一种酸浆苦素B的制备方法及其在抗肺部肿瘤制药中的应用与流程

本发明属中医药领域，涉及酸浆属植物中抗肿瘤活性成分酸浆苦素b(physalinb)的制备方法及其在抗肺部肿瘤制药中的应用。

背景技术：

癌症是目前仅次于心血管疾病的严重危及人类健康的重大疾病。作为一类重大疾病，癌症包括了200多种不同的肿瘤。各种肿瘤在发生发病以及对治疗的反应都有不同的特征，机制十分复杂。肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，随着近年来大气环境的复杂化，其发病率呈逐年上升的趋势，其中非小细胞肺癌占肺癌(nsclc)发病率的80％，已成为癌症类死亡的首要原因[clincancerres.2009,15(6):2076-2084.]。2010年美国肺癌和支气管癌的新发病例估计为22.252万例，其中男性11.675万例，女性10.577万例，死亡15.73万例[anticancerres.12:1155-1166,1992.]。我国目前每年新发肺癌月50万例，到2025年预计我国每年将有100万肺癌患者。大多数nsclc患者就诊时已处于不可切除的局部晚期或远端转移。对于新诊断晚期nsclc患者，以泊类为基础的联合化疗方案的中位生存期为7.4-9.9个月，化疗联合贝伐单抗治疗的中位生存期为12.5个月；二线化疗药物，如培美曲赛和多西他赛的中位无进展生存期约2.2-2.9个月，治疗效果不太理想。临床期待新一代高效低毒的抗肿瘤药物尽快研发、上市。

酸浆苦素(physalins)是存在于酸浆属(physalis)植物(如：锦灯笼、小酸浆、苦蘵等)及其它相近茄科植物中的一类高氧化水平的13,14-裂环-16,24-环麦角甾烷类化合物(c28h30–34o9–12)，自1969年至今，从酸浆属植物中共分离得到30余个酸浆苦素类化合物。physalinb是其中活性较好的一个，研究表明其对肝癌ha22t细胞、宫颈癌hela细胞、鼻咽癌kb细胞、结肠癌colo-205细胞的生长均具有较好抑制作用，但是目前鲜有对physalinb抗肺癌活性及其作用机制的报道。

前期关于physalinb的专利(申请公布号为cn102633861a(申请号为201210119268.8)采用超临界萃取的方法作为提取方法，并且涉及氯仿、甲醇等有机溶剂，不但毒性大、成本昂贵，且不易实现工业化生产。另外，目前，还没有关于physalinb在抗肺部肿瘤方面应用专利的公布。

技术实现要素：
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本发明的目的针对现有技术存在不易实现工业化大生产的不足，提供一种酸浆苦素b的制备方法及其在抗肺部肿瘤制药中的应用，解决了目前治疗肺部肿瘤疾病缺乏相关药物的问题。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：一种酸浆苦素b的制备方法，通过以下途径获得：

(1)取粉碎过的酸浆属植物，加入到3-5倍重量的60vol％乙醇中进行热回流提取两次，合并两次提取液，再减压浓缩至无醇，浓缩后经1-3倍体积的乙酸乙酯萃取两次，再合并两次萃取液，将乙酸乙酯层减压蒸干，得到浸膏。

(2)将步骤(1)获得的浸膏用乙酸乙酯完全溶解，经d101大孔吸附树脂吸附后，依次用10-20倍柱体积的水、20vol％乙醇、40vol％乙醇、50vol％乙醇、60vol％乙醇和70vol％乙醇进行洗脱，收集70vol％乙醇洗脱部分进行浓缩蒸干，蒸干后以6:1-3:1的比例(硅胶填料重量：浓缩物重量)通过常压正相硅胶色谱进行分离，以体积比分别为30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液依次进行梯度洗脱，每个梯度洗脱30个柱体积，收集石油醚和乙酸乙酯的体积比为15:1、10:1和5:1的洗脱液，合并蒸干后得到酸浆苦素b粗品，进一步经丙酮重结晶，即得physalinb单体。

进一步的，所述酸浆属植物为锦灯笼、酸浆、小酸浆或苦蘵。

本发明的另一目的是提供一种上述的酸浆苦素b在制备抗肺部肿瘤药物中的应用。

进一步的，所述的抗肿瘤药物为固体制剂或液体制剂。

进一步的，所述抗肺部肿瘤药物的给药途径为非肠道。

本发明的有益效果如下：本发明的physalinb是可以从酸浆属(physalis)植物(如小酸浆(physalisminima)、酸浆(physalisalkekengi)、苦蘵(physalisangulata)等)中分离纯化得到的，操作简便、且纯度高。此外，具有来源广泛，取材便利等优点，便于工业化大量制备。physalinb在制备抗肺部肿瘤药物中的应用具有显著的抗肺癌作用，由physalinb制备的抗肺部肿瘤药物制剂有很强的现实意义。本发明通过色谱分析及简单的重结晶技术提取制备了酸浆苦素b晶体，该技术简化了酸浆苦素b的制备流程，所制备的酸浆苦素b具有较高的抗肺部肿瘤活性。

附图说明

图1是physalinb的hplc-dad检测图谱(230nm)；

图2是physalinb的二级质谱图(正离子模式)；

图3(a)是不同浓度physalinb对a549细胞生长抑制作用效果图；(b)是不同浓度顺铂对a549细胞细胞生长抑制作用效果图；

图4(a)是不同浓度physalinb对a549细胞凋亡的影响图；图4(b)是不同浓度physalinb对a549细胞周期中sub-g1相所占比率的影响图。

具体实施方式

本发明公开了physalinb在制备肺部肿瘤药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当予以改进。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明中。本发明的应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

实施例1physalinb的制备：

(1)提取：

取干燥锦灯笼(physalisalkekengi)的宿萼5kg，加入到60vol％乙醇15l中进行热回流提取两次，每次回流2小时，合并两次提取液，再减压浓缩至无醇，浓缩后加1倍体积的乙酸乙酯萃取2次，再合并两次萃取液，再将乙酸乙酯层减压蒸干，得560g浸膏。

(2)纯化：

将步骤(1)获得的浸膏用乙酸乙酯完全溶解，经d101大孔吸附树脂吸附后，依次用10倍柱体积的水、20vol％乙醇、40vol％乙醇、50vol％乙醇、60vol％乙醇和70vol％乙醇洗脱，收集70vol％乙醇洗脱部分，减压浓缩，蒸干，得粉末375kg。以6:1的比例(硅胶填料重量：浓缩物重量)上样，通过常压(一个大气压)正相硅胶色谱进行分离，以体积比分别为30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液依次进行梯度洗脱，每个梯度洗脱30个柱体积，收集石油醚和乙酸乙酯体积比为15:1、10:1、5:1的洗脱液，合并至干后得4.6g白色粉末(主成分含量82.1％)，再用丙酮重结晶，得3.4g纯度为98.2％的单体化合物(采用峰面积归一化法计算，附图1)。

实施例2physalinb的制备：

(1)提取：

取干燥锦灯笼(physalisalkekengi)的宿萼5kg，加入到60vol％乙醇25l中进行热回流提取两次，每次回流2小时，合并两次提取液，再减压浓缩至无醇，浓缩后加3倍体积的乙酸乙酯萃取2次，再合并两次萃取液，再将乙酸乙酯层减压蒸干，得582g浸膏。

(2)纯化：

浸膏用乙酸乙酯溶解，用d101大孔吸附树脂吸附后，依次用20倍柱体积的水、20vol％乙醇、40vol％乙醇、50vol％乙醇、60vol％乙醇和70vol％乙醇洗脱，收集70vol％乙醇洗脱部分，减压浓缩，蒸干，得粉末381kg。以3:1的比例(硅胶填料重量：浓缩物重量)上样，通过常压(一个大气压)正相硅胶色谱进行分离，以体积比分别为30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液依次进行梯度洗脱，每个梯度洗脱30个柱体积，收集石油醚和乙酸乙酯体积比为15:1、10:1、5:1的洗脱液，合并至干后得5.3g白色粉末(主成分含量79.1％)，再用丙酮重结晶，得4.2g纯度为97.3％的单体化合物。

实施例3结构鉴定：

经esi-tofms分析得该化合物的分子量为m/z：510.1897，相应的分子式为c28h30o9，其二级质谱图显示(图2所示)主要子离子为493，475,451和171等。¹³c-nmr谱(100mhz，dmso-d6)中给出28个碳信号，δc160以上出现4个碳信号，提示可能存在4个羰基：δc202.4为六元环上α、β不饱和酮的羰基碳信号(c-1)，δc171.8，167.3为酯羰基碳信号(c-18，c-26)，δc209.4为酮的碳信号。δc106.3为缩酮碳，此信号为酸浆苦素类化合物碳谱中的特征性信号，初步认为符合酸浆苦素类化合物的谱学特征。δc126.7，146.1为与羰基共扼的△^2,3；δc135.5，123.4为△^5,6；¹h-nmr(400mhz，dmso-d6)谱中出现了3个烯属碳原子上的多峰质子信号(δh5.60，5.81，6.90)；3个叔碳上的单峰甲基信号(δh1.09，l.16，1.79)；δh2.88(1h，d，j＝4.2，h-25)以及δh3.61(ih，d，j＝14.0，h＝27)和δh4.27(1h，dd，j＝14.0，4.2，h-27)，推测该化合物具有“-och2ch-”结构片断，从而得出该化合物具有c-27与c-14上氧成环的结构。经与与参考文献[tetrahedronletters,1969,10(22):1765-1766.]中报道的physalinb的数据比对，最终确定该化合物为physalinb。

实施例4药效试验：

mtt法检测细胞增殖抑制率将a549细胞以1×104个/孔接种于96孔板中，待细胞贴壁后，分别加入终浓度为0～40umol/lphysalinb，每孔100μl，每个浓度设置5个平行孔，培养24h后，向每孔中加入5g/l的mtt10μl继续培养4h，弃上清，向每孔中加入dmso100μl溶解结晶体，置于摇床振荡30min，至蓝紫色颗粒完全溶解后，于酶标仪570nm波长处测定每孔吸光度值(a)，并计算细胞增殖抑制率(％)＝(1-(加药孔a值-空白对照孔a值))/(对照孔a值-空白对照孔a值)×100％(n＝3)。

研究结果见附图3(a)和(b)，表明以不同浓度physalinb和顺铂分别处理a549细胞24h后，其中physalinb的ic50为5.87umol/l，而在40umol/l顺铂处理后，抑制率仅为18.1％。综上所述，physalinb对a549细胞具有明显的抑制作用且这种抑制作用明显强于顺铂(阳性药物)，且呈浓度依赖性。

实施例5药效试验：

流式细胞仪annexinv-fitc/pi双染色法检测细胞凋亡率将a549细胞以1×105个/孔接种于6孔板中，待细胞贴壁后，分别加入终浓度为0、4、8、16μmol/l的physalinb，每孔1ml，继续培养24h后，按照annexinv-fitc/pi细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，采用流式细胞仪进样测定，根据annexinv-fitc(x)/pi(y轴)荧光做对数散点图，可获得由4个象限组成的双参数图：左上象限(q1)为细胞收集过程中产生的损伤细胞，右上象限(q2)为晚期凋亡细胞和坏死细胞，左下象限(q3)为活细胞，右下象限(q4)为早期凋亡细胞，每个象限的细胞数即为受检总细胞数中所占的比例(n＝3)。

流式细胞仪pi染色法检测细胞周期将a549细胞以1×105个/孔接种于6孔板中，待细胞贴壁后，分别加入终浓度为0、5、10、20μmol/lphysalinb，每孔1ml，继续培养24h后，中止培养，胰酶消化，以冷pbs洗涤细胞3次，70％预冷乙醇混匀，4℃固定过夜，离心，弃去乙醇上清，加入预冷的pbs洗沉淀1次，离心去上清，加入rna酶(50mg/l)10μl/孔和pi(50mg/l)300μl/孔，震荡混匀，室温、避光反应30min，流式细胞仪进行dna检测，用modifit软件分析各时相细胞周期的比例(n＝3)。

研究结果：physalinb对a549细胞的凋亡诱导作用的结果见附图4(a)，4～40umol/lphysalinb处理24h后，q2+q4相比率随着physalinb浓度的升高逐渐增加的同时，细胞周期中sub-g1相所占比率也在逐渐增加(图4(b))，且与空白对照组相比具有显著性差异(p<0.01)。提示physalinb对a549细胞的凋亡诱导效应具有浓度依赖性。

实施例6药效试验：

dapi细胞核染色法观察细胞凋亡的形态学改变细胞处理同“实施例5”，physalinb作用24h后，吸去培养液，用pbs清洗3次，迅即加入40g/l的多聚甲醛液固定15min后，吸去固定液，以pbs清洗3次，用blockingbuffer对细胞进行封闭1h，加入150ul/孔一抗lc3(1:1000/1:500)4℃孵育过夜，弃去一抗，以pbs清洗4次，室温下孵育二抗(fitc,goat,1:150)1h，以pbs清洗4次，1×pbs+dapi(1:1000)室温条件下染色15min，用pbs清洗3次，甘油封片，在olympus-fv1000倒置双子光共聚焦显微镜下观察细胞凋亡形态并随机拍照。

研究结果：以physalinb不同浓度(5、10、20umol/l)处理a549细胞24h后，在olympus-fv1000倒置双子光共聚焦显微镜下观察，可见部分细胞皱缩，出现核固缩、染色质凝集等细胞凋亡形态学变化；lc3抗体(自噬标记物)的荧光值明显增强，细胞受到药物作用自噬作用明显增强，呈现浓度依赖性，说明诱导肺癌细胞自噬是physalinb抗癌作用的机制之一。

实施例7化合物physalinb粉针剂的制备：

physalinb500mg

甘露醇5.0g

将physalinb500mg加400ml注射用水溶解，加入甘露醇5.0g，溶解后定容至500ml，除菌过滤，冷冻干燥即得。

实施例8化合物physalinb注射用水针剂的制备：

physalinb500mg

吐温-80/泊洛沙姆18850ml/80ml

加注射用水至500ml

取physalinb500mg溶于50ml吐温-80或者80ml泊洛沙姆188中，加0.1-0.5％的活性炭除去热原，经微孔滤膜超滤后，补充注射用水至500ml，灌装于安瓿瓶中或输液瓶中，熔封/轧盖，经检验合格后，包装即得。

实施例9化合物physalinb注射用水针剂的制备：

将1.0g环糊精与50ml注射用水混合，形成澄清溶液

在上述溶液中加入1.0gphysalinb，搅拌24小时

注射用水定容至500ml，用0.22μm滤膜过滤除菌后，灌装于安瓿瓶中或输液瓶中，熔封/轧盖，经检验合格后，包装即得。

综上所述，本发明实施例提供physalinb在制备抗肺部肿瘤药物中的应用具有显著的抗肿瘤作用，由physalinb以及含有physalinb提取物制备的治疗肺部肿瘤的药物制剂，具有很强的现实意义。

本发明用于制备抗肺部肿瘤的药物时，将酸浆苦素与液体赋形剂制备成固体或液体制剂。优选地本发明提供的抗肺部肿瘤的药物注射剂为冻干粉针剂或水针剂。本发明制备抗肺部肿瘤的药物时是与液体的赋形剂一起构成的，这里使用的液体赋形剂在本领域是众所周知的，主要有水、甘油、丙二醇、单糖浆、乙二醇、聚乙二醇、山梨糖醇等。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。