本发明属于分子生物学、病毒学和免疫学领域，涉及一种用于制备柯萨奇病毒a16型病毒样颗粒的核酸构建体和方法。本发明还涉及包含所述核酸构建体的重组载体和重组宿主细胞。本发明还涉及一种串联共表达柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp1、vp2、vp3和vp4的方法以及纯化方法、一种制备柯萨奇病毒a16型的病毒样颗粒的方法、以及一种制备手足口病疫苗的方法。此外，本发明还涉及上述核酸构建体、重组载体或者重组宿主细胞在制备治疗和/或预防和/或辅助治疗柯萨奇病毒a16型感染或者柯萨奇病毒a16型感染所致疾病(例如手足口病)的药物特别是疫苗中的用途。进一步地，本发明还涉及一种柯萨奇病毒a16型病毒样颗粒以及含有它的药物组合物例如疫苗。
背景技术：
肠道病毒(enterovirus)又称肠病毒，是一种主要生长于肠道的rna病毒，常见的肠病毒有：柯萨奇病毒(coxsackievirus)包括a型23种与b型6种，echovirus伊科病毒31种，和造成小儿麻痹症的poliovirus脊髓灰质炎病毒3种，以及不分类的肠病毒68～71型，共67种。近年在亚洲和北美洲流行、可以引起手足口病的柯萨奇病毒a16型就是其中的一种。2014年8月开始在美国中部10多个州区域爆发，已感染上千名儿童的ev-d68肠病毒也是其中的一种。各型之间无交叉保护反应。而1994年英国最大一次手足口病流行是由柯萨奇病毒a16型引起的。柯萨奇病毒a16型的流行分布广、发病人数多，常常占到手足口发病的60％，其次是肠病毒71型。
其中柯萨奇病毒a16型是直径为23到30nm的正20面立体对称的球形颗粒，无包膜和突出。其核酸为单股正链小rna病毒，其基因组含有大约7410个核苷酸。rna中仅有一个开放阅读框(orf)，编码含2194个氨基酸的多聚蛋白，在其两侧为5′和3′非编码区(utrs)。如同其他肠道病毒属成员一样，柯萨奇病毒a16型基因组编码分子量分别为34kd、30kd、26kd和7kd的多肽vp1、vp2、vp3和vp4，构成原聚体，后者再拼装成具有五聚体样结构的亚单位，60个亚单位组装成病毒的外壳。vp1-vp3分布在病毒外壳表面，而vp4包埋在病毒外壳的内侧与内部rna结合。抗原决定簇基本上位于vp1和vp3上。而vp1蛋白由891bp的核苷酸所编码的297个氨基酸构成，包含病毒主要的中和抗原表位，也是血清学定型和基因型分型的主要依据。
手足口病主要发生在10岁以下儿童，5岁以下儿童风险最高，年龄小的儿童比年龄大的儿童症状更严重，青少年和成人也可感染手足口病。手足口病有周期性流行的趋势。柯萨奇病毒a16型感染引起的手足口病可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。近年来，包括柯萨奇病毒a16型在内的肠病毒引起的手足口病新发疫情令人担忧。在2011年报告了160万手足口病病例，其中509例死亡。
在中国，手足口病灭活苗iii期临床数据显示，中国研发的手足口病病毒(ev71)灭活苗有很好的保护效果，这为大规模预防和控制手足口病毒的蔓延和爆发奠定了基础。但由于病毒毒力返强、病毒灭活不彻底、活病毒逃逸等不安全因素，灭活疫苗中残存的活病毒在理论上有可能会造成手足口病的泛滥。而且，对应柯萨奇病毒a16型，目前没有任何疫苗产品。
理想的手足口病病毒疫苗必须安全、有效、同时还应具备价廉、易于推广等优点。手足口病灭活疫苗除了存在潜在的不安全性影响其使用外，灭活疫苗的高制备成本有可能会限制该疫苗的推广。因此如何研制和生产保护性和安全性俱佳的人手足口病病毒基因工程疫苗(例如针对柯萨奇病毒a16型的疫苗)，并且大幅度节约生产成本，成为研发的主要方向。
基因工程技术为基础的以病毒样颗粒为主的基因工程疫苗已经成功运用于现代疫苗的研发与生产。但是基因工程疫苗通常采用真核表达系统。生产成本偏高，不适合大规模推广。
大肠杆菌表达系统是目前应用最为广泛的基因工程表达系统之一。由于该表达系统具有易于培养，不需要复杂设备，安全性高等显著特点，因此被广泛应用生物制药行业中。糖基化修饰是真核表达系统和原核表达系统的主要区别之一，但是没有报道提到柯萨奇病毒a16型的衣壳蛋白(包括vp1，vp2，vp3和vp4)含有任何糖基化位点，因此用真核和原核这两种系统表达的柯萨奇病毒a16型的衣壳蛋白在糖基化修饰方面并没有区别。尽管如此，本发明人前期的研究表明，在大肠杆菌中单独或共表达装载柯萨奇病毒a16型外壳蛋白基因的质粒获得的外壳蛋白表达量非常低而且常常不可溶，因此失去了大规模商业应用的可能性。
综上所述，针对人手足口病病毒特别是柯萨奇病毒a16型引发的手足口病的防制需要，不仅迫切需要建立一种生产周期短，生产成本低，蛋白产量高的大肠杆菌来源的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白和病毒样颗粒的制备方法，更重要的是，蛋白能够正确折叠，得到需要的正确构象，组成病毒的外壳，能够在结构上高度模拟天然的柯萨奇病毒a16型构象。
技术实现要素：
本发明人在前期研究中发现，如果将构成手足口病病毒柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白的4个蛋白/多肽(vp1，vp2，vp3和vp4)分别表达，存在的问题是：或者这几个蛋白不能在大肠杆菌中分别表达，或者分别表达后，处于错误折叠的状态(如后面的对比例1的实验结果所证明)。另外，如果将其中两个蛋白的基因融合后再与另外两个蛋白进行共表达，蛋白不能有效表达或者不溶，难以在结构上高度模拟天然的柯萨奇病毒a16型的构象(如后面的对比例2的实验结果所证明)。
另一方面，本发明人在试图将上述4个蛋白进行串联共表达时遇到了极大的技术困难：(1)随着基因片段数目的增加，能使用的酶切位点越来越少，克隆的成功几率明显降低，到一定程度，将没有合适的酶切位点能够使用。例如，当串联表达3个基因时，用传统方法理论上要使用可能高达6个酶切位点，当串联表达4个基因时，用传统方法理论上要使用可能高达8个酶切位点，当串联表达5个基因时，用传统方法理论上要使用可能高达10个酶切位点。通常能够获得的用于蛋白表达的质粒都没有这么多可用的酶切位点。(2)当在同一个质粒中加载的基因序列(包括调控序列、连接序列等)越来越多时，质粒会变得越来越大，蛋白表达效率会越来越低，特别是那些加载在启动子和核糖体结合位点最下游基因的表达，变得极其困难。因此要保证这些串联的蛋白每一个都要能够高效表达，并且表达量能够保持在基本相同的水平，没有一个或几个蛋白的表达远远高于或低于其他蛋白的表达，并且可溶，而且能组装成病毒样颗粒，技术上有极大的难度。
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，巧妙地构建了一种核酸构建体和重组表达载体，有效、可溶地表达并纯化了人手足口病病毒(柯萨奇病毒a16型)衣壳蛋白，并且其组成的柯萨奇病毒a16型病毒样颗粒与天然的柯萨奇病毒a16型构象高度接近，具有应用于制备治疗和/或预防和/或辅助治疗柯萨奇病毒a16型感染或者柯萨奇病毒a16型感染所致疾病(例如手足口病)的药物(例如疫苗)的潜力。由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及一种核酸构建体，其包含如下的核酸分子1至4：
核酸分子1：编码柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp1，
核酸分子2：编码柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp2，
核酸分子3：编码柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp3，和
核酸分子4：编码柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp4。
根据本发明任一项所述的核酸构建体，其中，所述核酸分子1至4各自独立地为单拷贝或多拷贝，例如2、3、4或5拷贝；优选地，所述核酸分子1至4均为单拷贝。
根据本发明任一项所述的核酸构建体，其中，所述核酸构建体还包含可操作地连接的1个或多个调控序列。
根据本发明任一项所述的核酸构建体，其中，核酸分子1与核酸分子3相邻，核酸分子2与核酸分子4相邻，例如从5’端开始，核酸分子1、2、3、4的顺序依次为1-3-2-4、1-3-4-2、3-1-2-4、3-1-4-2、2-4-1-3、2-4-3-1、4-2-1-3或者4-2-3-1；优选为3-1-2-4或者3-1-4-2；更优选为3-1-2-4。
本发明人在研究中发现，柯萨奇病毒a16型四个衣壳蛋白串联表达的顺序有可能会对蛋白的表达量，可溶性以及蛋白表达量之间的比例有很大的影响。本发明人进一步发现，vp1和vp3相邻，并且vp2和vp4相邻的串联表达顺序更有可能获得高表达的可溶蛋白。4个蛋白串联表达的顺序包括：vp1324、vp1342、vp3124、vp3142、vp2413、vp2431、vp4213、vp4231。优选地，为vp3124。后面的对比例3的实验结果证明了上述发现。
其中，术语“vp1和vp3相邻”的含义是指编码衣壳蛋白vp1的核酸序列和编码vp3的核酸序列之间不再含有编码vp2或者vp4的核酸序列；编码vp1的核酸序列和编码vp3的核酸序列之间可以不含有任何序列，也可以含有除了编码vp2的核酸序列和编码vp4的核酸序列之外的其它序列，例如调控蛋白表达的序列、不影响蛋白表达的序列等。术语“vp2和vp4相邻”也可做类似的理解。
其中，术语“vp1324”的含义是指4个衣壳蛋白串联表达的顺序依次为vp1-vp3-vp2-vp4。其它的vp1342、vp3124、vp3142、vp2413、vp2431、vp4213、vp4231也可以做类似的理解。
根据本发明任一项所述的核酸构建体，其中：
柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp1的氨基酸序列如seqidno:1所示，
柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp2的氨基酸序列如seqidno:2所示，
柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp3的氨基酸序列如seqidno:3所示，和/或
柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp4的氨基酸序列如seqidno:4所示。
在本发明一个具体的实施方案中，所述的核酸构建体，其中柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp1至vp4的氨基酸序列分别如seqidno:1至seqidno:4所示。
本发明中的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp1，vp2，vp3和vp4不仅包括如seqidno:1至seqidno:4所示氨基酸序列的蛋白，还包括对vp1，vp2，vp3和/或vp4的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的取代、缺失、插入、修饰、替换或删除但保持蛋白原有功能的蛋白，以及来源于蛋白序列高度相似的其他柯萨奇病毒a16型亚型、血统型(lineage)以及突变株的蛋白和蛋白片段。
本领域技术人员知悉，柯萨奇病毒a16型分离是根据柯萨奇病毒a16型的vp1基因序列分型的。柯萨奇病毒a16型病毒vp1编码基因的分子流行病学分析揭示。柯萨奇病毒a16型毒株在系统发生树上可分为a、b、c3个基因型，而c基因型进一步分为c1、c2和c3三个基因亚型。对应b基因型，则可进一步分成b1和b2两个亚型，b1亚型可分为b1a、b1b、b1c三个进化分支，其中的b1a、b1b是现在世界上最主要的进化分支。不同亚型还可以继续细分为各种血统型(lineage)。
本发明的seqidno:1至seqidno:4所示氨基酸序列对应的柯萨奇病毒a16型病毒属于柯萨奇病毒a16型b1亚型。序列的相同性(identity)高于80％，决定了不同亚型在结构上高度类似，也决定了病毒样颗粒组装方式的高度相似性。
保守性取代的例子是在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)内进行的取代。通常不会改变特异活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如h.neurath和r.l.hill，1979，在《蛋白质》一书，academicpress,newyork中描述过。最常见的替换是ala/ser、val/ile、asp/glu、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、tyr/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、leu/ile、leu/val、ala/glu、asp/gly以及反向进行的替换。因此，本发明还涉及上述氨基酸替换得到的多肽。
根据本发明任一项所述的核酸构建体，其中：
核酸分子1的序列如seqidno:5所示，
核酸分子2的序列如seqidno:6所示，
核酸分子3的序列如seqidno:7所示，和/或
核酸分子4的序列如seqidno:8所示。
在本发明一个具体的实施方案中，所述的核酸构建体，其中核酸分子1至4的序列分别如seqidno:5至seqidno:8所示。
根据蛋白序列反向翻译可获得对应的核苷酸三联密码子组成的核酸序列，而且本领域技术人员知晓，鉴于密码子的简并性，不同的核苷酸三联密码子有可能决定相同的氨基酸序列，因此理论上核酸分子1至4的序列有很多种可能性。
不同的表达宿主对密码子的偏好性不同，因此表达同一个氨基酸的不同的三联密码子可能影响目的蛋白的表达。大肠杆菌宿主对亮氨酸，精氨酸，异亮氨酸和脯氨酸的密码子的偏好性与病毒对上述氨基酸的密码子偏好性明显不同。为了在大肠杆菌中更好地表达目的蛋白，本发明人针对所有的氨基酸，选用了大肠杆菌最偏好的核苷酸三联密码子。同时本发明人也兼顾了这些核苷酸组合在三维结构上的稳定性。经过深入的研究和探索，本发明人得到了优化的核酸分子1至4，其序列分别如seqidno:5至seqidno:8所示。
根据本发明任一项所述的核酸构建体，其中，在核酸分子1、2、3、4各自的上游，任选地含有一个或多个rbs序列，所述rbs序列相同或不同；所述rbs序列在转录后成为mrna上核糖体的结合位点例如sd序列；优选地，所述rbs序列为aaggag。其中说明的是，所述“rbs序列相同或不同”不仅包括核酸分子1、2、3和4之间各自的rbs序列相同或不同，还包括对于同一个核酸分子1、2、3或4中，当其上游包含多个rbs序列时，这多个rbs序列也可以相同或不同。
根据本发明任一项所述的核酸构建体，其中，在rbs序列和核酸分子1之间、在rbs序列和核酸分子2之间、在rbs序列和核酸分子3之间和/或在rbs序列和核酸分子4之间任选地含有一个或多个小分子蛋白融合标签的编码序列；所述小分子蛋白融合标签相同或不同的；优选地，所述小分子蛋白融合标签为sumo；优选地，所述sumo的氨基酸序列如seqidno:9所示；更优选地，所述sumo的编码序列如seqidno:10所示。其中说明的是，所述“小分子蛋白融合标签相同或不同”不仅包括核酸分子1、2、3和4之间各自编码的小分子蛋白融合标签相同或不同，还包括对于同一个核酸分子1、2、3或4中，当其包含多个小分子蛋白融合标签的编码序列时，这多个小分子蛋白融合标签也可以相同或不同。
根据本发明任一项所述的核酸构建体，其中，从5’端开始，所述核酸构建体依次包含：
rbs序列、sumo编码序列、核酸分子3；
rbs序列、sumo编码序列、核酸分子1；
rbs序列、sumo编码序列、核酸分子2；以及
rbs序列、sumo编码序列、核酸分子4；优选地，所述rbs序列为单拷贝或多拷贝，所述sumo编码序列为单拷贝或多拷贝；所述核酸分子1至4各自独立地为单拷贝或多拷贝。优选地，所述rbs序列、sumo编码序列、核酸分子1至4均为单拷贝。
根据本发明任一项所述的核酸构建体，其核苷酸序列如seqidno:11所示。
对于蛋白表达来说，理论上，rbs序列、sumo序列以及核酸分子1至4之间可以插入很多不同的序列(本领域技术人员知悉，要获得高量表达，这些插入序列要仔细研究和试验)。在rbs序列和sumo编码序列中可以插入任何序列，可以是任何整数，如1，2，3…。在sumo编码序列和核酸分子3之间在不破坏酶切识别位点的基础上，可以插入任何不是终止密码子的3的倍数的核苷酸序列。在seqidno:11中，rbs序列、sumo序列以及核酸分子1至4之间有其它序列，这些序列是从petsumo和pet28b的载体上扩增来的，在不影响蛋白表达的前提下，本领域技术人员能够对所述“其它序列”进行适当的删除、替换和修饰。
本发明的另一方面涉及一种重组载体，其包含本发明中任一项所述的核酸构建体；优选地，为重组表达载体；更优选地，为重组pet类载体，例如重组pet28b载体。
本发明的再一方面涉及一种重组宿主细胞，其包含本发明中任一项所述的核酸构建体，或者包含本发明的重组载体；优选地，所述重组宿主细胞为重组大肠杆菌细胞；优选地，所述大肠杆菌细胞选自bl21(de3)、b834(de3)、blr(de3)、jm109、xl1blue、er2566、rosetta和gi698；优选bl21(de3)。
本发明的再一方面涉及选自如下的(1)至(3)中任一项所述的方法：
(1)一种串联共表达柯萨奇病毒a16型病毒衣壳蛋白vp1、vp2、vp3和vp4的方法，包括使用本发明中任一项所述的核酸构建体、本发明的重组载体或者本发明的重组宿主细胞的步骤；
(2)一种纯化柯萨奇病毒a16型病毒衣壳蛋白vp1、vp2、vp3和vp4的方法，包括下述步骤：将方法(1)中表达的蛋白产物进行亲和色谱纯化(例如使用nisepharose层析介质)、去除小分子蛋白融合标签后进行亲和色谱纯化(例如使用nisepharose层析介质)和疏水色谱纯化(例如使用butylsepharose层析介质)；
(3)一种制备柯萨奇病毒a16型病毒的病毒样颗粒的方法，包括前面(1)至(2)中所述的步骤；
(4)一种制备手足口病疫苗的方法，包括前面(1)至(3)中所述的步骤。
色谱层析分离方法条件温和，没有使用诸如尿素等变性剂，目的蛋白的活性得到了最大程度的保护，对蛋白质的结构没造成破坏，这保证了纯化获得的手足口病病毒衣壳蛋白保持了天然活性，各手足口病病毒衣壳蛋白之间最大程度保持了天然的结合活性。而且，在色谱纯化过程中，整个工艺流程简单，无需进行缓冲液置换等步骤，不需要使用超离心等复杂工艺，并且两步色谱的回收接近30％，使得以工业化规模可溶性表达纯化柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白成为可能，而且整个工艺过程中，均未涉及到变性剂，纯化过程和组装过程均不会对蛋白的构象产生影响和破坏病毒样颗粒的中和表位，这样生产的病毒样颗粒具有高度的免疫原性，免疫机体后会诱导产生高滴度的中和抗体，起到很好的保护性效果。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的核酸构建体、本发明的重组载体或者本发明的重组宿主细胞在制备治疗和/或预防和/或辅助治疗柯萨奇病毒a16型感染或者柯萨奇病毒a16型感染所致疾病的药物中的用途；优选地，所述柯萨奇病毒a16型感染所致疾病为手足口病；优选地，所述药物为疫苗。
本发明的再一方面一种柯萨奇病毒a16型病毒样颗粒，其由柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp1、vp2、vp3和vp4组成；优选地，所述柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp1、vp2、vp3和vp4由上述(1)中的方法制得。
本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明述的病毒样颗粒，以及药学上可接受的载体或赋形剂；优选地，所述赋形剂为疫苗用载体或赋形剂。
下面对本发明涉及的部分术语进行解释。
术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的，在此举例但不限于：bl21(de3)，b834(de3)，blr(de3)，jm109，xl1blue，er2566，rosetta，gi698。优选bl21(de3)。
术语“载体”一词指的是，可将某编码蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可以通过转化，转导或者转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。
术语“串联共表达”一词指的是把多个基因插入到同一个载体中共表达。
术语“疫苗用赋形剂或载体”是指选自一种或多种，包括但不限于：ph调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，ph调节剂举例但不限于磷酸盐缓冲液，表面活性剂包括阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂。举例但不限于:tween-80。佐剂举例但不限于氢氧化铝，氟氏完全佐剂。离子强度增强剂举例但不限于氯化钠。
术语“色谱层析”包括但不限于：离子交换色谱(例如阳离子交换色谱)、疏水相互作用色谱、吸附层析法(例如羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤(凝胶排阻)层析法、亲和层析法、分子筛层析法。
在本发明获得的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp1，vp2，vp3和vp4的方法中，缓冲液是指可在一定范围内维持ph值稳定的溶液，包括但不限于，tris缓冲液，磷酸盐缓冲液，hepes缓冲液，mops缓冲液等等。
所述原核宿主细胞破碎包括但不限于通过匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压挤压、溶菌酶处理中的一项或者多项方法来实现。
在本发明获得的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp1，vp2，vp3和vp4蛋白的方法中，所用的盐包括但不限于是中性盐，特别是碱金属盐、铵盐、盐酸盐、硫酸盐，硫酸盐，碳酸氢盐，磷酸盐或磷酸氢盐，特别是nacl、kcl、nh4cl、(nh4)2so4中的一种或几种。优选nacl。
柯萨奇病毒a16型病毒样颗粒以如下方式获得：将酶切去除sumo标签的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp1，vp2，vp3和vp4的蛋白溶液通过例如色谱层析进一步分离，得到纯化的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp1，vp2，vp3和vp4的蛋白溶液。柯萨奇病毒a16型病毒样颗粒组装的方式包括但不限于本领域已知技术，例如，透析，超滤或者层析等。
术语“核酸构建体”，在文中定义为单链或双链核酸分子，优选是指人工构建的核酸分子。可选地，所述核酸构建体还包含可操作地连接的1个或多个调控序列，所述调控序列在其相容条件下能指导编码序列在合适的宿主细胞中进行表达。表达应理解为包括蛋白或多肽生产中所涉及的任何步骤，包括，但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
术语“编码序列”在文中定义为核酸序列中直接确定其蛋白产物的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mrna5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mrna3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括，但不限于dna、cdna和重组核酸序列。
本文中术语“调控序列”定义为包括表达本发明肽所必需或有利的所有组分。每个调控序列对于编码蛋白或多肽的核酸序列可以是天然含有的或外来的。这些调控序列包括，但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。最低限度，调控序列要包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了导入特定的限制位点以便将调控序列与编码蛋白或多肽的核酸序列的编码区进行连接，可以提供带接头的调控序列。术语“可操作连接”在文中定义为这样一种构象，其中调控序列位于相对dna序列之编码序列的适当位置，以使调控序列指导蛋白或多肽的表达。
调控序列可以是合适的启动子序列，即可被表达核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。启动子序列含有介导蛋白或多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选宿主细胞中有转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，可以得自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内蛋白或多肽多肽的基因。
调控序列还可以是合适的转录终止序列，即能被宿主细胞识别从而终止转录的一段序列。终止序列可操作连接在编码蛋白或多肽的核酸序列的3’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何终止子都可以用于本发明。
调控序列还可以是合适的前导序列，即对宿主细胞的翻译十分重要的mrna非翻译区。前导序列可操作连接于编码多肽的核酸序列的5’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何前导序列均可用于本发明。
调控序列还可以是信号肽编码区，该区编码一段连在蛋白或多肽氨基端的氨基酸序列，能引导编码多肽进入细胞分泌途径。核酸序列编码区的5’端可能天然含有翻译读框一致地与分泌多肽的编码区片段自然连接的信号肽编码区。或者，编码区的5’端可含有对编码序列是外来的信号肽编码区。当编码序列在正常情况下不含有信号肽编码区时，可能需要添加外来信号肽编码区。或者，可以用外来的信号肽编码区简单地替换天然的信号肽编码区以增强多肽分泌。但是，任何能引导表达后的多肽进入所用宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区都可以用于本发明。
调控序列还可以是肽原编码区，该区编码位于多肽氨基末端的一段氨基酸序列。所得多肽被称为酶原或多肽原。多肽原通常没有活性，可以通过催化或自我催化而从多肽原切割肽原而转化为成熟的活性多肽。
在多肽的氨基末端即有信号肽又有肽原区时，肽原区紧邻多肽的氨基末端，而信号肽区则紧邻肽原区的氨基末端。
添加能根据宿主细胞的生长情况来调节多肽表达的调控序列可能也是需要的。调控系统的例子是那些能对化学或物理刺激物(包括在有调控化合物的情况下)作出反应，从而开放或关闭基因表达的系统。调控序列的其他例子是那些能使基因扩增的调控序列。在这些例子中，应将编码蛋白或多肽的核酸序列与调控序列可操作连接在一起。
发明的有益效果
本发明实现了人手足口病病毒(柯萨奇病毒a16型)衣壳蛋白在大肠杆菌中可溶共表达，并且表达量较高，最终获得的目的蛋白约占菌体可溶总蛋白的10％，其组成的柯萨奇病毒a16型病毒样颗粒与天然的柯萨奇病毒a16型构象高度接近，免疫动物后能够获得较高滴度的抗体，例如第十周抗体的滴度即能达到106的高水平(如实施例7)。
附图说明
图1：本发明带sumo标签表达的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp1，vp2，vp3和vp4的sds-page结果。m:分子量marker；1：诱导后裂解全菌后的上清；结果显示，柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白在大肠杆菌中以带sumo标签的方式可溶共表达，且目的蛋白约占菌体可溶总蛋白的10％以上。
图2：带sumo标签的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白经过亲和色谱纯化后的sds-page结果。m:分子量marker；1，经本发明纯化所得带sumo标签的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白上样2μl；2，经本发明纯化所得带sumo标签的柯萨奇病毒a16型病毒衣壳蛋白上样3μl。结果显示，经过纯化的带sumo标签的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白上样纯度达到了70％以上。
图3：带sumo标签的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白，经酶切去除sumo标签后分子筛色谱纯化的sds-page结果。1，经本发明纯化所得柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白上样1μl；2，经本发明纯化所得柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白上样2μl。结果显示，经过纯化的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白纯度达到了90％以上。
图4：本发明所得的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白病毒样颗粒透射电镜观察结果。视野中可见大量均匀半径为16nm左右的病毒样颗粒，颗粒实际大小与理论大小相符，表观状态均匀一致。
图5：本发明所得的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白病毒样颗粒的动态光散射观测结果。结果显示，柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白病毒样颗粒的水化分子动力学半径为16nm，颗粒组装百分比约为100％。
图6：本发明所得的柯萨奇病毒a16型病毒样颗粒接种小鼠后不同阶段血清总抗体滴度。图中箭头所示为免疫时间。在初免六个星期后，总抗滴度即有明显上升，在经过加强免疫后，第十周抗体的滴度即能达到106的高水平。
图7：串联共表达两个和三个柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白的sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。星号标记的位置是目的蛋白。m泳道：分子量marker；1,pet-d-coxa16-vp31质粒在iptg诱导前的全菌蛋白表达情况；2,pet-d-coxa16-vp31质粒在iptg诱导后全菌蛋白表达情况；3,pet-d-coxa16-vp31质粒在iptg诱导后细菌破碎后上清中的蛋白表达情况；4,pet-t-coxa16-vp310质粒在iptg诱导前的全菌蛋白表达情况；5,pet-t-coxa16-vp310质粒在iptg诱导后全菌蛋白表达情况；6,pet-t-coxa16-vp310质粒在iptg诱导后细菌破碎后上清中的蛋白表达情况。
图8：不同组合串联共表达柯萨奇病毒a16型四个衣壳蛋白的sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。星号标记的位置是目的蛋白。m泳道：分子量marker；1,pet-q-coxa16-vp1324质粒在iptg诱导前的全菌蛋白表达情况；2,pet-q-coxa16-vp1324质粒在iptg诱导后全菌蛋白表达情况；3,pet-q-coxa16-vp1324质粒在iptg诱导后细菌破碎后上清中的蛋白表达情况；4,pet-q-coxa16-vp1342质粒在iptg诱导前的全菌蛋白表达情况；5,pet-q-coxa16-vp1342质粒在iptg诱导后全菌蛋白表达情况；6,pet-q-coxa16-vp1342质粒在iptg诱导后细菌破碎后上清中的蛋白表达情况；7,pet-q-coxa16-vp3124质粒在iptg诱导前的全菌蛋白表达情况；8,pet-q-coxa16-vp3124质粒在iptg诱导后全菌蛋白表达情况；9,pet-q-coxa16-vp3124质粒在iptg诱导后细菌破碎后上清中的蛋白表达情况。
序列信息：
柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp1氨基酸序列(seqidno:1，297aa)
gdpiadmidqtvnnqvnrsltalqvlptaanteasshrlgtgvvpalqaaetgassnasdknlietrcvlnhhstqetaignffsraglvsiitmptmgtqntdgyanwdidlmgyaqlrrkcelftymrfdaeftfvvakpngelvpqllqymyvppgapkptsrdsfawqtatnpsvfvkmtdppaqvsvpfmspasayqwfydgyptfgehlqandldygqcpnnmmgtfsirtvgtkksphsitlrvymrikhvrawiprplrnqpylfktnpnykgndikctstsrdkittl
柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp2氨基酸序列(seqidno:2，254aa)
spsaeacgysdrvaqltignstittqeaaniviaygewpeycpdtdatavdkptrpdvsvnrfftldtkswakdskgwywkfpdvltevgvfgqnaqfhylyrsgfcvhvqcnaskfhqgallvavlpeyvlgtiaggtgnenshppyattqpgqvgavlthpyvldagiplsqltvcphqwinlrtnncatiivpymntvpfdsalnhcnfgllvipvvpldfnagatseipitvtiapmcaefaglrqavkq
柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp3氨基酸序列(seqidno:3，242aa)
giptelkpgtnqflttddgvsapilpgfhptppihipgevrnlleicrvetilevnnlktnettpmqrlcfpvsvqsktgelcaafradpgrdgpwqstilgqlcryytqwsgslevtfmfagsfmatgkmliaytppggsvpadritamlgthviwdfglqssvtlvvpwisnthyraharagyfdyyttgiitiwyqtnyvvpigapttayivalaaaqdnftmklckdtedieqtaniq
柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp4氨基酸序列(seqidno:4，69aa)
mgsqvstqrsgshensnsasegstinyttinyykdayaasagrqdmsqdpkrftdpvmdvihemapplk
柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp1核苷酸序列(seqidno:5，891bp)
ggtgatcctatcgcagacatgatcgaccagactgtaaacaaccaggtgaatcgttcgcttacagcattacaagttttgcccacagcagccaatacagaggcctctagtcatcgtttaggaacgggagtcgtcccggcgttacaagccgctgagacgggtgcttctagtaatgcaagcgacaaaaatctgattgagactcgttgcgtattgaatcaccacagtactcaggaaactgccattggtaactttttcagtcgcgcaggcttagtgtccatcatcacgatgccaacgatgggcactcagaacacagacggctatgctaattgggacattgatctgatgggatacgcccagttgcgccgtaagtgtgagttgtttacatatatgcgtttcgacgcagagttcacctttgtcgtcgccaaacccaatggggagcttgttccccaattgctgcagtacatgtacgttcctccgggcgctcctaagccaacgtctcgtgattcgttcgcctggcaaactgccacaaacccgtctgtattcgtcaagatgacggacccaccggctcaggtttctgtgccattcatgtccccggcctcggcgtaccagtggttttacgatggttatcccacgtttggagaacatttacaagcgaacgatctggactacgggcagtgtccaaacaacatgatggggactttctccattcgtacagtgggaacgaaaaagtccccccatagcatcacgttacgcgtctacatgcgcatcaagcatgtccgtgcgtggattccccgtccattgcgcaaccaaccataccttttcaaaactaatccaaattataaggggaatgacattaaatgtacttcaacgtcgcgcgataagattaccaccctt
柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp2核苷酸序列(seqidno:6，762bp)
tcccctagcgccgaagcatgtggatattctgatcgcgttgcgcaattaaccatcggcaattcaacgatcaccacccaagaagcggccaatatcgtgattgcttatggggagtggcctgaatattgcccagataccgacgctaccgcagtcgataagcccacgcgtccagatgtgtcagtcaaccgtttttttaccctggacacgaagtcttgggcgaaagactcaaaagggtggtactggaagtttccagacgtactgacggaggtgggggttttcggacaaaatgctcaatttcattatctttaccgttctgggttttgcgtgcacgtccaatgtaacgcgagcaaatttcatcaaggggctctgttagtcgccgtattaccagagtacgtcttggggacaattgcgggtgggacagggaacgaaaacagtcatcccccatacgcaactacacagccaggccaggtaggcgctgttctgactcatccttatgtactggacgccggaatccccctgtcacaattgactgtatgtcctcaccagtggatcaaccttcgcacaaataactgtgcgactattatcgtgccatacatgaataccgtaccgttcgacagtgcacttaatcactgtaattttggtcttttggtcattcctgtggtcccgctggacttcaatgccggagccactagcgaaatcccgattactgtgaccattgcaccgatgtgcgcggagttcgctggcttgcgccaagccgttaagcag
柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp3核苷酸序列(seqidno:7，726bp)
gggattccaactgagcttaaacctggcactaaccaatttttgacaacagatgatggcgtctctgcaccgattttgccaggcttccacccaaccccccctatccatattccgggagaggttcgcaatctgttggaaatttgccgcgtggagaccattttggaagtgaacaatttaaaaacgaatgaaacgacgcctatgcaacgcttatgtttccctgtttccgtgcagtcaaaaaccggcgaattgtgtgcggcattccgcgcggaccccggtcgtgatggaccttggcagagtacgatccttgggcaattgtgccgttattacacccagtggtcaggttccctggaagttacgttcatgtttgcagggagttttatggctactggtaaaatgcttattgcctatacgccaccgggggggtctgtccccgcagaccgtattactgcaatgcttgggactcacgtcatttgggattttgggcttcagtcgagcgtgacattagtagtcccatggatttcaaacacacattaccgcgcacatgctcgcgcgggctattttgattattacaccaccggtatcattaccatttggtaccagacaaattacgtagtacccatcggtgcccccaccactgcttacattgtggccctggcggcagcgcaagacaacttcactatgaaactgtgcaaagatactgaggacatcgaacaaacggccaatatccaa
柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp4核苷酸序列(seqidno:8，207bp)
atgggctcacaagtgagtacgcagcgcagcggctcgcacgaaaactcgaactcggcgtcggaaggctccaccattaactatacgaccattaattattacaaggatgcgtatgctgcctccgccgggcgtcaagatatgagtcaggaccctaaacgtttcaccgaccccgttatggatgtgattcatgaaatggccccgccgctgaaa
sumo氨基酸序列(seqidno:9，99aa)
msdsevnqeakpevkpevkpethinlkvsdgsseiffkikkttplrrlmeafakrqgkemdslrflydgiriqadqtpedldmedndiieahreqigga
sumo核苷酸序列(seqidno:10，297bp)
atgtcggactcagaagtcaatcaagaagctaagccagaggtcaagccagaagtcaagcctgagactcacatcaatttaaaggtgtccgatggatcttcagagatcttcttcaagatcaaaaagaccactcctttaagaaggctgatggaagcgttcgctaaaagacagggtaaggaaatggactccttaagattcttgtacgacggtattagaattcaagctgatcagacccctgaagatttggacatggaggataacgatattattgaggctcacagagaacagattggtggtgct
pet-q-coxa16-vp3124质粒中的核酸构建体的核酸序列(seqidno:11，5156bp)
caattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatggctcgagcttaattaacaacaccatttgtcgagaaatcataaaaaatttatttgctttgtgagcggataacaattataatagattcaattgtgagcggataacaatttcacacagaattcattaaagaggagaaattaactatgaaacatcaccatcaccatcaccatagcagcggcctggtgccgcgcggcagccatatggctagcatgtcggactcagaagtcaatcaagaagctaagccagaggtcaagccagaagtcaagcctgagactcacatcaatttaaaggtgtccgatggatcttcagagatcttcttcaagatcaaaaagaccactcctttaagaaggctgatggaagcgttcgctaaaagacagggtaaggaaatggactccttaagattcttgtacgacggtattagaattcaagctgatcagacccctgaagatttggacatggaggataacgatattattgaggctcacagagaacagattggtggtgctgcaggtacaagtttgtacaaaaaagcaggcgagaatctttattttcagggatccgggattccaactgagcttaaacctggcactaaccaatttttgacaacagatgatggcgtctctgcaccgattttgccaggcttccacccaaccccccctatccatattccgggagaggttcgcaatctgttggaaatttgccgcgtggagaccattttggaagtgaacaatttaaaaacgaatgaaacgacgcctatgcaacgcttatgtttccctgtttccgtgcagtcaaaaaccggcgaattgtgtgcggcattccgcgcggaccccggtcgtgatggaccttggcagagtacgatccttgggcaattgtgccgttattacacccagtggtcaggttccctggaagttacgttcatgtttgcagggagttttatggctactggtaaaatgcttattgcctatacgccaccgggggggtctgtccccgcagaccgtattactgcaatgcttgggactcacgtcatttgggattttgggcttcagtcgagcgtgacattagtagtcccatggatttcaaacacacattaccgcgcacatgctcgcgcgggctattttgattattacaccaccggtatcattaccatttggtaccagacaaattacgtagtacccatcggtgcccccaccactgcttacattgtggccctggcggcagcgcaagacaacttcactatgaaactgtgcaaagatactgaggacatcgaacaaacggccaatatccaatgatgggcggccgcaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatggctcgagcttaattaacaacaccatttgtcgagaaatcataaaaaatttatttgctttgtgagcggataacaattataatagattcaattgtgagcggataacaatttcacacagaattcattaaagaggagaaattaactatgaaacatcaccatcaccatcaccatagcagcggcctggtgccgcgcggcagccatatggctagcatgtcggactcagaagtcaatcaagaagctaagccagaggtcaagccagaagtcaagcctgagactcacatcaatttaaaggtgtccgatggatcttcagagatcttcttcaagatcaaaaagaccactcctttaagaaggctgatggaagcgttcgctaaaagacagggtaaggaaatggactccttaagattcttgtacgacggtattagaattcaagctgatcagacccctgaagatttggacatggaggataacgatattattgaggctcacagagaacagattggtggtgctgcaggtacaagtttgtacaaaaaagcaggcgagaatctttattttcagggatccggtgatcctatcgcagacatgatcgaccagactgtaaacaaccaggtgaatcgttcgcttacagcattacaagttttgcccacagcagccaatacagaggcctctagtcatcgtttaggaacgggagtcgtcccggcgttacaagccgctgagacgggtgcttctagtaatgcaagcgacaaaaatctgattgagactcgttgcgtattgaatcaccacagtactcaggaaactgccattggtaactttttcagtcgcgcaggcttagtgtccatcatcacgatgccaacgatgggcactcagaacacagacggctatgctaattgggacattgatctgatgggatacgcccagttgcgccgtaagtgtgagttgtttacatatatgcgtttcgacgcagagttcacctttgtcgtcgccaaacccaatggggagcttgttccccaattgctgcagtacatgtacgttcctccgggcgctcctaagccaacgtctcgtgattcgttcgcctggcaaactgccacaaacccgtctgtattcgtcaagatgacggacccaccggctcaggtttctgtgccattcatgtccccggcctcggcgtaccagtggttttacgatggttatcccacgtttggagaacatttacaagcgaacgatctggactacgggcagtgtccaaacaacatgatggggactttctccattcgtacagtgggaacgaaaaagtccccccatagcatcacgttacgcgtctacatgcgcatcaagcatgtccgtgcgtggattccccgtccattgcgcaaccaaccataccttttcaaaactaatccaaattataaggggaatgacattaaatgtacttcaacgtcgcgcgataagattaccaccctttgatgggcggccgccaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatggctcgagcttaattaacaacaccatttgtcgagaaatcataaaaaatttatttgctttgtgagcggataacaattataatagattcaattgtgagcggataacaatttcacacagaattcattaaagaggagaaattaactatgaaacatcaccatcaccatcaccatagcagcggcctggtgccgcgcggcagccatatggctagcatgtcggactcagaagtcaatcaagaagctaagccagaggtcaagccagaagtcaagcctgagactcacatcaatttaaaggtgtccgatggatcttcagagatcttcttcaagatcaaaaagaccactcctttaagaaggctgatggaagcgttcgctaaaagacagggtaaggaaatggactccttaagattcttgtacgacggtattagaattcaagctgatcagacccctgaagatttggacatggaggataacgatattattgaggctcacagagaacagattggtggtgctgcaggtacaagtttgtacaaaaaagcaggcgagaatctttattttcagggatcctcccctagcgccgaagcatgtggatattctgatcgcgttgcgcaattaaccatcggcaattcaacgatcaccacccaagaagcggccaatatcgtgattgcttatggggagtggcctgaatattgcccagataccgacgctaccgcagtcgataagcccacgcgtccagatgtgtcagtcaaccgtttttttaccctggacacgaagtcttgggcgaaagactcaaaagggtggtactggaagtttccagacgtactgacggaggtgggggttttcggacaaaatgctcaatttcattatctttaccgttctgggttttgcgtgcacgtccaatgtaacgcgagcaaatttcatcaaggggctctgttagtcgccgtattaccagagtacgtcttggggacaattgcgggtgggacagggaacgaaaacagtcatcccccatacgcaactacacagccaggccaggtaggcgctgttctgactcatccttatgtactggacgccggaatccccctgtcacaattgactgtatgtcctcaccagtggatcaaccttcgcacaaataactgtgcgactattatcgtgccatacatgaataccgtaccgttcgacagtgcacttaatcactgtaattttggtcttttggtcattcctgtggtcccgctggacttcaatgccggagccactagcgaaatcccgattactgtgaccattgcaccgatgtgcgcggagttcgctggcttgcgccaagccgttaagcagtgatgggcggccgccaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatggctcgagcttaattaacaacaccatttgtcgagaaatcataaaaaatttatttgctttgtgagcggataacaattataatagattcaattgtgagcggataacaatttcacacagaattcattaaagaggagaaattaactatgaaacatcaccatcaccatcaccatagcagcggcctggtgccgcgcggcagccatatggctagcatgtcggactcagaagtcaatcaagaagctaagccagaggtcaagccagaagtcaagcctgagactcacatcaatttaaaggtgtccgatggatcttcagagatcttcttcaagatcaaaaagaccactcctttaagaaggctgatggaagcgttcgctaaaagacagggtaaggaaatggactccttaagattcttgtacgacggtattagaattcaagctgatcagacccctgaagatttggacatggaggataacgatattattgaggctcacagagaacagattggtggtgctgcaggtacaagtttgtacaaaaaagcaggcgagaatctttattttcagggatccatgggctcacaagtgagtacgcagcgcagcggctcgcacgaaaactcgaactcggcgtcggaaggctccaccattaactatacgaccattaattattacaaggatgcgtatgctgcctccgccgggcgtcaagatatgagtcaggaccctaaacgtttcaccgaccccgttatggatgtgattcatgaaatggccccgccgctgaaatgatgggcggccgcactcgagcaccaccaccaccaccactgagatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctg
编码柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp0(vp4和vp2的基因序列头尾融合)的核苷酸序列(seqidno:12，969bp)
atgggctcacaagtgagtacgcagcgcagcggctcgcacgaaaactcgaactcggcgtcggaaggctccaccattaactatacgaccattaattattacaaggatgcgtatgctgcctccgccgggcgtcaagatatgagtcaggaccctaaacgtttcaccgaccccgttatggatgtgattcatgaaatggccccgccgctgaaatcccctagcgccgaagcatgtggatattctgatcgcgttgcgcaattaaccatcggcaattcaacgatcaccacccaagaagcggccaatatcgtgattgcttatggggagtggcctgaatattgcccagataccgacgctaccgcagtcgataagcccacgcgtccagatgtgtcagtcaaccgtttttttaccctggacacgaagtcttgggcgaaagactcaaaagggtggtactggaagtttccagacgtactgacggaggtgggggttttcggacaaaatgctcaatttcattatctttaccgttctgggttttgcgtgcacgtccaatgtaacgcgagcaaatttcatcaaggggctctgttagtcgccgtattaccagagtacgtcttggggacaattgcgggtgggacagggaacgaaaacagtcatcccccatacgcaactacacagccaggccaggtaggcgctgttctgactcatccttatgtactggacgccggaatccccctgtcacaattgactgtatgtcctcaccagtggatcaaccttcgcacaaataactgtgcgactattatcgtgccatacatgaataccgtaccgttcgacagtgcacttaatcactgtaattttggtcttttggtcattcctgtggtcccgctggacttcaatgccggagccactagcgaaatcccgattactgtgaccattgcaccgatgtgcgcggagttcgctggcttgcgccaagccgttaagcag
柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp0(vp4和vp2融合)的氨基酸序列(seqidno:13，323aa)
mgsqvstqrsgshensnsasegstinyttinyykdayaasagrqdmsqdpkrftdpvmdvihemapplkspsaeacgysdrvaqltignstittqeaaniviaygewpeycpdtdatavdkptrpdvsvnrfftldtkswakdskgwywkfpdvltevgvfgqnaqfhylyrsgfcvhvqcnaskfhqgallvavlpeyvlgtiaggtgnenshppyattqpgqvgavlthpyvldagiplsqltvcphqwinlrtnncatiivpymntvpfdsalnhcnfgllvipvvpldfnagatseipitvtiapmcaefaglrqavkq
引物序列：如下面的表1。
表1：引物序列
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：vp1，vp2，vp3，vp4串联可溶共表达重组载体的构建
经过大肠杆菌密码子优化的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白(vp1，vp2，vp3和vp4)基因全长由苏州金唯智生物科技有限公司合成(seqidno:5-8)。并合成上面表1中所示的引物。
分别以前面合成的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白(vp1，vp2，vp3，vp4)基因全长片段做为pcr反应的模板。所用引物序列及命名如上面的表1所示。
以柯萨奇病毒a16型-vp1f为正向引物，以柯萨奇病毒a16型-vp1r为反向引物，以vp1为pcr模板扩增获得柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp1基因；以柯萨奇病毒a16型-vp2f为正向引物，以柯萨奇病毒a16型-vp2r为反向引物，以vp2为pcr模板扩增获得柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp2基因；以柯萨奇病毒a16型-vp3f为正向引物，以柯萨奇病毒a16型-vp3r为反向引物，以vp3为pcr模板扩增获得柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp3基因；以柯萨奇病毒a16型-vp4f为正向引物，以柯萨奇病毒a16型-vp4r为反向引物，以vp4为pcr模板扩增获得柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp4基因。
上述引物的序列如上面的表1所示。其中说明的是：正向引物的5’端引入限制性内切酶bamhi位点及保护性碱基，其中bamhi位点序列为ggatcc；反向引物的5’端引入限制性内切酶noti位点，两个终止密码子及保护性碱基，其中noti位点序列为gcggccgc。酶切位点用下划线标出。
pcr反应体系以及反应条件如下面的表2。
表2：pcr反应体系和反应条件
扩增得到的dna片段，分别经bamhi/noti酶切消化后，与经过相同酶切的petsumo载体(invitrogen)连接。将连接好的质粒转化到以氯化钙法制备的dh5α感受态细胞中，等单克隆菌落清晰可见时，挑取单克隆至含有卡那霉素的lb液体培养基中，37℃230转/分钟，培养12小时过夜，提取质粒。分别得到插入柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白基因的质粒petsumo-vp1，petsumo-vp2，petsumo-vp3和petsumo-vp4。经基因测序验证无误。
以infusion-f为正向引物和infusion-r为反向引物(引物序列如上面的表1)，以上面得到的质粒petsumo-vp1作为pcr模板，用上述表2的条件扩增获得带核糖体结合位点的sumo标签的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白rbs-sumo-vp1，
以infusion-f为正向引物和infusion-r为反向引物，以上面得到的质粒petsumo-vp2作为pcr模板，用上述表2的条件扩增获得带核糖体结合位点的sumo标签的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白rbs-sumo-vp2，
以infusion-f为正向引物和infusion-r为反向引物，以上面得到的质粒petsumo-vp3作为pcr模板，用上述表2的条件扩增获得带核糖体结合位点的sumo标签的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白rbs-sumo-vp3，
以infusion-f为正向引物和infusion-r为反向引物，以上面得到的质粒petsumo-vp4作为pcr模板，用上述表2的条件扩增获得带核糖体结合位点的sumo标签的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白rbs-sumo-vp4，
用noti酶，37℃酶切pet28b载体(novagen)，纯化后，取2μl5xin-fusionhdenzymepremix(来自
用noti酶，37℃酶切pet-m-coxa16-vp3质粒，纯化后，以上述相同的in-fusion克隆技术，插入上述步骤获得的rbs-sumo-vp1片段，得到重组载体，命名为pet-d-coxa16-vp31。将连接好的质粒转化到以氯化钙法制备的dh5α感受态细胞中，等单克隆菌落清晰可见时，挑取单克隆至含有卡那霉素的lb液体培养基中，37℃230转/分钟，培养12小时过夜，提取得到pet-d-coxa16-vp31质粒。经基因测序验证无误。
用noti酶，37℃酶切pet-d-coxa16-vp31质粒，纯化后，以上述相同的in-fusion克隆技术，插入上述步骤获得的rbs-sumo-vp2片段，得到重组载体，命名为pet-t-coxa16-vp312。将连接好的质粒转化到以氯化钙法制备的dh5α感受态细胞中，等单克隆菌落清晰可见时，挑取单克隆至含有卡那霉素的lb液体培养基中，37℃230转/分钟，培养12小时过夜，提取得到pet-t-coxa16-vp312质粒。经基因测序验证无误。
用noti酶，37℃酶切pet-t-coxa16-vp312质粒，纯化后，以相同的in-fusion克隆技术，插入上述步骤获得的rbs-sumo-vp4片段，得到重组载体，命名为pet-q-coxa16-vp3124。将连接好的质粒转化到以氯化钙法制备的dh5α感受态细胞中，等单克隆菌落清晰可见时，挑取单克隆至含有卡那霉素的lb液体培养基中，37℃230转/分钟，培养12小时过夜，提取得到pet-q-coxa16-vp3124质粒。其中插入的全部核酸序列(核酸构建体)如seqidno:11所示。经基因测序验证无误。
实施例2：柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白(vp1，vp2，vp3，vp4)的串联共表达
将实施例1中制得的pet-q-coxa16-vp3124质粒转化到40μl以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌bl21(de3)，涂布于卡那霉素抗性的固体lb培养基，37℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含4ml卡那霉素抗性的液体lb培养基的试管，37℃230转/分振荡培养12小时，从中取1ml菌液于-80℃冻干保存。
从-80℃中取出带有重组质粒pet-q-coxa16-vp3124的大肠杆菌菌种，接入卡那霉素抗性的50mllb液体培养基，230rpm，37℃，培养约12小时后，转接入1llb液体培养基中，37℃大量表达，等od600值达到0.6后，加入0.1mm的iptg，诱导蛋白表达，20℃过夜。
校正发酵罐(上海保兴生物公司50升发酵罐)ph电极，配制30升培养基装入发酵罐，121℃灭菌30分钟，校正溶氧电极，以灭菌后未通气前为零点，以发酵时通气后未接种前初始搅拌速度100rpm时为100％。
第二天将10瓶种子液5升接入发酵罐中，温度30℃，ph值7.0，手动调节搅拌速度及通气量，维持溶氧在40％以上。
流加补料，将50％葡萄糖和30％酪蛋白水解物按溶质质量比2：1的比例混合。
流加速度如下：
100％速度为25ml/min
第一小时：5％速度；
第二小时：10％速度；
第三小时：20％速度；
第四小时：40％速度；
第五小时以后60％速度。
培养至菌浓度达到od600大约10左右时将培养温度降至25℃加入4giptg诱导培养12小时。终浓度大约为50左右(od600)下罐，离心收集菌体大约200g。
lb培养基配方为(1升)：蛋白胨10g,酵母粉5g,nacl10g。
实施例3：带sumo标签的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白(vp1，vp2，vp3，vp4)的亲和色谱纯化制备
将实施例2制得的菌体，按照1g菌体对应10ml裂解液(20mmtris缓冲液ph7.2，300mmnacl)的比例重悬菌体，采用均质机以700bar压力破碎菌体4次。ja-14转头13500rpm(28000g)，离心40min，留取上清，通过15％sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，此时上清中带sumo标签的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白(sumo-vp1，sumo-vp2，sumo-vp3，sumo-vp4)的纯度约为10％。
上清用0.45μm孔径滤膜过滤后，用hisbeads(gehealthcarelifesciences)装填的xk26/60柱子(gehealthcarelifesciences)做色谱纯化。
仪器系统：gehealthcare原amershanpharmacia公司生产的akta纯化制备型液相色谱系统。
层析介质：nisepharose。
柱体积：40ml。
缓冲液：20mm磷酸缓冲液ph8.0，0.2mnacl；
洗脱液：20mm磷酸缓冲液ph8.0，0.2mnacl+300mm咪唑。
流速：5ml/min。
检测器波长：280nm。
样品为5l经过0.45μm孔径滤膜过滤后的经匀浆机破碎后的大肠杆菌菌体上清。
洗脱程序为：穿透后，缓冲液洗脱杂蛋白，洗脱液洗脱带sumo标签的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白(sumo-vp1，sumo-vp2，sumo-vp3，sumo-vp4)产物，共获得带sumo标签的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白(sumo-vp1，sumo-vp2，sumo-vp3，sumo-vp4)样品1600ml。
取经本实施例方法纯化的样品20μl，加入5×loadingbuffer5μl混匀，于80℃水浴10min后分别取10μl和5μl于10％sds-聚丙烯酰胺凝胶中以240v电压电泳40min。随后以考马斯亮兰染色显示电泳条带，电泳结果见图1。
由电泳结果可知，目的蛋白浓度约为2mg/ml，sds-page考染纯度约为70％。
另外，考虑到4种蛋白的分子量比较接近(vp1，vp2和vp3)或相差在大约4倍的情况(vp4)。电泳考染蛋白条带的强弱可以基本确定蛋白的表达量高低，因此，图1的电泳结果也说明了4种蛋白的表达量能够保持在基本相同的水平，没有一个或几个蛋白的表达远远高于或低于其他蛋白的表达。
实施例4：去除sumo标签的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白(vp1，vp2，vp3，vp4)的亲和色谱精纯化
收集实施例3获得的带sumo标签的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白(sumo-vp1，sumo-vp2，sumo-vp3，sumo-vp4)样品在4℃酶切12小时获得的样品约为1600ml，对ph8.0，0.2mnacl缓冲液透析12小时后，添加咪唑至终浓度80mm，然后进行下一步的亲和色谱精纯化。
仪器系统：gehealthcare原amershanpharmacia公司生产的akta纯化制备型液相色谱系统。
层析介质：nisepharose。
柱体积：40ml。
缓冲液：20mm磷酸缓冲液ph8.0，0.2mnacl+80mm咪唑；
洗脱液：20mm磷酸缓冲液ph8.0，0.2mnacl+500mm咪唑。
流速：5ml/min。
检测器波长：280nm。
洗脱程序为：样品上柱后，收集穿透液，共获得柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白(vp1，vp2，vp3，vp4)纯化样品约1800ml。
取经本实施例方法纯化的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白(vp1，vp2，vp3，vp4)样品20μl，加入5×loadingbuffer5μl混匀，于80℃水浴10min后分别取8μl于10％sds-聚丙烯酰胺凝胶中以240v电压电泳40min。随后以考马斯亮兰染色显示电泳条带，电泳结果见图2。
由电泳结果可知，目的蛋白浓度约为1.5mg/ml，sds-page考染纯度大于80％(vp4蛋白分子量较低，在胶上溶剂前沿的位置)。
实施例5：去除sumo标签的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白(vp1，vp2，vp3，vp4)的疏水色谱精纯化
收集实施例4获得的切除sumo标签的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白(vp1，vp2，vp3，vp4)样品，添加高浓度nacl溶液，至nacl终浓度达1m，进行下一步的疏水色谱精纯化。
仪器系统：gehealthcare原amershanpharmacia公司生产的akta纯化制备型液相色谱系统。
层析介质：butylsepharose。
柱体积：40ml。
缓冲液：20mm磷酸缓冲液ph8.0，1mnacl；
洗脱液：20mm磷酸缓冲液ph8.0，0.1mnacl。
流速：5ml/min。
检测器波长：280nm。
洗脱程序为：样品上柱后，收集穿透液，共获得柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白(vp1，vp2，vp3，vp4)纯化样品约1800ml。
取经本实施例方法纯化的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白(vp1，vp2，vp3，vp4)样品20μl，加入5×loadingbuffer5μl混匀，于80℃水浴10min后取2μl于10％sds-聚丙烯酰胺凝胶中以240v电压电泳40min。随后以考马斯亮兰染色显示电泳条带，电泳结果见图3。
由电泳结果可知，目的蛋白浓度约为1.5mg/ml，sds-page考染纯度约为90％(vp4蛋白分子量较低，在胶上没有显示)。
实施例6：柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白病毒样颗粒的形态学检测
1.柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白病毒样颗粒透射电镜观察
将实施例5所得样品在20mm磷酸缓冲液ph8.0，0.5mnacl中透析12个小时。之后取样做电镜观察。仪器为fei透射电镜，放大倍数为42,000倍。柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白病毒样颗粒用快速冷冻技术固定于喷炭的铜网上进行观察。结果如图4所示。
由图4可见，所得的样品在电镜下观察其半径约为16nm左右的病毒样颗粒，大小均匀，呈现为空心形态。和天然柯萨奇病毒a16型构象(其半径约为16nm)十分接近(参考文献plevka,p.,perera,r.,cardosa,j.,kuhn,r.j.,rossmann,m.g.(2012)crystalstructureofhumanenterovirus71.science336:1274)。
2.柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白病毒样颗粒动态光散射观察
仪器为美国proteinsolutions公司生产的dynaproms/x型动态光散射仪(含温度控制器)，使用算法为regulation算法。样品为实施例5所得样品。样品经0.22μm滤膜过滤后进行测量。测量结果见图5。结果显示柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白病毒样颗粒的水化分子动力学半径为16nm，该结果进一步证实了本发明人获得的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白绝大部分(接近于100％)是以病毒样颗粒的形式存在，而且其病毒样颗粒半径和真实病毒的颗粒半径一致。
另一方面，组装成病毒样颗粒的有效性证明了本发明中4种蛋白分子(vp1-vp4)的表达数相同或相近。
实施例7：柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白病毒样颗粒疫苗免疫动物的免疫保护性评价
小鼠：普通级，雌性，6～8周龄，4只。实施例6中透析获得的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白病毒样颗粒与等量福氏完全佐剂混合初免，与等量福氏不完全佐剂混合进行加强免疫，免疫方式为肌肉注射，初次免疫剂量为100μg/只，此后分别于4，10周各加强一次，加强免疫剂量为50μg/只。自免疫后，每周抽取外周静脉血，分离血清，保存待检。测量结果见图6。
图6的结果表明：在初免6个星期后，总抗滴度即有明显上升，在经过加强免疫后，第十周抗体的滴度即能达到106的高水平。
对比例1：串联共表达两个柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白
检验pet-d-coxa16-vp31质粒的蛋白表达情况。
本发明人将实施例1中制得的pet-d-coxa16-vp31质粒转化到40μl以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌bl21(de3)，涂布于卡那霉素抗性的固体lb培养基，37℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含4ml卡那霉素抗性的液体lb培养基的试管，37℃230转/分振荡培养12小时，从中取1ml菌液于-80℃冻干保存。
从-80℃中取出带有重组质粒pet-d-coxa16-vp31的大肠杆菌菌种，接入卡那霉素抗性的50mllb液体培养基，230rpm，37℃，培养约12小时后，转接入1llb液体培养基中，37℃大量表达，等od600值达到0.6后，加入0.1mm的iptg，诱导蛋白表达，20℃过夜。
如图7所示，由于在sds-page胶上没有看见明显的目的带，本发明人构建的pet-d-coxa16-vp31质粒在上述条件下不能有效地表达带sumo标签的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp1和vp3。
结果表明，柯萨奇病毒a16型的vp1和vp3在没有vp2和vp4蛋白帮助下不能够高效甚至有效表达。
对比例2：串联共表达三个柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白
构建并检验pet-t-coxa16-vp310的质粒的蛋白表达情况。其中，本发明人把vp4和vp2的基因序列头尾融合在一起做成vp0的基因序列。该基因全长由苏州金唯智生物科技有限公司合成(seqidno:12)，其编码的氨基酸序列如seqidno:13所示。
以柯萨奇病毒a16型-vp4f为正向引物，以柯萨奇病毒a16型-vp2r为反向引物(引物序列如前面的表1所示)，以vp0为pcr模板扩增获得柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp0基因。pcr反应体系以及反应条件如前面的表2所示。
扩增得到的dna片段，分别经bamhi/noti酶切消化后，与经过相同酶切的petsumo载体(invitrogen)连接。将连接好的质粒转化到以氯化钙法制备的dh5α感受态细胞中，等单克隆菌落清晰可见时，挑取单克隆至含有卡那霉素的lb液体培养基中，37℃230转/分钟，培养12小时过夜，提取质粒。分别得到插入柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白基因的质粒petsumo-vp0。经基因测序验证无误。
以infusion-f(seqidno:22)为正向引物和infusion-r(seqidno:23)为反向引物，以上面得到的质粒petsumo-vp0作为pcr模板，用上述表2的条件扩增获得带核糖体结合位点的sumo标签的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白rbs-sumo-vp0。
用noti酶，37℃酶切实施例1获得的pet-d-coxa16-vp31质粒，纯化后，以上述相同的in-fusion克隆技术，插入上述步骤获得的rbs-sumo-vp0片段，得到重组载体，命名为pet-t-coxa16-vp310。将连接好的质粒转化到以氯化钙法制备的dh5α感受态细胞中，等单克隆菌落清晰可见时，挑取单克隆至含有卡那霉素的lb液体培养基中，37℃230转/分钟，培养12小时过夜，提取得到pet-t-coxa16-vp310质粒。经基因测序验证无误。
质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)后，用iptg诱导，检测目的蛋白的生成。这个实验想验证在相同条件下，串联加入vp0的基因，是否有助于柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp1和vp3的蛋白表达。
结果如图7所示，本发明人构建的pet-t-coxa16-vp310质粒在上述条件下只能表达带sumo标签的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp0，而不能表达带sumo标签的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp1和vp3。
结果表明，将柯萨奇病毒a16型的两个衣壳蛋白融合后再与另外两个衣壳蛋白以三个衣壳蛋白的形式串联共表达是不可行的。
对比例3：不同组合串联共表达柯萨奇病毒a16型四个衣壳蛋白
本发明人构建了pet-q-coxa16-vp1324，pet-q-coxa16-vp1342两个不同顺序组合的质粒(构建方法参考实施例1)，并转化到大肠杆菌bl21(de3)后，用iptg诱导，检测目的蛋白的生成。并以pet-q-coxa16-vp3124这个组合作为对照。
结果如图8所示，pet-q-coxa16-vp1324，pet-q-coxa16-vp1342两个质粒都有效表达了带sumo标签的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp1，vp2，vp3和vp4，但是这些蛋白的可溶性比较差(相对于pet-q-coxa16-vp3124，特别是分子量最低的带sumo标签的vp4可溶性差)。相比之下，pet-q-coxa16-vp3124这个质粒高效，可溶表达带sumo标签的柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp1，vp2，vp3和vp4。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
sequencelisting
<110>斯澳生物科技（苏州）有限公司
<120>用于制备柯萨奇病毒a16型病毒样颗粒的核酸构建体和方法
<130>idc170017
<160>23
<170>patentinversion3.2
<210>1
<211>297
<212>prt
<213>coxsackievirusa
<400>1
glyaspproilealaaspmetileaspglnthrvalasnasnglnval
151015
asnargserleuthralaleuglnvalleuprothralaalaasnthr
202530
glualaserserhisargleuglythrglyvalvalproalaleugln
354045
alaalagluthrglyalaserserasnalaserasplysasnleuile
505560
gluthrargcysvalleuasnhishisserthrglngluthralaile
65707580
glyasnphepheserargalaglyleuvalserileilethrmetpro
859095
thrmetglythrglnasnthraspglytyralaasntrpaspileasp
100105110
leumetglytyralaglnleuargarglyscysgluleuphethrtyr
115120125
metargpheaspalagluphethrphevalvalalalysproasngly
130135140
gluleuvalproglnleuleuglntyrmettyrvalproproglyala
145150155160
prolysprothrserargaspserphealatrpglnthralathrasn
165170175
proservalphevallysmetthraspproproalaglnvalserval
180185190
prophemetserproalaseralatyrglntrpphetyraspglytyr
195200205
prothrpheglygluhisleuglnalaasnaspleuasptyrglygln
210215220
cysproasnasnmetmetglythrpheserileargthrvalglythr
225230235240
lyslysserprohisserilethrleuargvaltyrmetargilelys
245250255
hisvalargalatrpileproargproleuargasnglnprotyrleu
260265270
phelysthrasnproasntyrlysglyasnaspilelyscysthrser
275280285
thrserargasplysilethrthrleu
290295
<210>2
<211>254
<212>prt
<213>coxsackievirusa
<400>2
serproseralaglualacysglytyrseraspargvalalaglnleu
151015
thrileglyasnserthrilethrthrglnglualaalaasnileval
202530
ilealatyrglyglutrpproglutyrcysproaspthraspalathr
354045
alavalasplysprothrargproaspvalservalasnargphephe
505560
thrleuaspthrlyssertrpalalysaspserlysglytrptyrtrp
65707580
lyspheproaspvalleuthrgluvalglyvalpheglyglnasnala
859095
glnphehistyrleutyrargserglyphecysvalhisvalglncys
100105110
asnalaserlysphehisglnglyalaleuleuvalalavalleupro
115120125
glutyrvalleuglythrilealaglyglythrglyasngluasnser
130135140
hisproprotyralathrthrglnproglyglnvalglyalavalleu
145150155160
thrhisprotyrvalleuaspalaglyileproleuserglnleuthr
165170175
valcysprohisglntrpileasnleuargthrasnasncysalathr
180185190
ileilevalprotyrmetasnthrvalpropheaspseralaleuasn
195200205
hiscysasnpheglyleuleuvalileprovalvalproleuaspphe
210215220
asnalaglyalathrsergluileproilethrvalthrilealapro
225230235240
metcysalagluphealaglyleuargglnalavallysgln
245250
<210>3
<211>242
<212>prt
<213>coxsackievirusa
<400>3
glyileprothrgluleulysproglythrasnglnpheleuthrthr
151015
aspaspglyvalseralaproileleuproglyphehisprothrpro
202530
proilehisileproglygluvalargasnleuleugluilecysarg
354045
valgluthrileleugluvalasnasnleulysthrasngluthrthr
505560
prometglnargleucyspheprovalservalglnserlysthrgly
65707580
gluleucysalaalapheargalaaspproglyargaspglyprotrp
859095
glnserthrileleuglyglnleucysargtyrtyrthrglntrpser
100105110
glyserleugluvalthrphemetphealaglyserphemetalathr
115120125
glylysmetleuilealatyrthrproproglyglyservalproala
130135140
aspargilethralametleuglythrhisvaliletrpaspphegly
145150155160
leuglnserservalthrleuvalvalprotrpileserasnthrhis
165170175
tyrargalahisalaargalaglytyrpheasptyrtyrthrthrgly
180185190
ileilethriletrptyrglnthrasntyrvalvalproileglyala
195200205
prothrthralatyrilevalalaleualaalaalaglnaspasnphe
210215220
thrmetlysleucyslysaspthrgluaspilegluglnthralaasn
225230235240
ilegln
<210>4
<211>69
<212>prt
<213>coxsackievirusa
<400>4
metglyserglnvalserthrglnargserglyserhisgluasnser
151015
asnseralasergluglyserthrileasntyrthrthrileasntyr
202530
tyrlysaspalatyralaalaseralaglyargglnaspmetsergln
354045
aspprolysargphethraspprovalmetaspvalilehisglumet
505560
alaproproleulys
65
<210>5
<211>891
<212>dna
<213>coxsackievirusa
<400>5
ggtgatcctatcgcagacatgatcgaccagactgtaaacaaccaggtgaatcgttcgctt60
acagcattacaagttttgcccacagcagccaatacagaggcctctagtcatcgtttagga120
acgggagtcgtcccggcgttacaagccgctgagacgggtgcttctagtaatgcaagcgac180
aaaaatctgattgagactcgttgcgtattgaatcaccacagtactcaggaaactgccatt240
ggtaactttttcagtcgcgcaggcttagtgtccatcatcacgatgccaacgatgggcact300
cagaacacagacggctatgctaattgggacattgatctgatgggatacgcccagttgcgc360
cgtaagtgtgagttgtttacatatatgcgtttcgacgcagagttcacctttgtcgtcgcc420
aaacccaatggggagcttgttccccaattgctgcagtacatgtacgttcctccgggcgct480
cctaagccaacgtctcgtgattcgttcgcctggcaaactgccacaaacccgtctgtattc540
gtcaagatgacggacccaccggctcaggtttctgtgccattcatgtccccggcctcggcg600
taccagtggttttacgatggttatcccacgtttggagaacatttacaagcgaacgatctg660
gactacgggcagtgtccaaacaacatgatggggactttctccattcgtacagtgggaacg720
aaaaagtccccccatagcatcacgttacgcgtctacatgcgcatcaagcatgtccgtgcg780
tggattccccgtccattgcgcaaccaaccataccttttcaaaactaatccaaattataag840
gggaatgacattaaatgtacttcaacgtcgcgcgataagattaccaccctt891
<210>6
<211>762
<212>dna
<213>coxsackievirusa
<400>6
tcccctagcgccgaagcatgtggatattctgatcgcgttgcgcaattaaccatcggcaat60
tcaacgatcaccacccaagaagcggccaatatcgtgattgcttatggggagtggcctgaa120
tattgcccagataccgacgctaccgcagtcgataagcccacgcgtccagatgtgtcagtc180
aaccgtttttttaccctggacacgaagtcttgggcgaaagactcaaaagggtggtactgg240
aagtttccagacgtactgacggaggtgggggttttcggacaaaatgctcaatttcattat300
ctttaccgttctgggttttgcgtgcacgtccaatgtaacgcgagcaaatttcatcaaggg360
gctctgttagtcgccgtattaccagagtacgtcttggggacaattgcgggtgggacaggg420
aacgaaaacagtcatcccccatacgcaactacacagccaggccaggtaggcgctgttctg480
actcatccttatgtactggacgccggaatccccctgtcacaattgactgtatgtcctcac540
cagtggatcaaccttcgcacaaataactgtgcgactattatcgtgccatacatgaatacc600
gtaccgttcgacagtgcacttaatcactgtaattttggtcttttggtcattcctgtggtc660
ccgctggacttcaatgccggagccactagcgaaatcccgattactgtgaccattgcaccg720
atgtgcgcggagttcgctggcttgcgccaagccgttaagcag762
<210>7
<211>726
<212>dna
<213>coxsackievirusa
<400>7
gggattccaactgagcttaaacctggcactaaccaatttttgacaacagatgatggcgtc60
tctgcaccgattttgccaggcttccacccaaccccccctatccatattccgggagaggtt120
cgcaatctgttggaaatttgccgcgtggagaccattttggaagtgaacaatttaaaaacg180
aatgaaacgacgcctatgcaacgcttatgtttccctgtttccgtgcagtcaaaaaccggc240
gaattgtgtgcggcattccgcgcggaccccggtcgtgatggaccttggcagagtacgatc300
cttgggcaattgtgccgttattacacccagtggtcaggttccctggaagttacgttcatg360
tttgcagggagttttatggctactggtaaaatgcttattgcctatacgccaccggggggg420
tctgtccccgcagaccgtattactgcaatgcttgggactcacgtcatttgggattttggg480
cttcagtcgagcgtgacattagtagtcccatggatttcaaacacacattaccgcgcacat540
gctcgcgcgggctattttgattattacaccaccggtatcattaccatttggtaccagaca600
aattacgtagtacccatcggtgcccccaccactgcttacattgtggccctggcggcagcg660
caagacaacttcactatgaaactgtgcaaagatactgaggacatcgaacaaacggccaat720
atccaa726
<210>8
<211>207
<212>dna
<213>coxsackievirusa
<400>8
atgggctcacaagtgagtacgcagcgcagcggctcgcacgaaaactcgaactcggcgtcg60
gaaggctccaccattaactatacgaccattaattattacaaggatgcgtatgctgcctcc120
gccgggcgtcaagatatgagtcaggaccctaaacgtttcaccgaccccgttatggatgtg180
attcatgaaatggccccgccgctgaaa207
<210>9
<211>99
<212>prt
<213>artificial
<220>
<223>sumo氨基酸序列
<400>9
metseraspsergluvalasnglnglualalysprogluvallyspro
151015
gluvallysprogluthrhisileasnleulysvalseraspglyser
202530
sergluilephephelysilelyslysthrthrproleuargargleu
354045
metglualaphealalysargglnglylysglumetaspserleuarg
505560
pheleutyraspglyileargileglnalaaspglnthrprogluasp
65707580
leuaspmetgluaspasnaspileileglualahisarggluglnile
859095
glyglyala
<210>10
<211>297
<212>dna
<213>artificial
<220>
<223>sumo核苷酸序列
<400>10
atgtcggactcagaagtcaatcaagaagctaagccagaggtcaagccagaagtcaagcct60
gagactcacatcaatttaaaggtgtccgatggatcttcagagatcttcttcaagatcaaa120
aagaccactcctttaagaaggctgatggaagcgttcgctaaaagacagggtaaggaaatg180
gactccttaagattcttgtacgacggtattagaattcaagctgatcagacccctgaagat240
ttggacatggaggataacgatattattgaggctcacagagaacagattggtggtgct297
<210>11
<211>5156
<212>dna
<213>artificial
<220>
<223>pet-q-coxa16-vp3124质粒中的核酸构建体的核酸序列
<400>11
caattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatggctcgag60
cttaattaacaacaccatttgtcgagaaatcataaaaaatttatttgctttgtgagcgga120
taacaattataatagattcaattgtgagcggataacaatttcacacagaattcattaaag180
aggagaaattaactatgaaacatcaccatcaccatcaccatagcagcggcctggtgccgc240
gcggcagccatatggctagcatgtcggactcagaagtcaatcaagaagctaagccagagg300
tcaagccagaagtcaagcctgagactcacatcaatttaaaggtgtccgatggatcttcag360
agatcttcttcaagatcaaaaagaccactcctttaagaaggctgatggaagcgttcgcta420
aaagacagggtaaggaaatggactccttaagattcttgtacgacggtattagaattcaag480
ctgatcagacccctgaagatttggacatggaggataacgatattattgaggctcacagag540
aacagattggtggtgctgcaggtacaagtttgtacaaaaaagcaggcgagaatctttatt600
ttcagggatccgggattccaactgagcttaaacctggcactaaccaatttttgacaacag660
atgatggcgtctctgcaccgattttgccaggcttccacccaaccccccctatccatattc720
cgggagaggttcgcaatctgttggaaatttgccgcgtggagaccattttggaagtgaaca780
atttaaaaacgaatgaaacgacgcctatgcaacgcttatgtttccctgtttccgtgcagt840
caaaaaccggcgaattgtgtgcggcattccgcgcggaccccggtcgtgatggaccttggc900
agagtacgatccttgggcaattgtgccgttattacacccagtggtcaggttccctggaag960
ttacgttcatgtttgcagggagttttatggctactggtaaaatgcttattgcctatacgc1020
caccgggggggtctgtccccgcagaccgtattactgcaatgcttgggactcacgtcattt1080
gggattttgggcttcagtcgagcgtgacattagtagtcccatggatttcaaacacacatt1140
accgcgcacatgctcgcgcgggctattttgattattacaccaccggtatcattaccattt1200
ggtaccagacaaattacgtagtacccatcggtgcccccaccactgcttacattgtggccc1260
tggcggcagcgcaagacaacttcactatgaaactgtgcaaagatactgaggacatcgaac1320
aaacggccaatatccaatgatgggcggccgcaattcccctctagaaataattttgtttaa1380
ctttaagaaggagatataccatggctcgagcttaattaacaacaccatttgtcgagaaat1440
cataaaaaatttatttgctttgtgagcggataacaattataatagattcaattgtgagcg1500
gataacaatttcacacagaattcattaaagaggagaaattaactatgaaacatcaccatc1560
accatcaccatagcagcggcctggtgccgcgcggcagccatatggctagcatgtcggact1620
cagaagtcaatcaagaagctaagccagaggtcaagccagaagtcaagcctgagactcaca1680
tcaatttaaaggtgtccgatggatcttcagagatcttcttcaagatcaaaaagaccactc1740
ctttaagaaggctgatggaagcgttcgctaaaagacagggtaaggaaatggactccttaa1800
gattcttgtacgacggtattagaattcaagctgatcagacccctgaagatttggacatgg1860
aggataacgatattattgaggctcacagagaacagattggtggtgctgcaggtacaagtt1920
tgtacaaaaaagcaggcgagaatctttattttcagggatccggtgatcctatcgcagaca1980
tgatcgaccagactgtaaacaaccaggtgaatcgttcgcttacagcattacaagttttgc2040
ccacagcagccaatacagaggcctctagtcatcgtttaggaacgggagtcgtcccggcgt2100
tacaagccgctgagacgggtgcttctagtaatgcaagcgacaaaaatctgattgagactc2160
gttgcgtattgaatcaccacagtactcaggaaactgccattggtaactttttcagtcgcg2220
caggcttagtgtccatcatcacgatgccaacgatgggcactcagaacacagacggctatg2280
ctaattgggacattgatctgatgggatacgcccagttgcgccgtaagtgtgagttgttta2340
catatatgcgtttcgacgcagagttcacctttgtcgtcgccaaacccaatggggagcttg2400
ttccccaattgctgcagtacatgtacgttcctccgggcgctcctaagccaacgtctcgtg2460
attcgttcgcctggcaaactgccacaaacccgtctgtattcgtcaagatgacggacccac2520
cggctcaggtttctgtgccattcatgtccccggcctcggcgtaccagtggttttacgatg2580
gttatcccacgtttggagaacatttacaagcgaacgatctggactacgggcagtgtccaa2640
acaacatgatggggactttctccattcgtacagtgggaacgaaaaagtccccccatagca2700
tcacgttacgcgtctacatgcgcatcaagcatgtccgtgcgtggattccccgtccattgc2760
gcaaccaaccataccttttcaaaactaatccaaattataaggggaatgacattaaatgta2820
cttcaacgtcgcgcgataagattaccaccctttgatgggcggccgccaattcccctctag2880
aaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatggctcgagcttaattaacaaca2940
ccatttgtcgagaaatcataaaaaatttatttgctttgtgagcggataacaattataata3000
gattcaattgtgagcggataacaatttcacacagaattcattaaagaggagaaattaact3060
atgaaacatcaccatcaccatcaccatagcagcggcctggtgccgcgcggcagccatatg3120
gctagcatgtcggactcagaagtcaatcaagaagctaagccagaggtcaagccagaagtc3180
aagcctgagactcacatcaatttaaaggtgtccgatggatcttcagagatcttcttcaag3240
atcaaaaagaccactcctttaagaaggctgatggaagcgttcgctaaaagacagggtaag3300
gaaatggactccttaagattcttgtacgacggtattagaattcaagctgatcagacccct3360
gaagatttggacatggaggataacgatattattgaggctcacagagaacagattggtggt3420
gctgcaggtacaagtttgtacaaaaaagcaggcgagaatctttattttcagggatcctcc3480
cctagcgccgaagcatgtggatattctgatcgcgttgcgcaattaaccatcggcaattca3540
acgatcaccacccaagaagcggccaatatcgtgattgcttatggggagtggcctgaatat3600
tgcccagataccgacgctaccgcagtcgataagcccacgcgtccagatgtgtcagtcaac3660
cgtttttttaccctggacacgaagtcttgggcgaaagactcaaaagggtggtactggaag3720
tttccagacgtactgacggaggtgggggttttcggacaaaatgctcaatttcattatctt3780
taccgttctgggttttgcgtgcacgtccaatgtaacgcgagcaaatttcatcaaggggct3840
ctgttagtcgccgtattaccagagtacgtcttggggacaattgcgggtgggacagggaac3900
gaaaacagtcatcccccatacgcaactacacagccaggccaggtaggcgctgttctgact3960
catccttatgtactggacgccggaatccccctgtcacaattgactgtatgtcctcaccag4020
tggatcaaccttcgcacaaataactgtgcgactattatcgtgccatacatgaataccgta4080
ccgttcgacagtgcacttaatcactgtaattttggtcttttggtcattcctgtggtcccg4140
ctggacttcaatgccggagccactagcgaaatcccgattactgtgaccattgcaccgatg4200
tgcgcggagttcgctggcttgcgccaagccgttaagcagtgatgggcggccgccaattcc4260
cctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatggctcgagcttaatt4320
aacaacaccatttgtcgagaaatcataaaaaatttatttgctttgtgagcggataacaat4380
tataatagattcaattgtgagcggataacaatttcacacagaattcattaaagaggagaa4440
attaactatgaaacatcaccatcaccatcaccatagcagcggcctggtgccgcgcggcag4500
ccatatggctagcatgtcggactcagaagtcaatcaagaagctaagccagaggtcaagcc4560
agaagtcaagcctgagactcacatcaatttaaaggtgtccgatggatcttcagagatctt4620
cttcaagatcaaaaagaccactcctttaagaaggctgatggaagcgttcgctaaaagaca4680
gggtaaggaaatggactccttaagattcttgtacgacggtattagaattcaagctgatca4740
gacccctgaagatttggacatggaggataacgatattattgaggctcacagagaacagat4800
tggtggtgctgcaggtacaagtttgtacaaaaaagcaggcgagaatctttattttcaggg4860
atccatgggctcacaagtgagtacgcagcgcagcggctcgcacgaaaactcgaactcggc4920
gtcggaaggctccaccattaactatacgaccattaattattacaaggatgcgtatgctgc4980
ctccgccgggcgtcaagatatgagtcaggaccctaaacgtttcaccgaccccgttatgga5040
tgtgattcatgaaatggccccgccgctgaaatgatgggcggccgcactcgagcaccacca5100
ccaccaccactgagatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctg5156
<210>12
<211>969
<212>dna
<213>artificial
<220>
<223>编码柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp0的核苷酸序列
<400>12
atgggctcacaagtgagtacgcagcgcagcggctcgcacgaaaactcgaactcggcgtcg60
gaaggctccaccattaactatacgaccattaattattacaaggatgcgtatgctgcctcc120
gccgggcgtcaagatatgagtcaggaccctaaacgtttcaccgaccccgttatggatgtg180
attcatgaaatggccccgccgctgaaatcccctagcgccgaagcatgtggatattctgat240
cgcgttgcgcaattaaccatcggcaattcaacgatcaccacccaagaagcggccaatatc300
gtgattgcttatggggagtggcctgaatattgcccagataccgacgctaccgcagtcgat360
aagcccacgcgtccagatgtgtcagtcaaccgtttttttaccctggacacgaagtcttgg420
gcgaaagactcaaaagggtggtactggaagtttccagacgtactgacggaggtgggggtt480
ttcggacaaaatgctcaatttcattatctttaccgttctgggttttgcgtgcacgtccaa540
tgtaacgcgagcaaatttcatcaaggggctctgttagtcgccgtattaccagagtacgtc600
ttggggacaattgcgggtgggacagggaacgaaaacagtcatcccccatacgcaactaca660
cagccaggccaggtaggcgctgttctgactcatccttatgtactggacgccggaatcccc720
ctgtcacaattgactgtatgtcctcaccagtggatcaaccttcgcacaaataactgtgcg780
actattatcgtgccatacatgaataccgtaccgttcgacagtgcacttaatcactgtaat840
tttggtcttttggtcattcctgtggtcccgctggacttcaatgccggagccactagcgaa900
atcccgattactgtgaccattgcaccgatgtgcgcggagttcgctggcttgcgccaagcc960
gttaagcag969
<210>13
<211>323
<212>prt
<213>artificial
<220>
<223>柯萨奇病毒a16型衣壳蛋白vp0的氨基酸序列
<400>13
metglyserglnvalserthrglnargserglyserhisgluasnser
151015
asnseralasergluglyserthrileasntyrthrthrileasntyr
202530
tyrlysaspalatyralaalaseralaglyargglnaspmetsergln
354045
aspprolysargphethraspprovalmetaspvalilehisglumet
505560
alaproproleulysserproseralaglualacysglytyrserasp
65707580
argvalalaglnleuthrileglyasnserthrilethrthrglnglu
859095
alaalaasnilevalilealatyrglyglutrpproglutyrcyspro
100105110
aspthraspalathralavalasplysprothrargproaspvalser
115120125
valasnargphephethrleuaspthrlyssertrpalalysaspser
130135140
lysglytrptyrtrplyspheproaspvalleuthrgluvalglyval
145150155160
pheglyglnasnalaglnphehistyrleutyrargserglyphecys
165170175
valhisvalglncysasnalaserlysphehisglnglyalaleuleu
180185190
valalavalleuproglutyrvalleuglythrilealaglyglythr
195200205
glyasngluasnserhisproprotyralathrthrglnproglygln
210215220
valglyalavalleuthrhisprotyrvalleuaspalaglyilepro
225230235240
leuserglnleuthrvalcysprohisglntrpileasnleuargthr
245250255
asnasncysalathrileilevalprotyrmetasnthrvalprophe
260265270
aspseralaleuasnhiscysasnpheglyleuleuvalileproval
275280285
valproleuasppheasnalaglyalathrsergluileproilethr
290295300
valthrilealaprometcysalagluphealaglyleuargglnala
305310315320
vallysgln
<210>14
<211>34
<212>dna
<213>artificial
<220>
<223>引物vp1f
<400>14
gcagttggatccggtgatcctatcgcagacatga34
<210>15
<211>42
<212>dna
<213>artificial
<220>
<223>引物vp1r
<400>15
gattcatgcggccgcttatcaaagggtggtaatcttatcgcg42
<210>16
<211>34
<212>dna
<213>artificial
<220>
<223>引物vp2f
<400>16
ggtgttggatcctcccctagcgccgaagcatgtg34
<210>17
<211>43
<212>dna
<213>artificial
<220>
<223>引物vp2r
<400>17
gattcatgcggccgcttatcactgcttaacggcttggcgcaag43
<210>18
<211>34
<212>dna
<213>artificial
<220>
<223>引物vp3f
<400>18
gcagttggatccgggattccaactgagcttaaac34
<210>19
<211>44
<212>dna
<213>artificial
<220>
<223>引物vp3r
<400>19
gattcatgcggccgcttatcattggatattggccgtttgttcga44
<210>20
<211>34
<212>dna
<213>artificial
<220>
<223>引物vp4f
<400>20
gcagttggatccatgggctcacaagtgagtacgc34
<210>21
<211>38
<212>dna
<213>artificial
<220>
<223>引物vp4r
<400>21
gattcatgcggccgcttatcatttcagcggcggggcca38
<210>22
<211>19
<212>dna
<213>artificial
<220>
<223>infusion-f
<400>22
caattcccctctagaaata19
<210>23
<211>19
<212>dna
<213>artificial
<220>
<223>infusion-r
<400>23
cagccaactcagcttcctt19