鱼皮置于料液比为1∶10(w/v)，pH为12，体积浓度为4％的过氧化氢溶液中搅拌24h，每隔12h换一次液，蒸馏水清洗；再加入料液比为1∶10(w/v)，pH为7.5，0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液(NaCl含量为5％)中搅拌24h，每隔12h换一次液，蒸馏水清洗。将预处理后的鱼皮置于料液比为1∶20(w/v)，浓度为0.5mol/L醋酸溶液中，在冰水浴下搅拌提取72h，获得未变性鱼皮胶原溶液。用8000rpm冷冻高速离心机分离，沉淀用去离子水充分冲洗，然后加入去离子水在温度45℃下提取36h，干燥后得到鱼皮明胶；上清液加入氯化钠至最终浓度为0.7mol/L，冰水浴条件下搅拌3h，离心取沉淀用0.5mol/L醋酸溶解，冰水浴下搅拌3h，透析后冷冻干燥。将胶原海绵溶解在醋酸中(10mg/mL)，和20mg/mL明胶溶液按照1∶0.2在温度30℃混合，在室温下成膜得到黑鱼皮天然胶原膜。
实施例2
将市场上购买的新鲜鲶鱼，去除肉、粘液后，充分水洗沥干后将鱼皮剪成0.2×0.2cm的小块，用料液比为1∶20(w/v)，质量浓度为10％的碳酸氢钠溶液搅拌24h，每隔8h换一次液，温度30℃水洗，用料液比为1∶20(w/v)，体积浓度为15％的异丙醇搅拌48h，每隔12h换一次液，温度30℃水洗，用料液比为1∶20(w/v)，体积浓度为5％的AXAUT-50非离子脱脂剂搅拌36h，每隔12h换一次液，温度30℃水洗；然后将鱼皮置于料液比为1∶20(w/v)，pH为11，体积浓度为1％的过氧化氢溶液中搅拌12h，每隔8h换一次液，蒸馏水清洗；再加入料液比为1∶20(w/v)，pH为7.5，0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液(NaCl含量为10％)中搅拌12h，每隔8h换一次液，蒸馏水清洗。将预处理后的鱼皮置于料液比为1∶40(w/v)，浓度为0.1mol/L盐酸溶液中，在冰水浴条件下搅拌提取48h，获得未变性鱼皮胶原溶液。用20000rpm冷冻高速离心机分离，沉淀用去离子水充分冲洗，然后加入去离子水在温度40℃下提取24h，干燥后得到鱼皮明胶；上清液加入氯化钠至最终浓度为0.7mol/L，冰水浴下搅拌3h，离心取沉淀用0.5mol/L醋酸溶解，冰水浴下搅拌3h，透析后冷冻干燥。将胶原海绵溶解在醋酸中(5mg/mL)，和30mg/mL明胶溶液按照1∶0.5在温度20℃混合，在室温下成膜得到鲶鱼皮天然胶原膜。
实施例3
将市场上购买的新鲜草鱼，去除鳞片、肉、粘液后，充分水洗沥干后将鱼皮剪成0.2×0.2cm的小块，用料液比为1∶30(w/v)，质量浓度为10％的碳酸氢钠溶液搅拌36h，每隔12h换一次液，温度40℃水洗，用料液比为1∶30(w/v)，体积浓度为12％的异丙醇搅拌36h，每隔12h换一次液，温度40℃水洗，用料液比为1∶30(w/v)，体积浓度为6％的AXAUT-50非离子脱脂剂搅拌48h，每隔12h换一次液，温度40℃水洗；然后将鱼皮置于料液比为1∶30(w/v)，pH为12，体积浓度为0.5％的过氧化氢溶液中搅拌16h，每隔8h换一次液，蒸馏水清洗；再加入料液比为1∶30(w/v)，pH为7.5，0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液(NaCl含量为8％)中搅拌16h，每隔8h换一次液，蒸馏水清洗。将预处理后的鱼皮置于料液比为1∶50(w/v)，浓度为0.5mol/L柠檬酸溶液中，在冰水浴下搅拌提取72h，获得未变性鱼皮胶原溶液。用10000rpm冷冻高速离心机分离，沉淀用去离子水充分冲洗，然后加入去离子水在温度50℃下提取12h，干燥后得到鱼皮明胶；上清液加入氯化钠至最终浓度为0.7mol/L，冰水浴下搅拌3h，离心取沉淀用0.5mol/L醋酸溶解，冰水浴下搅拌3h，透析后冷冻干燥。将胶原海绵溶解在醋酸中(20mg/mL)，和10mg/mL明胶溶液按照1∶0.3在温度10℃混合，在室温下成膜得到草鱼皮天然胶原膜。
实施例4
将市场上购买的新鲜鲤鱼，去除鳞片、肉、粘液后，充分水洗沥干后将鱼皮剪成0.2×0.2cm的小块，用料液比为1∶20(w/v)，质量浓度为8％的碳酸氢钠溶液搅拌36h，每隔12h换一次液，温度30℃水洗，用料液比为1∶20(w/v)，体积浓度为10％的异丙醇搅拌36h，每隔12h换一次液，温度30℃水洗，用料液比为1∶30(w/v)，体积浓度为4％的AXAUT AP非离子脱脂剂搅拌36h，每隔12h换一次液，温度30℃水洗；然后将鱼皮置于料液比为1∶20(w/v)，pH为10，体积浓度为2％的过氧化氢溶液中搅拌24h，每隔10h换一次液，蒸馏水清洗；再加入料液比为1∶20(w/v)，pH为7.5，0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液(NaCl含量为9％)中搅拌24h，每隔10h换一次液，蒸馏水清洗。将预处理后的鱼皮置于料液比为1∶40(w/v)，浓度为0.5mol/L醋酸溶液中，在冰水浴条件下搅拌提取48h，获得未变性鱼皮胶原溶液。用10000rpm冷冻高速离心机分离，沉淀用去离子水充分冲洗，然后加入去离子水在温度45℃下提取18h，干燥后得到鱼皮明胶；上清液加入氯化钠至最终浓度为0.7mol/L，冰水浴下搅拌3h，离心取沉淀用0.5mol/L醋酸溶解，冰水浴下搅拌3h，透析后冷冻干燥。将胶原海绵溶解在醋酸中(8mg/mL)，和15mg/mL明胶溶液按照1∶0.2在温度15℃混合，在室温下成膜得到鲤鱼皮天然胶原膜。
实施例5
将市场上购买的新鲜鲶鱼和草鱼，去除肉、粘液后，充分水洗沥干后将两份鱼皮剪成0.2×0.2cm的小块，分别用料液比为1∶20(w/v)，质量浓度为10％的碳酸氢钠溶液搅拌24h，每隔8h换一次液，温度30℃水洗，分别用料液比为1∶20(w/v)，体积浓度为15％的异丙醇搅拌48h，每隔12h换一次液，温度30℃水洗，分别用料液比为1∶20(w/v)，体积浓度为5％的AXAUT AP非离子脱脂剂搅拌36h，每隔12h换一次液，温度30℃水洗；然后将鱼皮置于料液比为1∶20(w/v)，pH为10，体积浓度为2％的过氧化氢溶液中搅拌12h，每隔8h换一次液，蒸馏水清洗；分别再加入料液比为1∶20(w/v)，pH为7.5，0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液(NaCl含量为7.5％)中搅拌12h，每隔8h换一次液，蒸馏水清洗。将预处理后的鱼皮分别置于料液比为1∶40(w/v)，浓度为0.5mol/L醋酸溶液中，在冰水浴条件下搅拌提取48h，获得未变性鲶鱼皮和草鱼皮胶原溶液。用20000rpm冷冻高速离心机分离，沉淀用去离子水充分冲洗，然后加入去离子水在温度40℃下提取24h，干燥后得到鲶鱼皮和草鱼皮明胶；上清液加入氯化钠至最终浓度为0.7mol/L，冰水浴下搅拌3h，离心的沉淀分别用0.5mol/L醋酸溶解，冰水浴下搅拌3h，透析后冷冻干燥。将鲶鱼皮和草鱼皮胶原海绵溶解在醋酸中(15mg/mL)，然后将鲶鱼皮和草鱼皮胶原溶液按照1∶1的比例在温度20℃混合，再和20mg/mL明胶溶液按照1∶0.2混合，在室温下成膜得到鲶鱼皮和草鱼皮共混天然胶原膜。
应用实例1
制备作为可降解的包装膜材料
将实施例1中制备的共混鲶鱼皮胶原和明胶溶液置于有机玻璃盒中，在温度45℃下干燥成膜，揭膜得包装膜材料。取包装膜材料按照GB/T 1040.2-2006方法裁剪试验样条，采用电子万能试验机UTM6203，以1mm/min拉伸速率进行拉伸性能测试。结果表明包装膜材料的拉伸强度为28.73MPa，断裂伸长率为10.455％。
应用实例2
制备作为肠衣
将实施例5中制备的鲶鱼草鱼共混胶原明胶溶液装入挤出机中，调节挤出机的温度为45℃，通过管机头挤出成型，烘干后成肠衣材料。取胶原肠衣材料裁剪成2cm×2cm小块，置于烘箱中在温度45℃下干燥6h，恒重后记录胶原膜质量。然后将其加入含有20U/mL胰蛋白酶的PBS缓冲液中(pH＝7.4)在温度37℃下酶解，去离子水冲洗后烘干恒重记录其质量。经测得8h后胶原膜的酶解率为69.13％,24h后酶解率98.57％。