一种光透明化生物组织的包埋剂、包埋方法及应用与流程

本发明属于生物成像领域，更具体地，涉及一种光透明化生物组织的包埋剂、包埋方法及应用。

背景技术：

研究脑神经的网络结构对于治疗人类的精神疾病和研究人类的认知及情感等具有重大意义，获取全脑范围的3D神经网络结构并达到突触级别的分辨率对于荧光成像是一个跨领域的巨大挑战，同时也能促进未来整个科技领域的技术进步，特别是从完整的系统组织功能中研究大脑结构与功能之间的关系。要实现在完整的生物系统中研究生物组织的单个分子结构信息依然存在很大的困难。针对荧光探针标记的生物组织进行光学成像时，目前国外对大样本成像的主流技术是将生物组织透明化结合光片荧光显微镜成像技术，通过将生物组织透明化后实现双侧光激发荧光分子实现逐层成像，这种方法成像速度快，但是目前采用的液体试剂透明化制样技术的种类繁多，各有优缺点。

光在不同的物质之间的折射系数(RIs)是不同的，造成了光在体系中的散射率增大。光透明就是使成像目标达到最小的光散射效果，脂质是造成哺乳动物脑光散射的主要因素。因此，去除细胞膜上的脂质并匹配脂质周围生物组织的折射系数就可以实现生物组织透明。现有的生物组织透明化技术分为化学方法和物理与化学结合两种手段。采用化学试剂的方法又可以分为水性透明化试剂和油性透明化试剂。水性透明化试剂保存荧光蛋白的效果较好，对生物组织的处理较为温和，但水性透明化试剂的透明化速率较低，且透明化后生物组织的尺寸极易膨胀，影响到对生物组织原始形貌的分析。油性透明化试剂的透明化速率较快，透明化程度高且生物组织的尺寸变化较小，但是油性试剂对内源性荧光蛋白的淬灭较大。物理与化学结合的方法是将水凝胶交联生物组织与电场手段结合起来，采用水性试剂在电场的作用下加速对生物组织去脂化作用而实现透明化，这种方法的操作流程复杂，可重复性差，且对设备和人员的要求高。同时，液体光透明试剂多有一定毒性，制备样本的程序繁多，样本贮存较难且其荧光信号难以长期保持。现有技术的液体试剂透明化生物组织的试剂和透明化方法对生物组织的内源性荧光蛋白或多或少都有一定程度的破坏，荧光不能良好保持。

另外，为了满足脑神经网络结构成像，仅依靠生物组织内源荧光蛋白往往不能满足荧光成像的要求，通过采用外源荧光染料免疫组化标记同时实现树脂包埋，增强荧光，从而增加成像效果，但是现有技术的树脂包埋技术采用的包埋剂往往不能保证外源荧光染料分子荧光保持良好，因此，亟需一种能够保持内源荧光效果好，能够兼容外源荧光染料标记，实现样本贮存简单且能长期保持荧光信号及工艺简单的生物组织透明化技术。

技术实现要素：

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种光透明化生物组织的包埋剂及方法和应用，其目的在于通过选择具有合适折射率的包埋剂，对预处理后的生物组织或者外源荧光染料标记的生物组织进行包埋，实现生物组织的透明化，同时内源荧光和外源荧光均保持良好，由此解决现有的液体试剂透明化生物组织的化学试剂以及透明化方法中存在荧光蛋白标记和荧光染料标记难以兼容、样本贮存不便和荧光信号难以长期保持的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种光透明化生物组织的包埋剂，所述包埋剂对所述生物组织进行包埋以后形成固化树脂，所述固化树脂与所述生物组织具有相匹配的折射率，从而使所述生物组织实现光透明化。

优选地，所述包埋剂的单体的折射率在1.46～1.55之间。

优选地，所述包埋剂的单体的折射率为1.48～1.53。

优选地，所述包埋剂为树脂包埋剂。

优选地，所述树脂包埋剂为丙烯酸树脂。

优选地，所述丙烯酸树脂包括A、B两个组分，所述A组分按重量份计，包括90至100份的丙烯酸酯树脂单体和0至10份的二丙烯酸酯交联剂；所述B组分按重量份计，包括少于或等于10份的烯基聚合引发剂；所述A组分和B组分的重量配比在90:10至999:1之间。

优选地，所述丙烯酸酯树脂单体为侧基含有苯基的烯丙基化合物。

优选地，所述丙烯酸酯树脂单体为2-苯氧基乙基丙烯酸酯、甲基丙烯酸苯酯、丙烯酸苄酯、甲基丙烯酸苄酯和/或丙烯酸苯酯中的一种或多种。

优选地，所述丙烯酸酯树脂单体为2-苯氧基乙基丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸苯酯。

优选地，所述二丙烯酸酸酯交联剂为含有双烯基的丙烯酸酯化合物。

优选地，所述二丙烯酸酸酯交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、三乙二醇二丙烯酸酯、二乙二醇双丙烯酸酯、四乙二醇二甲基丙烯酸酯、四甘醇二丙烯酸酯和/或三乙二醇二甲基丙烯酸酯中的一或多种。

优选地，所述二丙烯酸酸酯交联剂为四甘醇二丙烯酸酯和/或三乙二醇二甲基丙烯酸酯。

优选地，所述烯基聚合引发剂为偶氮类引发剂和/或过氧类引发剂，所述偶氮类引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二甲酸二叔丁酯、偶氮二异庚腈和/或偶氮二异丁酸二甲酯的一种或多种。

优选地，所述烯基聚合引发剂为偶氮二异丁腈和/或偶氮二异庚腈；所述过氧类引发剂为过氧化二苯甲酰、过氧化双月桂酰、过氧化二叔丁基、过氧化二异丙苯过氧化苯甲酸叔丁酯、过氧化叔戊酸叔丁基酯过氧化二碳酸二异丙酯和/或过氧化二碳酸二环己酯一种或多种。

优选地，所述过氧类引发剂为过氧化二苯甲酰和/或过氧化双月桂酰。

按照本发明的另一个方面，提供了一种光透明化生物组织的包埋方法，包括以下步骤：

(1)生物组织预处理：将生物组织进行固定和脱水处理，得到预处理后的生物组织样本；

(2)渗透：将步骤(1)中获得的预处理后的生物组织在渗透温度且避光环境下浸泡在所述的包埋剂中，使所述包埋剂充分渗透生物组织，获得渗透后的生物组织；所述渗透温度优选为-10℃至4℃；

(3)固化：将步骤(2)中获得的渗透后的生物组织按照设定的升温程序进行固化。

优选地，步骤(3)所述设定的升温程序为：在引发温度为40℃至55℃下引发固化，固化时间为12小时至36小时。

优选地，所述设定的升温程序进行固化具体步骤为：在引发温度40℃下固化8小时，然后在引发温度45℃下固化12小时，然后在引发温度50℃下固化6小时，最后在引发温度55℃下固化3小时。

按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的光透明化生物组织包埋剂的应用，应用于生物组织的光学成像。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果。

(1)本发明提供的生物组织光透明化方法采用高折射率丙烯酸酯包埋剂，通过固化后树脂与生物组织的折射率匹配实现了生物组织的快速透明化；

(2)本发明的透明化工艺简单、采用的试剂便宜易得；

(3)本发明提供的光透明化生物组织的方法，可以适用于光片荧光显微镜和机械层析结合宽场荧光显微镜，还可潜在的应用于电镜。

(4)本发明提供的光透明化生物组织的方法适用于内源性荧光蛋白和外源性荧光染料标记生物组织的透明化，保持荧光信号时间长，可以实现生物组织的快速成像。

附图说明

图1是本发明树脂包埋生物组织透明化方法的流程；

图2是实施例1包埋生物组织的照片；

图3是实施例2包埋前后生物组织内源性荧光蛋白GFP荧光强度对比；

图4是实施例3包埋前后生物组织外源性荧光染料Alexa 488荧光强度对比；

图5是实施例4包埋的内源性GFP标记生物组织的3D神经网络结构；

图6是实施例5包埋前后生物组织外源性荧光染料CY3荧光强度对比；

图7是是对比例6包埋生物组织的照片。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明提出的光透明化生物组织的包埋剂，包埋剂为树脂包埋剂，比如为丙烯酸树脂，丙烯酸树脂包括A、B两个组分：

A组分按重量份计，包括90至100份的丙烯酸酯树脂单体和0至10份的二丙烯酸酯交联剂；

B组分按重量份计，包括少于或等于10份的烯基聚合引发剂；

A组分和B组分的重量配比在90:10至999:1之间。

包埋剂对预处理后的生物组织进行包埋以后形成固化树脂，包埋剂的单体的折射率可以在1.46～1.55之间，优选为1.48～1.53，生物组织的折射率约为1.55-1.56，这样，当该包埋剂对生物组织进行包埋以后，包埋剂单体聚合后形成的固化树脂与生物组织具有相匹配的折射率，这样就能实现生物组织的光透明化，这里所说的相匹配是指折射率相同或者相差不超过0.1。

其中，丙烯酸酯树脂单体为侧基含有苯基的烯丙基化合物，比如为2-苯氧基乙基丙烯酸酯、甲基丙烯酸苯酯、丙烯酸苄酯和/或丙烯酸苯酯中的一种或多种，优选为2-苯氧基乙基丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸苯酯。这种侧基含有苯基的丙烯酸酯单体具有较高的折射率，可以在整体上提高树脂单体的折射率，树脂单体聚合后的折射率会进一步提高。

二丙烯酸酸酯交联剂可以为含有双烯基的丙烯酸酯化合物，优选为乙二醇二甲基丙烯酸酯、三乙二醇二丙烯酸酯、二乙二醇双丙烯酸酯、四乙二醇二甲基丙烯酸酯、四甘醇二丙烯酸酯和/或三乙二醇二甲基丙烯酸酯中的一或多种，优选为四甘醇二丙烯酸酯和/或三乙二醇二甲基丙烯酸酯。这种含有双丙烯基酸酯化合物作为交联剂可以使固化树脂形成交联网状结构，提高树脂的力学性能。

烯基聚合引发剂为偶氮类引发剂和/或过氧类引发剂，偶氮类引发剂可以为偶氮二异丁腈、偶氮二甲酸二叔丁酯、偶氮二异庚腈和/或偶氮二异丁酸二甲酯的一种或多种，优选为偶氮二异丁腈和/或偶氮二异庚腈；过氧类引发剂可以为过氧化二苯甲酰、过氧化双月桂酰、过氧化二叔丁基、过氧化二异丙苯过氧化苯甲酸叔丁酯、过氧化叔戊酸叔丁基酯过氧化二碳酸二异丙酯和/或过氧化二碳酸二环己酯一种或多种，优选为过氧化二苯甲酰和/或过氧化双月桂酰。引发剂的选择影响着包埋时的聚合温度和荧光强度，本发明提供的包埋剂可在中低温引发，保证荧光蛋白活性从而保证荧光强度。

采用上述包埋剂进行生物组织的包埋并实现生物组织的光透明化方法，包括以下步骤：

(1)生物组织预处理：将生物组织进行固定和脱水处理，得到预处理后的生物组织样本；

(2)渗透：将步骤(1)中获得的预处理后的生物组织在一定的渗透温度且避光环境下浸泡在如权利要求1～7任意一项所述的包埋剂中，使所述包埋剂充分渗透生物组织，获得渗透后的生物组织；

(3)固化：将步骤(2)中获得的渗透后的生物组织按照设定的升温程序进行固化。

其中，步骤(2)所述渗透温度为-10℃至4℃。

步骤(3)所述设定的升温程序为：在引发温度为40℃至55℃引发固化，固化时间为12小时至36小时；设定的升温程序进行固化具体步骤为：在引发温度40℃下固化8小时，然后在引发温度45℃下固化12小时，然后在引发温度50℃下固化6小时，最后在引发温度55℃下固化3小时。

本发明提供的光透明化生物组织的包埋剂及方法，主要是运用高折射率的丙烯酸酯聚合后其折射率进一步提高，当和脱水后的生物组织的折射率1.56相匹配时，生物组织就会实现透明化。普通的丙烯酸酯单体的折射率为1.45左右，聚合成固态树脂的折射率只有1.50左右，不能对生物组织进行透明化。本发明通过选择合适折射率的聚合单体、交联剂与引发剂，调配包埋剂中A组分与B组分的成分配比，调配单体的折射率使之聚合后刚好与脱水后的生物组织的折射率匹配，采用折射率为1.50左右的液态丙烯酸酯单体，聚合成固态树脂后的折射率为1.56左右。这种单体的折射率较高是因为侧基含有苯环，来提高光通过树脂的折光率。本发明的生物组织透明化的方法简单易操作，内源性荧光蛋白和外源性荧光染料的荧光保持效果好，包埋成功率高，适用于生物组织片及大样本的光片显微镜成像，同时还适用于自动切削系统和荧光显微镜联用技术的大样本自动化逐层成像，也可以潜在的应用于电镜成像。

高折射率单体包埋生物组织的反应原理如下：

本发明光透明化生物组织采用的包埋剂为反应型交联生物组织的包埋剂，采用该反应型交联生物组织的包埋剂，其自发荧光背景低、透光率高、包埋工艺简单、树脂收缩率低且能较好的保持神经精细结构，兼具环氧树脂和丙烯酸酯树脂的优点，适用生物组织的塑性包埋，成功率高，特别适用于大体积样本及鼠脑全脑的包埋切削成像。

以下为实施例：

实施例1和2及4：

一种生物组织的包埋剂的包埋方法，为中低温固化包埋方法，图1是树脂包埋生物组织透明化方法的流程，如图1所示，包括以下步骤：

(1)生物组织预处理：首先，将鼠脑灌流后取出置于4％的多聚甲醛(PFA)中后固定24小时；然后采用PBS溶液漂洗3次，每次8小时。再采用四氢呋喃/蒸馏水溶液在4℃环境中按照梯度进行脱水，50％四氢呋喃/2小时+75％四氢呋喃/2小时+95四氢呋喃/2小时+100％四氢呋喃/2小时+100％四氢呋喃/4小时；

(2)渗透：然后将脱水后的鼠脑在4℃避光环境下浸渍在备好的树脂单体中2小时再换液，然后再浸渍2天；

(3)固化：包埋剂如表1所示，按重量份计，将表1所示的丙烯酸酯单体2-苯氧基乙基丙烯酸酯90份和交联剂三乙二醇二甲基丙烯酸酯10份的混合物与及引发剂偶氮二异丁腈10份按照重量比99:1混合后，用氮气在一定的流速下进行鼓吹30分钟，将混合好的树脂单体贮存在-30℃的冰箱中备用；

最后将渗透好的鼠脑置于胶囊中并加入混合好的备用树脂单体后在真空烘箱内，将其按照设定的固化条件进行固化，待其缓慢降至室温冷却后即可进行成像处理，其中固化条件及具体步骤为：在引发温度40℃下固化8小时，然后在引发温度45℃下固化12小时，然后在引发温度50℃下固化6小时，最后在引发温度55℃下固化3小时。

实施例2

一种生物组织的包埋剂的包埋方法，包括如下步骤：

步骤(1)和步骤(2)同实施例1。

(3)固化：包埋剂如表1所示，按重量份计，将表1所示的丙烯酸酯单体甲基丙烯酸苯酯95份和交联剂四甘醇二丙烯酸酯5份的混合物与及引发剂偶氮二异庚腈1份按照重量比99:1混合后，用氮气在一定的流速下进行鼓吹30分钟，将混合好的树脂单体贮存在-30℃的冰箱中备用；

最后将渗透好的鼠脑置于胶囊中并加入混合好的备用树脂单体后在真空烘箱内，将其按照设定的固化条件进行固化，待其缓慢降至室温冷却后即可进行成像处理，其中固化条件及具体步骤为：在引发温度40℃下固化8小时，然后在引发温度45℃下固化12小时，然后在引发温度50℃下固化6小时，最后在引发温度55℃下固化3小时。

实施例3

(1)生物组织预处理：首先，将鼠脑灌流后取出置于4％的多聚甲醛(PFA)中后固定24小时；再将鼠脑进行振动机进行切片处理，然后采用PBS溶液漂洗3次，每次8小时。将固定和漂洗后的生物组织采用有机荧光染料分子Alexa 488进行免疫组化标记。首先采用20％DMSO和0.2％Triton X-100的PBS溶液对100微米鼠脑组织片进行打孔处理12小时，然后加入10％的血清封闭12小时，采用PBS漂洗1小时/3次后再按照500:1的比例加入一抗在37℃避光下振动孵育2天，37℃避光下振动孵育2天后再按照800:1的比例加入二抗4℃避光下振动孵育8小时后采用PBS漂洗1小时/3次。

(2)渗透：荧光染料免疫组化后的脑片用100％四氢呋喃/10分钟；然后将脱水后的脑片置于树脂单体中渗透10分钟，放在载玻片上，滴上2滴树脂单体后，盖上盖玻片；其中树脂单体为：按照表1中的配比，按重量份计，将甲基丙烯酸苯酯95份，三乙二醇二甲基丙烯酸酯5份混合后，与引发剂过氧化二月桂酰5份，按照995:5配好以后，用氮气在一定的流速下进行鼓吹30分钟，将混合好的树脂单体贮存在-30℃的冰箱中备用；

(3)固化：将封好的脑片置于烘箱中在真空烘箱内，将其按照设定的固化条件进行固化，待其缓慢降至室温冷却后即可进行成像处理，其中固化条件及具体步骤为：在引发温度40℃下固化8小时，然后在引发温度45℃下固化12小时，然后在引发温度50℃下固化6小时，最后在引发温度55℃下固化3小时。

实施例4

一种生物组织的包埋剂的包埋方法，包括如下步骤：

步骤(1)和步骤(2)同实施例1.

(3)固化：包埋剂如表1所示，按重量份计，将表1所示的丙烯酸酯单体2-苯氧基乙基丙烯酸酯100份与引发剂过氧化苯甲酰10份按照重量比99:1混合后，用氮气在一定的流速下进行鼓吹30分钟，将混合好的树脂单体贮存在-30℃的冰箱中备用；

最后将渗透好的鼠脑置于胶囊中并加入混合好的备用树脂单体后在真空烘箱内，将其按照设定的固化条件进行固化，待其缓慢降至室温冷却后即可进行成像处理，其中固化条件及具体步骤为：在引发温度40℃下固化8小时，然后在引发温度45℃下固化12小时，然后在引发温度50℃下固化6小时，最后在引发温度55℃下固化3小时。

实施例5：

(1)生物组织预处理：首先，将鼠脑灌流后取出置于4％的多聚甲醛(PFA)中后固定24小时；再将鼠脑进行振动机进行切片处理，然后采用PBS溶液漂洗3次，每次8小时。将固定和漂洗后的生物组织采用有机荧光染料分子CY3进行免疫组化标记。首先采用20％DMSO和0.2％Triton X-100的PBS溶液对100微米鼠脑组织片进行打孔处理12小时，然后加入10％的血清封闭12小时，采用PBS漂洗1小时/3次后再按照500:1的比例加入一抗在37℃避光下振动孵育2天，37℃避光下振动孵育2天后再按照800:1的比例加入二抗4℃避光下振动孵育8小时后采用PBS漂洗1小时/3次。

(2)渗透：荧光染料免疫组化后的脑片用100％四氢呋喃/10分钟；然后将脱水后的脑片置于树脂单体中渗透10分钟，放在载玻片上，滴上2滴树脂单体后，盖上盖玻片；其中树脂单体为：按照表1中的配比，按重量份计，将甲基丙烯酸苄酯99份，三乙二醇二甲基丙烯酸酯1份混合后，与引发剂偶氮二异庚腈1份，按照9：1配好以后，用氮气在一定的流速下进行鼓吹30分钟，将混合好的树脂单体贮存在-30℃的冰箱中备用；

(3)固化：将封好的脑片置于烘箱中在真空烘箱内，将其按照设定的固化条件进行固化，待其缓慢降至室温冷却后即可进行成像处理，其中固化条件及具体步骤为：在引发温度40℃下固化8小时，然后在引发温度45℃下固化12小时，然后在引发温度50℃下固化6小时，最后在引发温度55℃下固化3小时。

对比例6

该对比例采用商用的包埋剂(树脂单体、交联剂以及引发剂)，来和本发明采用的包埋剂包埋以后生物组织透明化效果进行比较。

一种生物组织的包埋剂的包埋方法，包括如下步骤：

步骤(1)和步骤(2)同实施例1。

(3)固化：包埋剂如表1所示，按重量份计，将表1所示的丙烯酸酯单体HM 20单体90份和交联剂HM 20交联剂10份的混合物与及引发剂偶氮二异丁腈1份按照重量比99:1混合后，用氮气在一定的流速下进行鼓吹30分钟，将混合好的树脂单体贮存在-30℃的冰箱中备用；

最后将渗透好的鼠脑置于胶囊中并加入混合好的备用树脂单体后在真空烘箱内，将其按照设定的固化条件进行固化，待其缓慢降至室温冷却后即可进行成像处理，其中固化条件及具体步骤为：在引发温度40℃下固化8小时，然后在引发温度45℃下固化12小时，然后在引发温度50℃下固化6小时，最后在引发温度55℃下固化3小时。

表1

表1为实施例1-5以及对比例6采用的包埋剂的种类、配比以及包埋剂调配后折射率一览表。

按以下方法将上述实施例1～5以及对比例6制得的样品进行测试：

包埋鼠脑后的荧光显微镜测试：

样品：将转基因小鼠或者是免疫组化的鼠脑按照上述流程进行包埋成直径1cm，高1.5cm圆柱，采用金刚石刀切平后进行成像。仪器：德国Zeiss双飞秒激光器多光子显微镜。测试条件：视样品具体情况而定。

图2是实施例1包埋生物组织的照片，生物组织完全透明化，可以看出背景纸上的黑色网格。

图3是实施例2包埋前后生物组织内源性荧光蛋白GFP荧光强度对比，包埋后的GFP荧光增强，包埋前后的比例大概是126％，可以看出这种透明化树脂可以很好的保持内源性荧光蛋白，且脱水后体积收缩导致荧光分子聚集，从而提高了荧光强度。

图4是实施例3包埋前后生物组织外源性荧光染料Alexa 488荧光强度对比；可以看出荧光强度是原始状态的80％左右，这说明这种透明化树脂可以满足外源性荧光染料的包埋。

图5是实施例4包埋的内源性GFP标记生物组织的3D神经网络结构；可以神经元的精细结构都得到很好的保持，可以进行大体积样本的包埋。

图6是实施例5包埋前后生物组织外源性荧光染料CY3荧光强度对比；可以看出荧光强度是原始状态的219％左右，由于脱水后收缩导致荧光分子聚集，这说明这种透明化树脂可以满足外源性荧光染料的包埋。

图7是对比例6包埋前后生物组织的照片，由图7可以看出，普通的丙烯酸酯树脂包埋的生物组织基本上不透明，这说明普通的丙烯酸酯固化后树脂的折射率与生物组织的折射率不匹配。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。