本发明涉及生物化工技术领域，具体而言，涉及一种生产微藻油脂的方法。
背景技术：
微藻作为第三代生物质能源，含油量高，易于培养，单位面积产量高等，因此受到广泛关注。同时，微藻中富集了非常多的营养物质，比如雨生红球藻中含有虾青素，盐藻中含有β-胡萝卜素，小球藻中含有成长因子cgf，许多藻类中普遍存在的ω-3不饱和脂肪酸等。所以，如何尽可能多地提取细胞内的有效成分，就成为了目前研究的重点。尤其是针对具有细胞壁的微藻，现有的微藻细胞内容物提取方法通常为先破壁再提取的两步法，而第一步的破壁过程中，为了缩短破壁时间同时提高破壁效率，通常会引入高温或腐蚀性溶剂(例如硫酸)，这些反应条件对细胞内容物的活性造成负面的影响，致使两步法提取后得到的油脂质量差、藻渣焦化变性、藻渣中蛋白质得率低等问题，同时也加大了对所述油脂进一步精制的难度、降低了提油后藻渣的利用价值；如果不加入强酸或是高温，只能通过大幅度延长破壁时间以求达到相近的效果，增加了整体工艺的成本。
从目前公开报道的微藻油脂提取方法来看，当前的方法主要存在步骤繁琐、提取的油脂品质低，并且油脂提取后的蛋白质得取率低的缺点。
技术实现要素：
鉴于此，本发明提出了一种生产微藻油脂的方法，旨在解决现有微藻油脂提取方法步骤繁琐、提取的油脂品质低，并且油脂提取后的蛋白质得取率低的问题。
本发明提出了一种生产微藻油脂的方法，该方法包括以下步骤：(1)将含水量在3％-95％的藻泥、低极性溶剂和低级醇类溶剂组成的混合溶剂以及直径为1-5mm的磨球加入反应釜中，密封反应釜，将反应体系加热至30-70℃后以200-450rpm的转速搅拌0.5-3h；(2)将反应釜降至室温，对反应原料进行固液分离后，除去液相产物中的混合溶剂，得到微藻油脂，将固相藻渣继续分离后得到高蛋白藻渣。
进一步地，上述生产微藻油脂的方法中，所述步骤(1)还包括：向所述反应釜中加入抗氧化剂、惰性气体或还原性气体。
进一步地，上述生产微藻油脂的方法中，所述抗氧化剂为茶多酚、迷迭香或2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚；所述惰性气体为氮气；所述还原性气体为氢气。
进一步地，上述生产微藻油脂的方法中，所述低极性溶剂为石油醚或正己烷；所述低级醇类溶剂为乙醇或异丙醇。
进一步地，上述生产微藻油脂的方法中，所述步骤(1)中加热的温度为40-50℃，搅拌的转速为300-450rpm，搅拌的时间为0.5-2h。
进一步地，上述生产微藻油脂的方法中，所述磨球的直径为2-3mm。
进一步地，上述生产微藻油脂的方法中，所述藻泥和所述混合溶剂的质量比为1:(1-30)；所述混合溶剂中低级醇类溶剂和低极性溶剂的体积比为1:(1-4)。
进一步地，上述生产微藻油脂的方法中，所述藻泥和所述混合溶剂的质量比为1:(1.5-5)；所述混合溶剂中低级醇类溶剂和低极性溶剂的体积比为1:(2-4)。
进一步地，上述生产微藻油脂的方法中，所述藻泥和所述混合溶剂的体积之和，与所述磨球体积的比值为1:(0.5-2)。
进一步地，上述生产微藻油脂的方法中，所述藻泥和所述混合溶剂的体积之和，与所述磨球的体积的比值为1:(0.5-1)。
本发明实施例中提供的生产微藻油脂的方法中，通过在反应体系中加入由低极性溶剂和低级醇类溶剂组成的混合溶剂和磨球对微藻中的油脂进行提取，将破壁与提取合二为一，在保护微藻细胞内容物的条件下提高了油脂的提取效率并简化了工艺流程，在破壁和提取的过程中采用较低的加热温度，缩短了油脂的提取时间，也避免了油脂在提取的过程中被氧化和藻渣中蛋白质由于温度过高而变性，在保证提取的油脂的品质的同时提高了蛋白质的得率。
具体实施方式
为了进一步了解本发明，下面结合实施例对本发明的优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对本发明专利要求的限制。
本发明提供了一种生产微藻油脂的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将含水量在3％-95％的藻泥、低极性溶剂和低级醇类溶剂组成的混合溶剂以及直径为1-5mm的磨球加入反应釜中，密封反应釜，将反应体系加热至30-70℃后以的同时以200-450rpm的转速搅拌0.5-3h。
具体地，藻泥可以通过将微藻以离心或过滤的方式获得，其中，微藻可以选自任意一种具有积累油脂能力的微藻，例如拟微绿球藻、黄丝藻、小球藻、盐藻、蓝藻等。
由于微藻细胞内含有极性不同的油脂，因此，可以选取极性较弱的低极性溶剂和极性较强的低级醇类作为溶剂，分别溶解微藻中的中性脂和极性脂。低极性溶剂可以选自正己烷或沸程在60-90℃(与低级醇沸点接近)的石油醚，低级醇类溶剂可以选自乙醇或异丙醇。例如，乙醇能很好地溶解微藻的细胞膜，使石油醚等低极性溶剂与微藻的细胞内容物进行接触，同时，较小分子粒径的低级醇溶剂(例如乙醇)还可以携带正己烷进出微藻细胞，使得正己烷能与微藻的细胞内容物进行更充分的接触。此外，低极性溶剂和低级醇类性质温和，避免了采用高温和腐蚀性溶剂对微藻细胞内容物造成的破坏从而导致提取的油脂品质较差的问题。
步骤(1)中加热的温度可以优选为40-50℃，搅拌的转速可以优选为300-450rpm，搅拌的时间可以优选为0.5-2h。对反应体系进行加热，有利于促进微藻细胞内容物与混合溶剂的传质效率。将微藻在较低温度，较短时间内进行油脂的提取，能防止微藻原料中如ω-3不饱和脂肪酸、虾青素等热敏性物质遭到破坏，保证了藻渣中蛋白质的品质免受高温的影响。
步骤(1)中磨球的直径可以优选为2-3mm。具体实施时，磨球可以选用二氧化锆磨球，微藻细胞直径与磨球直径的比值可以为1:(1000-1500)。在磨球剪切力和挤压力等机械外力的作用下，微藻的细胞壁被破坏，使得细胞内容物与混合溶剂之间产生了更有效的接触，反应体系的传质效率进一步提升，更有利于油脂的溶出。
步骤(1)中藻泥和混合溶剂的质量比可以为1:(1-30)，优选为1:(1.5-5)。步骤(1)中混合溶剂中低级醇类溶剂和低极性溶剂的体积比可以为1:(1-4)，优选为1:(2-4)。具体实施时，可以根据微藻细胞内油脂的种类与比例选取混合溶剂中低级醇类溶剂和低极性溶剂的体积比，例如当微藻细胞内极性脂占总脂肪的比例大于中性脂占总脂肪的比例时，将低级醇类溶剂和低极性溶剂的体积比确定为1:1。
藻泥和混合溶剂的体积之和，与磨球体积的比值为1:(0.5-2)，可以优选为1:(0.5-1)。具体地，由于对反应体系进行研磨的过程中选用了多个磨球，因此，本发明实施例中的磨球体积为反应体系中所有磨球的体积之和。
(2)将反应釜降至室温，对反应原料进行固液分离后，除去液相产物中的混合溶剂，得到微藻油脂，将固相藻渣继续分离后得到高蛋白藻渣。
具体地，对反应原料进行固液分离的方式可以采用沉降、过滤、抽滤等本领域技术人员所熟知的方式。除去液相产物中混合溶剂的方式可以采用蒸馏等本领域技术人员所熟知的方式。具体实施时，待反应釜内的温度冷却至室温后，过滤磨球和破壁后的微藻浆液形成的固液混合物，然后对破壁后的微藻浆液进行减压抽滤，将固相藻渣和液相产物分离开来，选用新鲜的混合溶剂作为润洗溶剂对固相藻渣进行润洗后，得到蛋白质含量较高的藻渣。将液相产物中的有机相和水相静置分层，收集有机相，再将有机相和固相藻渣的润洗液合并收集后进行减压蒸馏，去除有机溶剂，得到微藻油脂。
可以看出，在反应体系中加入由低极性溶剂和低级醇类溶剂组成的混合溶剂和磨球对微藻中的油脂进行提取，将破壁与提取合二为一，在保护微藻细胞内容物的条件下提高了油脂的提取效率并简化了工艺流程，在破壁和提取的过程中采用较低的加热温度，缩短了油脂的提取时间，也避免了油脂在提取的过程中被氧化和藻渣中蛋白质由于温度过高而变性，在保证提取的油脂的品质的同时提高了蛋白质的得率。
本发明的另一种实施方式中，步骤(1)还可以包括：向反应釜中加入抗氧化剂、惰性气体或还原性气体。抗氧化剂可以选自茶多酚、迷迭香或2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，惰性气体可以为氮气，还原性气体可以为氢气。具体实施时，可以向反应釜中加入适量抗氧化剂或者通入氮气、氢气等保护性气体。
可以看出，通过在反应体系中加入保护剂，能进一步防止研磨过程中油脂被氧化，进一步提高了油脂的品质，进而简化了对所提取的油脂进行精制的步骤、降低了精制成本。
以下结合具体实施例对本发明进行更为详细的说明。
实施例1
称取30g冻干拟微绿球藻(含水量4.78％，初始总脂含量为28.89％，蛋白含量为45.19％)放入600ml容积的反应釜中，再加入140ml正己烷和35ml无水乙醇，最后加入190ml体积的直径为1mm的二氧化锆磨球。将反应釜密封，用n2将空气置换后，加热至50℃并开启搅拌装置，将转速设置为450rpm。反应1h后，过滤磨球和破壁后藻浆液，减压抽滤将固相藻渣和液相产物分离开来，并用新鲜的混合溶剂作为润洗溶剂润洗藻渣2次后，得到提取微藻油脂后的含有蛋白质的藻渣。将液相产物中的有机相和水相静置分层，收集有机相，再将有机相同润洗溶剂合并后经旋转蒸发除去溶剂得藻油7.46g,总脂提取率为90.46％。提取后的油的过氧化值为0.1mmol/kg，酸值为2.2mg/kg，藻渣中蛋白质含量为57.13％。
实施例2
称取40g黄丝藻藻泥(含水量85％，初始总脂含量为25.45％，蛋白含量为12.4％)放入700ml容积的反应釜中，再加入120ml正己烷和60ml异丙醇，最后加入220ml体积的直径为2mm的二氧化锆磨球。将反应釜密封，加入0.01g迷迭香，加热至70℃并开启搅拌装置，将转速设置为200rpm。反应2h后，过滤磨球和破壁后藻浆液，减压抽滤将固相藻渣和液相产物分离开来，并用新鲜的混合溶剂作为润洗溶剂润洗藻渣2次后，得到提取微藻油脂后的含有蛋白质的藻渣。将液相产物中的有机相和水相静置分层，收集有机相，再将有机相同润洗溶剂合并后经旋转蒸发除去溶剂得藻油1.41g,总脂提取率为92.3％。提取后的油的过氧化值为0.1mmol/kg，酸值为1.8mg/kg，提微藻油后藻渣中蛋白质含量为16％。
实施例3
称取50g小球藻(含水量55.95％，初始总脂含量为53.3％，蛋白质含量为23.03％)放入800ml容积的反应釜中，再加入118m石油醚和118ml无水乙醇，最后加入190ml体积的直径为3mm的二氧化锆磨球。将反应釜密封，加入0.01g2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，加热至40℃并开启搅拌装置，将转速设置为450rpm。反应0.5h后，过滤磨球和破壁后藻浆液，减压抽滤将固相藻渣和液相产物分离开来，并用新鲜的混合溶剂作为润洗溶剂润洗藻渣2次后，得到提取微藻油脂后的含有蛋白质的藻渣。将液相产物中的有机相和水相静置分层，收集有机相，再将有机相同润洗溶剂合并后经旋转蒸发除去溶剂得藻油11.74g,总脂提取率为95.73％。提取后的油的过氧化值为0.6mmol/kg，酸值为2.4mg/kg，提微藻油后藻渣中蛋白质含量为45.43％。
实施例4
称取40g盐藻(含水量43.45％，初始总脂含量为68.89％，蛋白质含量为23.19％)放入700ml容积的反应釜中，再加入105ml正己烷和35ml无水乙醇，最后加入300ml体积的直径为5mm的二氧化锆磨球。将反应釜密封，加入0.01g茶多酚，加热至30℃并开启搅拌装置，将转速设置为300rpm。反应2h后，过滤磨球和破壁后藻浆液，减压抽滤将固相藻渣和液相产物分离开来，并用新鲜的混合溶剂作为润洗溶剂润洗藻渣2次后，得到提取微藻油脂后的含有蛋白质的藻渣。将液相产物中的有机相和水相静置分层，收集有机相，再将有机相同润洗溶剂合并后经旋转蒸发除去溶剂得藻油15.58g,总脂提取率为95.44％。提取后的油的过氧化值为0.4mmol/kg，酸值为2.3mg/kg，提微藻油后藻渣中蛋白质含量为67.71％。
实施例5
称取50g蓝藻(含水量30％，初始总脂含量为48.17％，蛋白质含量为33.35％)放入500ml容积的反应釜中，再加入140ml正己烷和35ml无水乙醇，最后加入190ml体积的直径为2.5mm的二氧化锆磨球。将反应釜密封，用氢气将空气置换后，加热至55℃并开启搅拌装置，将转速设置为350rpm。反应3h后，过滤磨球和破壁后藻浆液，减压抽滤将固相藻渣和液相产物分离开来，并用新鲜的混合溶剂作为润洗溶剂润洗藻渣2次后，得到提取微藻油脂后的含有蛋白质的藻渣。将液相产物中的有机相和水相静置分层，收集有机相，再将有机相同润洗溶剂合并后经旋转蒸发除去溶剂得藻油15.21g,总脂提取率为90.19％。提取后的油的过氧化值为0.2mmol/kg，酸值为2.0mg/kg，提微藻油后藻渣中蛋白质含量为58.69％。
对比例1
称取30g冻干拟微绿球藻(含水量4.78％，初始总脂含量为28.89％，蛋白含量为45.19％)放入600ml容积的反应釜中，再加入140ml正己烷和35ml无水乙醇，最后加入190ml体积的直径为2mm的二氧化锆磨球。将反应釜密封，用n2将空气置换后，开启搅拌装置，将转速设置为450rpm，不加热。反应1h后，过滤磨球和破壁后藻浆液，减压抽滤将固相藻渣和液相产物分离开来，并用新鲜的混合溶剂作为润洗溶剂润洗藻渣2次后，得到提取微藻油脂后的含有蛋白质的藻渣。将液相产物中的有机相和水相静置分层，收集有机相，再将有机相同润洗溶剂合并后经旋转蒸发除去溶剂得藻油5.74g,总脂提取率为69.55％。提取后的油的过氧化值为0.1mmol/kg，酸值为2.2mg/kg，提微藻油后藻渣中蛋白质含量为54.23％。
对比例2
称取30g冻干拟微绿球藻(含水量4.78％，初始总脂含量为28.89％，蛋白含量为45.19％)放入600ml容积的反应釜中，再加入140ml正己烷和35ml无水乙醇。将反应釜密封，用n2将空气置换后，加热至50℃并开启搅拌装置，将转速设置为450rpm。反应1h后，过滤破壁后藻浆液，减压抽滤将固相藻渣和液相产物分离开来，并用新鲜的混合溶剂作为润洗溶剂润洗藻渣2次后，得到提取微藻油脂后的含有蛋白质的藻渣。将液相产物中的有机相和水相静置分层，收集有机相，再将有机相同润洗溶剂合并后经旋转蒸发除去溶剂得藻油4.54g,总脂提取率为55％。提取后的油的过氧化值为0.1mmol/kg，酸值为2.2mg/kg，提微藻油后藻渣中蛋白质含量为50.82％。
对比例3
称取40g冻干拟微绿球藻(含水量4.78％，初始总脂含量为28.89％，蛋白含量为45.19％)放入450ml容积的反应釜中，再加入140ml正己烷和35ml无水乙醇，最后加入190ml体积的直径为1.5mm的二氧化锆磨球。将反应釜密封，加热至50℃并开启搅拌装置，将转速设置为450rpm。反应1h后，过滤磨球和破壁后藻浆液，减压抽滤将固相藻渣和液相产物分离开来，并用并用新鲜的混合溶剂作为润洗溶剂润洗藻渣2次后，得到提取微藻油脂后的含有蛋白质的藻渣。将液相产物中的有机相和水相静置分层，收集有机相，再将有机相同润洗溶剂合并后经旋转蒸发除去溶剂得藻油7.46g,总脂提取率为90.44％。提取后的油的过氧化值为9.2mmol/kg，酸值为4.6mg/kg，提微藻油后藻渣中蛋白质含量为57.77％。
由以上实施例和对比例可以看出，控制反应体系的加热温度、在反应体系中加入磨球进行研磨、加入保护剂防止油脂在提取过程中被氧化，有利于提高最终提取的油脂的品质和蛋白质的得率。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。