蛋巢菌素类化合物、制备方法及其抗神经炎症的应用与流程

本发明属于医药领域，涉及蛋巢菌素类化合物、制备方法及其抗神经炎症的应用，特别是10个蛋巢菌素化合物、制备方法及其用于制备抑制环氧合酶-2活性和一氧化氮合酶活性药物的应用。
背景技术：
：随着人口老龄化进程的日益加速，阿尔茨海默病(alzheimerdiseasead)已成为常见的神经变性疾病，《全球阿尔茨海默病ad报告》显示，2015年全球约4680万人患痴呆症，并以每20年翻一番的速度在增长，预计到2050年，全球痴呆患者将达到1.315亿。目前的药物只能改善ad患者症状，既不能阻止ad发病进程也不能恢复患者已经失去的认知功能，因此疗效有限。迄今为止，仍没有革命性的药物出现。ad的病因及发病机制复杂，近年研究发现，以小胶质细胞如(bv2microglial)过度激活及产生大量自由基和炎性因子为特征的神经免疫炎症与ad密切相关。小胶质细胞是脑内的免疫效应细胞，小胶质细胞大约占中枢神经系统脑实质胶质细胞数量的10％，被aβ激活的小胶质细胞不仅有形态学上的改变，激活的小胶质细胞也活化了诱导性一氧化氮合酶(inos)，使细胞释放一氧化氮(nitricoxide,no)。no可以直接抑制参与线粒体电子传递及与柠檬酸循环有关的酶。no可能是毒性更大、生物半衰期更长的过氧化亚硝基阴离子的前体物，后者分解成具有强毒性作用的-oh及二氧化氮自由基。中枢神经系统no表达水平的增高和神经炎症性疾病、神经变性性疾病密切相关，在ad中发现了no表达水平的增高。由于神经炎症和神经变性刺激，激活的小胶质细胞和星型胶质细胞大量表达inos，产生大量的no，介导广泛的毒性作用，这种特点使no/inos成为介导包括神经变性疾病在内的许多疾病病理过程的一个重要因素[1,2]。环氧化酶-2(cox-2)是前列腺素e2合成的关键酶，在大脑皮层的锥体细胞和海马发现了cox-2免疫活性增加，提示cox-2可能参与阿尔茨海默病发病。而cox-2则主要在炎症部位表达，并可引起神经细胞的凋亡[3]。在ad患者脑内cox-2表达增加与aβ水平具有高度一致性，而且cox-2与含nfts的神经元共存，说明cox-2在神经元内的表达增加，可能导致神经元死亡。因此，为了开发新型抗神经炎症药物用于治疗老年痴呆症，迫切需要寻找cox-2和inos酶抑制剂。[1]沈勤,施建华,顾建兰,等.炎症胶质细胞中诱导型一氧化氮合酶基因转录的机制[j].中国临床康复,2006,10(30):101-104.[2]saharn,pahank.regulationofinduciblenitricoxidesynthasegeneinglialcells.antioxidredoxsignal,2006,8(5-6):929.[3]szekelyca,townt,zandipp.nsaidsforthechemopreventionofalzheimer’sdisease.subcellbiochem.2007,42:229-248.技术实现要素：本发明从一株非洲黑蛋巢菌的发酵液中分离得到10种化合物，统称为蛋巢菌素类化合物，该10种化合物分别对环氧合酶-2和一氧化氮合酶有较强的抑制活性，表明具有显著的抗神经炎症活性。本发明的化合物结构式为：分别命名为neocyathine；neocyathinf；neocyathing；neocyathinh；neocyathini；neocyathinj；cyathini；(12r)-11α,14α-epoxy-13α,14β,15-trihy-droxycyath-3-ene；cyathino和allocyafrinb4。本发明的蛋巢菌素1的理化性质为：c20h30o4，白色粉末。[α]d25＝-82.0(c＝0.17,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):230(3.06)nm；ir(kbr):νmax＝3451,2958,2866,2082,1640,1050cm-1；hr-esi-ms:m/z357.2032[m+na]+；本发明的蛋巢菌素2理化性质为：c20h28o5，白色粉末。[α]d25＝-77.9(c＝0.19,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):214(3.10)nm；ir(kbr):νmax＝3374,2939,2872,1696,1384,1031cm-1；hr-esi-ms:m/z371.1825[m+na]+；本发明的蛋巢菌素3理化性质为：c20h30o5，白色粉末。[α]d25＝-66.5(c＝0.18,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):230(2.85)nm；ir(kbr):νmax＝3369,2933,2870,1648,1046,982cm-1；hr-esi-ms:m/z373.1982[m+na]+；本发明的蛋巢菌素4理化性质为：c20h28o5，黄色油状。[α]d25＝-105.7(c＝0.09,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):230(3.36)nm；ir(kbr):νmax＝3417,2962,2874,1689,1593,1383cm-1；hr-esi-ms:m/z371.1825[m+na]+；本发明的蛋巢菌素5理化性质为：c20h30o5，白色固体。[α]d25＝-47.1(c＝0.09,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):231(3.30)nm；ir(kbr):νmax＝2961,2384,2310,1738,1366,1218cm-1；hr-esi-ms:m/z373.1985[m+na]+；本发明的蛋巢菌素6理化性质为：c20h30o5，白色粉末。[α]d25＝-68.4(c＝0.07,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):230(3.46)nm；ir(kbr):νmax＝2935,1735,1687,1606,1369,1217cm-1；hr-esi-ms:m/z373.1985[m+na]+；本发明的蛋巢菌素7理化性质为：c20h30o4，白色粉末。[α]d25＝-157.6(c＝0.11,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):230(3.25)nm；esi-ms(positive)m/z:357.30[m+na]+；本发明的蛋巢菌素8理化性质为：c20h32o4，白色粉末。[α]d25＝-5.88(c＝0.55,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):213(2.23)nm；esi-ms(positive)m/z:359.30[m+na]+；本发明的蛋巢菌素9理化性质为：c20h30o5，黄色固体；[α]d25＝-28.6(c＝0.46,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):230(2.72)nm；esi-ms(positive)m/z:701.58[2m+h]+；本发明的蛋巢菌素10理化性质为：c20h28o4，黄色油状。[α]d25＝-157.8(c＝0.09,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):230(3.34)nm；esi-ms(negative)m/z:663.53[2m-h]-；所述的蛋巢菌素1、蛋巢菌素2、蛋巢菌素3、蛋巢菌素4、蛋巢菌素5、蛋巢菌素6、蛋巢菌素7、蛋巢菌素8、蛋巢菌素9和蛋巢菌素10于非洲黑蛋巢菌cyathusafricanus的发酵液中分离得到。所述的非洲黑蛋巢菌cyathusafricanus的发酵液是由非洲黑蛋巢菌cyathusafricanus菌饼于酵母蛋白胨液体培养基上培养得到，培养温度为28℃，转速为130rpm，培养时间为28天。所述的蛋巢菌素类化合物用于制备抗神经炎症药物的应用。所述的蛋巢菌素类化合物用于制备抑制环氧合酶-2活性和一氧化氮合酶活性药物的应用。所述的10个蛋巢菌素化合物有明显的抗神经炎症活性，其中蛋巢菌素6、蛋巢菌素7、蛋巢菌素8、蛋巢菌素9和蛋巢菌素10在50μm时分别对环氧合酶-2和一氧化氮合酶有较强的抑制活性。本发明的化合物作为抑制剂，在抗神经炎症方面具有开发应用潜力。附图说明图1为馏分a-馏分f的流出顺序示意图；图2为馏分e1-馏分e5的流出顺序示意图；图3为化合物8和化合物6的流出顺序示意图；图4为馏分d1-馏分d5的流出顺序示意图；图5为馏分c1-馏分c5的流出顺序示意图；图6为馏分c2.1-馏分c2.2的流出顺序示意图；图7为化合物2和化合物5的流出顺序示意图；图8为馏分b1-馏分b5的流出顺序示意图；图9为蛋巢菌素化合物1的红外谱图；图10为蛋巢菌素化合物2的红外谱图；图11为蛋巢菌素化合物3的红外谱图；图12为蛋巢菌素化合物4的红外谱图；图13为蛋巢菌素化合物5的红外谱图；图14为蛋巢菌素化合物6的氢谱图；图15为蛋巢菌素化合物6的碳谱图；图16为蛋巢菌素化合物6的红外谱图；图17为蛋巢菌素化合物7的质谱图；图18为蛋巢菌素化合物8的质谱图；图19为蛋巢菌素化合物9的质谱图；图20为蛋巢菌素化合物10的质谱图；具体实施方式本发明的10个化合物蛋巢菌素1-10是从一株非洲黑蛋巢菌cyathusafricanus的发酵液中分离得到的。该非洲黑蛋巢菌购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为：cgmcc5.1163；菌种保藏于西北农林科技大学化学与药学院天然药物化学研究中心，编号为：(no.ca20150728)。该非洲黑蛋巢菌的保藏及活化培养条件为：保藏菌种采用pda斜面培养基。活化菌种，将菌种接种于pda平皿中，于28℃活化培养7天，至平皿上长满菌丝体。pda平板培养基：每升培养基含200g土豆，20g葡萄糖，16g琼脂粉。一、本发明的化合物的提取方法、鉴定及抗神经炎症测定及应用：1、实验材料培养基：酵母蛋白胨培养基：葡萄糖20g，酵母提取物2g，蛋白胨5g，mgso4.7h2o0.5g，kh2po41g，水1000ml，ph＝6.5；试剂与仪器：常用有机溶剂：三氯甲烷，甲醇，乙酸乙酯，石油醚、丙酮等均为工业试剂，重蒸后使用。有机溶剂：色谱甲醇，色谱乙腈等视实际使用情况使用分析纯或色谱纯试剂。以下除特殊说明外，试剂用量均为体积比。常用仪器：旋光仪rudolphautopolⅲ型；高效液相色谱仪：waters1525；紫外光谱仪：thermoevolution-300型；核磁共振：brukeravanceⅲ500(tms内标)；低分辨质谱仪：thermofisherltqfleet型。旋转蒸发仪：büchirotavaporr-101、r-3hb型；低温冷却液循环泵：dlsb-10/20型(郑州长城科工贸有限公司)；循环水式多用真空泵：shb-ⅲ型(郑州长城科工贸有限公司)；超净工作台：sw-oj-2f型(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)；立式蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。柱层析硅胶(100-200目、200-300目及300-400目)及薄层层析硅胶(硅胶h)均为青岛海洋化工厂生产；液相色谱柱：hypersilbds5μmc18(250×4.6and250×10；thermo)；羟丙基葡聚糖凝胶sephadexlh-20和rp-c18反向硅胶均为merck公司生产。1.1非洲黑蛋巢菌的发酵培养：发酵培养条件包括：取活化好的非洲黑蛋巢菌菌饼(7mm2)接种于200ml酵母蛋白胨液体培养基上，200ml酵母蛋白胨液体培养基放置在500ml锥形瓶中进行培养；培养条件为28℃，130rpm条件下培养28天；发酵共得到40l发酵液。非洲黑蛋巢菌菌饼的活化方法：将非洲黑蛋巢菌菌种接种于pda平皿(pda平板培养基)中，于28℃活化培养7天，至平皿上长满菌丝体。pda平板培养基：每升培养基含200g土豆，20g葡萄糖，16g琼脂粉。1.2化合物提取分离：将1.1中得到的发酵液浓缩后，依次经有机溶剂萃取和柱层析梯度洗脱处理得到馏分a、馏分b、馏分c、馏分d、馏分e和馏分f，具体的有机溶剂可以为乙酸乙酯，层析柱为rp-18，梯度洗脱条件为甲醇:水(10％→100％)；馏分e再经硅胶柱层析后得到馏分e1、馏分e2、馏分e3、馏分e4和馏分e5；馏分e2纯化后得到蛋巢菌素化合物1，馏分e3纯化得到蛋巢菌素化合物7，纯化方法可以为经凝胶柱lh-20和半制备型hplc；馏分e4经凝胶柱lh-20洗脱后，再经过硅胶柱层析洗脱，最后得到蛋巢菌素化合物8和蛋巢菌素化合物6；馏分d依次通过凝胶柱lh-20和硅胶柱层析洗脱后得到馏分d1、d2、d3、d4和d5，馏分d3纯化后得到蛋巢菌素化合物10，纯化方法为依次通过凝胶柱lh-20和硅胶柱层析洗脱后进一步用半制备型hplc进行处理；馏分c通过硅胶色谱柱，氯仿:甲醇(50:1→10:1)分离，依次得到馏分c1、c2、c3、c4和c5，馏分c2通过凝胶柱lh-20后得到馏分c2.1和馏分c2.2，馏分c2.1纯化后得到蛋巢菌素化合物3，纯化方法为通过半制备型hplc；馏分c2.2通过硅胶柱层析洗脱得到蛋巢菌素化合物2和蛋巢菌素化合物5；馏分b通过硅胶色谱柱，氯仿:甲醇(50:1→10:1)分离，依次得到馏分b1、b2、b3、b4和b5，馏分b3纯化后得到的蛋巢菌素化合物9，纯化方法为通过凝胶柱lh-20后用制备薄层色谱处理；馏分b4依次通过凝胶柱lh-20和硅胶柱层析洗脱得到蛋巢菌素化合物4；具体的蛋巢菌素类化合物的提取方法包括:将1.1中得到的40l发酵液浓缩至5l，等体积比加入乙酸乙酯萃取3次，得到粗提物30.2g用rp-18柱划段，用甲醇:水(10％→100％)梯度洗脱，依次获得6个馏分a-f(具体见图1)。馏分e通过硅胶色谱柱，氯仿:甲醇(体积比50:1→10:1)分离，依次得到5个馏分(e1-e5)(具体见图2)，馏分e2依次通过凝胶柱lh-20(溶剂为甲醇)和半制备型hplc(55％，甲醇-水，2ml/min)进一步纯化，得到蛋巢菌素化合物1(tr＝13.0min，200.0mg)。馏分e3依次通过凝胶柱lh-20(溶剂为甲醇)和半制备型hplc(90％，甲醇-水，2ml/min)进一步纯化，得到的蛋巢菌素化合物7(tr＝9.0min，8.0mg)。馏分e4依次通过凝胶柱lh-20(溶剂为甲醇)和硅胶柱层析洗脱(氯仿:甲醇，20:1)得到蛋巢菌素化合物8(5.5mg)和蛋巢菌素化合物6(7.2mg)(具体见图3)。馏分d通过硅胶色谱柱，氯仿:甲醇(50:1→10:1)分离，依次得到5个馏分(d1-d5)(具体见图4)，馏分d3依次通过凝胶柱lh-20(溶剂为甲醇)后,硅胶柱层析洗脱(氯仿:甲醇，20:1)后进一步用半制备型hplc(39％，甲醇-水，2ml/min)纯化，得到蛋巢菌素化合物10(tr＝30.0min，6.0mg)。馏分c通过硅胶色谱柱，氯仿:甲醇(50:1→10:1)分离，依次得到5个馏分(c1-c5)(具体见图5)，馏分c2通过凝胶柱lh-20(溶剂为甲醇)后分为2部分，c2.1和c2.2(具体见图6)。馏分c2.1通过半制备型hplc(40％，甲醇-水，2ml/min)纯化，得到蛋巢菌素化合物3(tr＝13.5min，4.2mg)。馏分c2.2通过硅胶柱层析洗脱(氯仿:甲醇，40:1)得到蛋巢菌素化合物2(7.3mg)和蛋巢菌素化合物5(6.0mg)(具体见图7)。馏分b通过硅胶色谱柱，氯仿:甲醇(50:1→10:1)分离，依次得到5个馏分(b1-b5)(具体见图8)，馏分b3通过凝胶柱lh-20(溶剂为甲醇)后用制备薄层色谱(氯仿:甲醇，20:1)制备进一步纯化，得到的蛋巢菌素化合物9(8.3mg)。馏分b4依次通过凝胶柱lh-20(溶剂为甲醇)和硅胶柱层析洗脱(氯仿:甲醇，25:1)得到蛋巢菌素化合物4(5.4mg)。1.3.十个蛋巢菌素化合物的理化性质分别为：表1蛋巢菌素化合物1-101hnmr数据表2蛋巢菌素化合物1-1013cnmr数据本发明的蛋巢菌素化合物1理化性质为：c20h30o4，白色粉末。[α]d25＝-82.0(c＝0.17,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):230(3.06)nm；ir(kbr):νmax＝3451,2958,2866,2082,1640,1050cm-1；hr-esi-ms:m/z357.2032[m+na]+；1h-nmr谱和13c-nmr谱数据见表1和表2；红外谱图见图9。本发明的蛋巢菌素化合物2理化性质为：c20h28o5，白色粉末。[α]d25＝-77.9(c＝0.19,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):214(3.10)nm；ir(kbr):νmax＝3374,2939,2872,1696,1384,1031cm-1；hr-esi-ms:m/z371.1825[m+na]+；1h-nmr谱和13c-nmr谱数据见表1和表2，红外谱图见图10。本发明的蛋巢菌素化合物3理化性质为：c20h30o5，白色粉末。[α]d25＝-66.5(c＝0.18,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):230(2.85)nm；ir(kbr):νmax＝3369,2933,2870,1648,1046,982cm-1；hr-esi-ms:m/z373.1982[m+na]+；1h-nmr谱和13c-nmr谱数据见表1和表2；红外谱图见图11。本发明的蛋巢菌素化合物4理化性质为：c20h28o5，黄色油状。[α]d25＝-105.7(c＝0.09,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):230(3.36)nm；ir(kbr):νmax＝3417,2962,2874,1689,1593,1383cm-1；hr-esi-ms:m/z371.1825[m+na]+；1h-nmr谱和13c-nmr谱数据见表1和表2；红外谱图见图12。本发明的蛋巢菌素化合物5理化性质为：c20h30o5，白色固体。[α]d25＝-47.1(c＝0.09,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):231(3.30)nm；ir(kbr):νmax＝2961,2384,2310,1738,1366,1218cm-1；hr-esi-ms:m/z373.1985[m+na]+；1h-nmr谱和13c-nmr谱数据见表1和表2，红外谱图见图13。本发明的蛋巢菌素化合物6理化性质为：c20h30o5，白色粉末。[α]d25＝-68.4(c＝0.07,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):230(3.46)nm；ir(kbr):νmax＝2935,1735,1687,1606,1369,1217cm-1；hr-esi-ms:m/z373.1985[m+na]+；1h-nmr谱和13c-nmr谱数据见表1和表2；氢谱图、碳谱图和红外谱图分别见图14、15和16。本发明的蛋巢菌素化合物7理化性质为：c20h30o4，白色粉末。[α]d25＝-157.6(c＝0.11,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):230(3.25)nm；esi-ms(positive)m/z:357.30[m+na]+；1h-nmr谱和13c-nmr谱数据见表1和表2；红外谱图见图17。本发明的蛋巢菌素化合物8理化性质为：c20h32o4，白色粉末。[α]d25＝-5.88(c＝0.55,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):213(2.23)nm；esi-ms(positive)m/z:359.30[m+na]+；1h-nmr谱和13c-nmr谱数据见表1和表2，质谱图见图18。本发明的蛋巢菌素化合物9理化性质为：c20h30o5，黄色固体；[α]d25＝-28.6(c＝0.46,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):230(2.72)nm；esi-ms(positive)m/z:701.58[2m+h]+；1h-nmr谱和13c-nmr谱数据见表1和表2，质谱图见图19。本发明的蛋巢菌素化合物10理化性质为：c20h28o4，黄色油状。[α]d25＝-157.8(c＝0.09,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):230(3.34)nm；esi-ms(negative)m/z:663.53[2m-h]-；1h-nmr谱和13c-nmr谱数据见表1和表2；质谱图见图20。1.4蛋白质印迹分析(westernblotanalysis)药物处理后，参照文献[4]中所描述的方法提取细胞蛋白，并利用蛋白免疫印迹法分析蛋白表达。简言之，取蛋白质样品加上样缓冲液煮沸变性后，于10％sds-page电泳，并转移到硝酸纤维膜上。将膜置于含5％bsa的tbst溶液4度封闭过夜后，再置于含有inos,cox-2和gapdh的一抗(cellsignalingtechnology,boston,ma,usa)溶液中4度孵育4h,tbst漂洗3次，随后置于含辣根过氧化物酶标记的二抗溶液中，4度孵育3h,洗膜后，按照gehealthcare公司ecl试剂盒说明进行测试。表3为测定结果。[4]chengy,yangc,zhaoj,tsehf,rongj.proteomicidentificationofcalcium-bindingchaperonecalreticulinasapotentialmediatorfortheneuroprotectiveandneuritogenicactivitiesoffruit-derivedglycosideamygdalin.jnutrbiochem.2015,26(2):146-54)表3.蛋巢菌素化合物1-10对两种酶的抑制活性化合物编号环氧合酶-2一氧化氮合酶117.545.92-12.117.53-104.529.6417.541.7527.835.9622.751.0753.960.1815.550.5942.655.410-45.170.3蛋巢菌素化合物7和蛋巢菌素化合物9对环氧合酶-2的抑制率分别为53.9％和42.6％；蛋巢菌素化合物6，7，8，9和10对一氧化氮合酶的抑制率分别为51.0％，60.1％，50.5％，55.4％和70.3％。特别是，蛋巢菌素化合物10高选择性地抑制一氧化氮合酶活性，抑制率高达70.3％。结果表明这些化合物作为神经炎症抑制剂能够用于治疗神经退行性疾病。当前第1页12