一种特异性核酸适配体及应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种特异性核酸适配体及应用。

背景技术：

肠出血性大肠杆菌o157∶h7(enterohemorrhagicescherichiacoli，ehec是一种有鞭毛、无芽孢、可运动的革兰氏阴性菌，它是肠出血性大肠杆菌的一个主要菌型。自1982年首次在美国被确认并分离以来，在世界范围内引起广泛传播。大肠杆菌o157:h7主要可引起人类腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征以及血栓形成性血小板减少性紫癜等，死亡率高达30％。大肠杆菌o157:h7在自然界中分别较广，感染后致病力较强，仅数十个活菌就可引发胃肠道感染。在我国，大肠杆菌o157:h7是现有的对国民健康造成重大威胁的致病原之一。因此、高效、快速、灵敏地检测大肠杆菌o157:h7的方法是亟待需要的。

传统的大肠杆菌o157∶h7检测方法主要包括选择性培养基分离培养法，生化方法等，这些方法大多操作步骤繁琐，且耗时较长。随着科学技术的发展，出现了一些新兴检测方法,如以pcr为基础的分子生物学法,免疫学方法，流式细胞仪法及基因芯片法等，这些方法同样也存在着仪器昂贵，操作复杂，费时等缺点。

核酸适配体是通过指数级富集配体的系统进化技术(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex)，从体外人工合成的核酸文库中筛选得到的高亲和力、高特异性结合靶分子的单链寡核苷酸，包括ssdna、rna和修饰rna。适配体因其单链结构，可以形成丰富的自适应的三维空间结构与靶分子结合，扩大了靶分子的范围。此外，核酸适配体还具有稳定性好、易于修饰和保存、无免疫原性的特点。结合适配体的优点，在众多的检测领域中，适配体作为一种新型的识别元件已经成为高效、快速检测技术研究的焦点。因此，筛选大肠杆菌o157:h7的特异性核酸适配体并且建立基于适配体的大肠杆菌o157:h7的快速检测技术具有重要的应用价值。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种特异性核酸适配体，能够特异性结合大肠杆菌o157:h7。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述特异性核酸适配体的应用。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种特异性核酸适配体，能够与肠出血性大肠杆菌o157:h7特异性结合，所述核酸适配体(a46)的核苷酸序列为序列表<400>1所示序列。

优选的，上述核酸适配体a46，所述的核酸适配体为人工合成或pcr扩增或切胶回收单链dna纯化后获得，该核酸适配体为单链dna，由88个核苷酸组成，其一级结构为直链状；二级结构为茎环，最小自由能为11.96kcal/mol。

优选的，上述核酸适配体(a46)，可用修饰材料对所述核酸适配体a46进行修饰，所述修饰材料为功能基团、纳米材料和/或蛋白类材料。

上述核酸适配体(a46)在制备对肠出血性大肠杆菌o157:h7定性和定量检测试剂中的应用，例如，可广泛应用于荧光检测方法、酶联免疫方法以及生物传感器中。

优选的，上述核酸适配体(a46)的应用，所述肠出血性大肠杆菌o157:h7为纯标本或食物中肠出血性大肠杆菌。

本发明的有益效果是：

所述核酸适配体利用全菌消减selex技术筛选而得，分子量较小，易于合成与修饰，能够高特异性识别并且高亲和力结合肠出血性大肠杆菌o157:h7，与其他细菌并不发生特性结合，可用于检测肠出血性大肠杆菌o157:h7，对于有效地预防及控制大肠杆菌o157:h7感染具有重要意义。

附图说明

图1为荧光结合率实验监测适配体筛选过程中每一轮文库与肠出血性大肠杆菌o157:h7结合效率图。

图2为肠出血性大肠杆菌o157:h7核酸适配体的二级结构预测图。

图3为肠出血性大肠杆菌o157:h7与其核酸适配体的解离常数拟合曲线图。

图4为荧光化学分析法检测肠出血性大肠杆菌o157:h7适配体的特异性图。

图5为流式细胞术检测肠出血性大肠杆菌o157:h7适配体的特异性图。

图6为激光共聚焦显微镜方法检测检测肠出血性大肠杆菌o157:h7适配体的特异性图，对于激光共聚焦显微镜下观察适配体a46特异性结果分析(a～e)中，l-代表白光激发；f-代表荧光激发；m-代表白光与荧光激发重叠结果。

图7为基于适配体构建的纳米磁珠-适配体荧光检测方法的标准曲线图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂、耗材如无特殊说明均未常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1

全菌消减selex技术筛选与肠出血性大肠杆菌o157:h7特异结合的核酸适配体

(1)随机单链dna(ssdna)文库以及引物的合成

随机ssdna文库参考相关文献如下：

5’-gcaatggtacggtacttcc-n45-caaaagtgcacgctactttgctaa-3’，中间随机区域为45个核苷酸，两端为固定区域，序列总长为88个核苷酸，库容量为4⁴⁵。筛选所用的引物序列分别为：

primerⅰ：5’-gcaatggtacggtacttcc-3’

primerⅱ：5’-ttagcaaagtagcgtgcacttttg-3’

primerⅲ：5’-gctaagcgggtgggacttcctagtcccacccgcttagcaaagtagcgtgcacttttg-3’

其中primerⅰ在次级文库的制备过程中需要fitc荧光基团进行修饰。在构建的荧光检测方法中适配体a46需要进行生物素修饰。

上述的核酸序列均由上海生工生物有限公司完成。

(2)筛选所用菌株及其培养与收集

上述全部菌株均由军事医学科学院卫生学环境医学研究所提供。

实验选取的靶细菌为e.colio157:h7(cicc21530)；选取的消减细菌为大肠杆菌(atcc25922)，志贺氏菌(cicc21534)，沙门氏菌(cmcc50115)。具体操作方法如下：首先将超净工作台紫外照射灭菌30min，接种过程进行无菌操作，分别将4株保存的菌种各取50μl接种到四支高温高压灭菌的lb肉汤培养基中，于37℃恒温摇床培养箱中培养至菌液浓度10⁷cfu/ml。分别取4个高温高压灭菌的1.5ml离心管，做相应的标记；在无菌环境下，用移液器各取出1ml菌液加入到相应的离心管中，5000r/min离心5min，弃掉上清培养基，用1×pbs缓冲液将菌体沉淀重悬，再次5000r/min离心5min。使用pbs缓冲液洗涤3次，最后将菌体沉淀使用100μlpbs缓冲液重悬，保存于4℃备用。

(3)消减selex筛选过程

首轮筛选的方法是：

1)将体外人工合成的1.5nmol的ssdna文库溶解于100μl结合缓冲液

中，于95℃热变性10min后迅速置于冰上至充分冷却；

2)然后与制备好的1×10⁷的e.colio157:h7和在合适体积的结合缓冲

溶液中混匀，37℃摇床180r/min孵育1h，使ssdna文库与细菌充分作用；

3)8000r/min离心10min，弃上清，使用洗涤缓冲液洗涤(为了增加结

合强度，随着轮数的增加洗涤次数相应增加)；

4)将洗涤后结合ssdna的细菌沉淀溶于100μl双蒸水中，作为模板，使用引物primerⅰ和primerⅲ进行不对称pcr扩增；

5)扩增体系与条件分别为上游引物primerⅰ(10μm)和下游引物primerⅲ(10μm)各1.5μl，premixtaq酶25μl，模板靶细菌-ssdna复合物5μl，灭菌去离子水(ddh2o)17μl。pcr扩增程序：总循环数为35，预变性温度为95℃，时间持续5min；变性温度为95℃，持续时间为1min，退火温度为37℃，持续时间为30s，延伸温度为58℃，持续时间为40s。循环结束后，最后的延伸温度为58℃，持续时间为2min。

次级文库制备：

1)pcr扩增产物利用7m尿素10％的聚丙烯酰胺凝胶(page)进行电泳；

2)将胶块放入凝胶成像仪，打开紫外灯，使用手术刀将目的片段小心的切下；

3)将切取的带有目的dna的胶块置于1.5ml离心管中，离心管提前称取重量并标记，每一轮切取2块9ml凝胶块中的目的片段进行dna回收，以保证回收的dna量；

4)使用生工page胶dna回收试剂盒提取回收dna；

5)将回收纯化得到的ssdna进行浓度和纯度测定，以保证下一轮筛选文库的纯度和使用量达到要求。

为了缩短筛选时间，增加筛选效率，提高筛选适配体的特异性，在第2至7轮加入消减细菌进行消减筛选。将上轮制备获得的ssdna文库经核酸蛋白测定仪测定浓度，计算出下一轮筛选使用ssdna溶液的体积。在消减筛选过程中，将ssdna文库首先与消减细菌混合孵育1h，然后将结合到消减细菌上的ssdna经离心去除掉，将未结合消减细菌的ssdna作为消减文库再与靶细菌孵育、筛选，之后的筛选步骤同第一轮。以此往复，本实验一共进行了7轮筛选。其中每一轮涉及孵育结合、洗涤的操作，都将菌体重悬液转移至一个新的离心管中，以消除管壁对ssdna的非特异性吸附干扰。每一轮筛选均设置阴性对照，即除了将实验组加入的ssdna替换成等体积的1×pbs筛选缓冲液以外，其他操作全部与实验组相同。每一轮的筛选条件见表1。

表1各轮筛选条件

实施例2

荧光化学分析法监测筛选过程

(1)荧光初始文库以及次级文库的制备

1)fitc荧光标记的初始随机ssdna文库直接由上海生工生物有限公司合成；

2)fitc荧光标记的次级ssdna文库通过切胶回收纯化实验获得，具体步骤如下：

①以每轮筛选得到的ssdan-靶细菌为模板，生工公司合成fitc标记的primerⅰ为上游引物，其他引物和pcr条件不变，均参照实施例1中首轮筛选的pcr扩增体系和条件；

②将扩增产物避光保存，fitc标记的ssdna文库制备参照实施例1中的次级文库制备的步骤；

③将每一轮制备的fitc荧光标记的ssdna文库避光于-20℃保存。

(2)荧光强度检测

1)每一轮荧光标记的ssdna各取出25pmol，使用荧光化学分析仪测定其荧光值f0，然后分别与10⁷cfu/ml的靶细菌混合孵育1h；

2)将结合有ssdna的细菌离心、洗涤后用300μl1×pbs溶液重悬；

3)然后95℃加热使ssdna-靶细菌复合物解离，得到fitc荧光标记的ssdna溶液，荧光化学分析仪测定其荧光值f1；

4)计算各轮结合率r＝f1/f0×100％，以此监测各轮筛选的效果以及与靶细菌结合的ssdna的富集情况。

每一轮ssdna文库与靶细菌大肠杆菌o157:h7的结合效率见附图1，随着筛选轮次的逐渐增加，ssdna文库与靶细菌的结合率逐渐增加，第七轮虽然较第六轮有所下降，但整体趋势趋于稳定，因此筛选共进行七轮。

实施例3

克隆与测序

(1)经过7轮筛选，选取与靶细菌结合效率最高的第六轮筛选产物作为模板，利用引物上游引物primerⅰ和下游引物primerⅱ进行pcr扩增，扩增体系与条件参照实施例1中pcr程序；

(2)将pcr产物连接到克隆载体pmd19-t，进行蓝白斑挑选，菌体培养后提取质粒，将质粒送往上海生工生物有限公司测序；

(3)使用chromas和dnaman软件对测序结果进行同源性以及二级结构预测，最终得到与大肠杆菌o157:h7特异结合的核酸适配体(命名为a46)的序列(为序列表<400>1所示序列)及预测二级结构图(见图2)。与大肠杆菌o157:h7特异结合的适配体a46序列长度：88个碱基；序列类型：核酸，单链；序列种类：ssdna。其二级结构预测图表明，适配体含有突出的茎环结构，其最小自由能为11.96kcal/mol，该结构具有较高的稳定性。

实施例4

荧光化学分析法测定核酸适配体的亲和性

(1)将适配体a46进行fitc荧光标记，使用封闭液配制成不同浓度梯度的适配体溶液，浓度分别为10、20、50、100、200、400、600、800、1000nm；

(2)分别与10⁷cfu/ml的大肠杆菌o157:h7在300μl封闭液中37℃摇床孵育1h，离心、洗涤弃上清；

(3)将结合了适配体的菌体沉淀使用300μlddh2o重悬，95℃加热5min，立即置于冰上冷却至室温，10000r/min离心10min，保留上清液于新的离心管中避光保存；

(4)使用荧光化学分析仪测定其荧光值，使用originpro8.0软件绘制非线性拟合结合曲线，并且计算适配体a46的解离常数kd值，计算公式为y＝bmax/x+kd。(其中y为测定荧光值，bmax为体系中最大荧光值，x为适配体浓度)。

如图3所示，得到了核酸适配体a46的饱和结合曲线，并且计算得到适配体a46的解离常数kd值为82.45±18.46nm，说明核酸适配体a46与大肠杆菌o157:h7的亲和力较好。

实施例4

核酸适配体a46的特异性分析

将亲和力较好适配体a46标记fitc荧光基团，各取25pmol的适配体a46然后分别与10⁶cfu/ml的大肠杆菌o157:h7、大肠杆菌atcc25922、福氏志贺氏菌cicc21534、鼠伤寒沙门氏菌cmcc50115、粪肠球菌atcc29212在封闭液中混匀，37℃避光孵育1h，每个样品设置3组实验组和对照组(即不加fitc荧光适配体，加入等体积的1×pbs缓冲液，其他均与实验组相同)，经过洗脱、离心等步骤获得菌体-适配体复合物，加入1×pbs缓冲液将菌体-适配体沉淀重悬。将重悬液分别应用荧光化学分析仪、流式细胞仪以及激光共聚焦显微镜三种方法，检测适配体a46对靶细菌的特异性。

(1)荧光化学分析法检测适配体的特异性

1)首先将荧光化学分析仪与电脑相连接，打开仪器后，设置检测参数，选取激发波长和发射波长分别为485nm和535nm；

2)将空白的黑色酶标板进行扫描检测，以确定空白值；

3)分别取各组的样品悬浮液个200μl加入到黑色酶标板中上机检测，

测得体系荧光值。

荧光化学分析仪检测细菌与适配体结合后的荧光强度，结果如图4所示。分别以未加入荧光适配体a46的组作为对照组，在图4中用绿色表示；以加入荧光适配体的组作为实验组，在图4中用红色代表。根据结果图可以看出，五种细菌的基底荧光值很低，均小于0.7，可以认为基底值不会对结果有显著的影响。大肠杆菌标准菌株、福式志贺氏菌、粪肠球菌和沙门氏菌的实验组及其对应的对照组荧光强度基本没有差异或差异较小，而大肠杆菌o157:h7与适配体孵育结合后，荧光强度达到14以上。与大肠杆菌o157:h7对照组相比，实验组体系的荧光值大幅度提高，说明标记荧光的适配体a46与大肠杆菌o157:h7结合率较高，而与其他4种细菌结合率很低或没有结合。由此可以判断适配体a46具有一定的特异性识别以及结合大肠杆菌o157:h7的能力。

(2)流式细胞术检测适配体特的异性

1)将菌体300μl悬浮液使用细胞筛过滤后加入到流式检测管中；

2)设置激发光和发射光参数分别为485nm和535nm，选择fl1通道；

3)连接上机检测细胞荧光强度。

图5是适配体a46分别与5种细菌孵育结合后流式分析比对结果。图5中每一种颜色的曲线分别对应一种细菌的流式分析结果，从图中可以看出适配体与细菌的结合情况，志贺氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌和粪肠球菌与适配体a46孵育结合后整体的荧光强度集中在10⁰左右；大肠杆菌o157:h7与适配体a46孵育结合后，细胞整体荧光强度峰值向右发生了明显的偏移，峰值接近10¹，表明适配体a46对大肠杆菌o157:h7具有较高的特异性结合能力。

(3)激光共聚焦显微镜检测适配体的特异性

1)将20μl菌体悬浮液涂载到干净的载玻片上；

2)晾干后载玻片置于荧光共聚焦显微镜下观察；

3)激光共聚焦显微镜观察倍数选择80×，选择fitc荧光参数；

4)在目镜下观察到荧光后，采用白光和荧光共同重叠扫描，拍照记录。

激光共聚焦显微镜观察结果如图6所示。使用激光共聚焦显微镜80×放大倍数，选取同一视野进行白光和荧光双波长同时激发，观察细菌与适配体a46的结合情况。图6中5种细菌都可以在白光(l)下观察到，说明细菌成功固定在载玻片上。在荧光激发下，大肠杆菌o157:h7出现大量绿色荧光(a-m)，说明适配体与靶细菌大量结合；绿色荧光标记的细菌全部与白光下的细菌成功重叠(a-f)，说明显示荧光的都是靶细菌，而不是杂质非特异性吸附适配体而产生的假阳性结果；由重叠图像可以看出绝大部分细菌都显示绿色荧光，这表示适配体a46与大肠杆菌o157:h7的结合率很高。而大肠杆菌标准菌株、志贺氏菌和鼠伤寒沙门氏菌在荧光激发下只发现个别绿色荧光(b-f、c-f、e-f)，粪肠球菌在荧光下没有发现荧光(d-f)，由此可以看出，适配体a46几乎不与除大肠杆菌o157:h7以外的细菌结合。以上结果表明亲和力相对较高的适配体a46对靶细菌识别和结合的特异性也较强。

通过亲和力和特异性分析，发现筛选得到的适配体a46对靶细菌大肠杆菌o157:h7可以高特异、高亲和力结合。因此，在此基础之上，结合纳米磁珠构建检测大肠杆菌o157:h7的荧光检测方法。

实施例5

基于适配体构建的纳米磁珠-适配体荧光检测方法的标准曲线

(1)参照m-280磁珠使用说明书步骤，首先将磁珠表面的防腐剂清洗掉；(2)根据已验证的磁珠与dna寡核苷酸结合的量(1mg链霉亲和素磁珠可以结合200pmol的寡核苷酸分子)，向均匀分布的1mg/ml的磁珠中加入过量5’端生物素化修饰的适配体，在37℃温度下使用旋转混合仪进行缓慢的振动孵育30min；

(3)反应结束后通过磁分离器回收磁珠，1×pbs缓冲液洗涤3次，去除未与磁珠结合的适配体，最初加入适配体的量减去未结合的适配体，得到的就是与磁珠结合的适配体的总量；

(4)取200μl磁珠-适配体作为捕获探针，捕获反应体系中存在10⁷cfu/ml的靶细菌，总得孵育体积为300μl，使用旋转混合仪孵育时间30min；

(5)通过磁分离器回收磁珠适配体-靶细菌，每次磁分离时间为3min，使磁颗粒复合物完全被回收，使用1×pbs缓冲液洗涤三次，以去除未与捕获探针结合的细菌；

(6)向其中加入fitc荧光标记的适配体，与37℃孵育结合1h，在磁场作用下富集磁珠，使用1×pbs缓冲液洗涤三次以去除未与靶细菌结合的荧光适配体；

(7)将沉淀重悬于300μl1×pbs缓冲液中使用荧光化学分析仪测定荧光强度(激发波长485nm，发射波长535nm)。

(8)分别取100μl不同浓度梯度的大肠杆菌o157:h7菌液进行平板培养计数；

(9)参照(1)至(7)的方法分别将不同浓度的菌液加入到反应体系中，使用荧光化学分析仪测得相应荧光强度值。

(10)使用软件origin8.0分析荧光值与平皿培养菌落数的关系，并且绘制相关曲线，确定最低检测限。

在最佳的实验条件下，探索大肠杆菌o157:h7菌落数与荧光强度之间的关系。结果如图7所示，实验测得的荧光值与相对应的细菌平皿培养计数呈线性关系，并且相关性良好。大肠杆菌o157:h7荧光检测与平皿计数线性相关方程为if＝0.006x+4.992(r²＝0.982)，线性检测范围是90～5×10⁴cfu/ml，检出限为90cfu/ml。

上述参照具体实施方式对该肠出血性大肠杆菌o157:h7特异结合的核酸适配体及应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所

<120>一种特异性核酸适配体及应用

<130>2017

<141>2017-03-08

<150>2016112034807

<151>2016-12-23

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

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<212>dna

<213>细菌

<220>

<221>特异性核酸适配体a46

<222>(1)..(88)

<400>1

gcaatggtacggtacttcccgcagtttgggaagggtgatcgcactatcagaggattccgt60

tcggcaaaagtgcacgctactttgctaa88

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>引物

<220>

<221>primerⅰ

<222>(1)..(19)

<400>2

gcaatggtacggtacttcc19

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>引物

<220>

<221>primerⅱ

<222>(1)..(24)

<400>3

ttagcaaagtagcgtgcacttttg24

<210>4

<211>57

<212>dna

<213>引物

<220>

<221>primerⅲ

<222>(1)..(57)

<400>4

gctaagcgggtgggacttcctagtcccacccgcttagcaaagtagcgtgcacttttg57