一种源于鸡传染性贫血病毒VP1‑aa1‑19多肽作为高效细胞穿膜肽的应用的制作方法

本发明涉及一种源于鸡传染性贫血病毒(Chicken anemia virus,CAV)VP1-aa 1-19多肽的高效细胞穿膜肽。该多肽可携带FITC在30min内穿入不同的细胞(包括贴壁细胞以及悬浮细胞)。与TAT的比较发现，该多肽对FITC的细胞穿膜功能明显高于TAT。因此，本发明获得的一种源于鸡传染性贫血病毒VP1-aa 1-19多肽的高效细胞穿膜肽具有一定的应用前景与价值。

背景技术：

细胞穿膜肽(Cell penetrating peptides，CPPs)是一类可携带生物大分子进入细胞的短肽，长度一般为5-30个富含带正电荷的碱性氨基酸。它不仅自身可以高效的穿过细胞膜进入细胞，还可将不同种类的外源分子例如荧光素、DNA、RNA、蛋白质、量子点等高效携带进入不同物种的细胞。因这种新型的短肽不仅具备传导效率高、生物毒性低、避免激发体内免疫反应、而且穿膜细胞目标广泛和应用灵活的特点，所以是近20年来快速发展的一类新型外源基因或药物传导载体。

根据穿膜肽结构的理化特性，可将其分为阳离子型、两性分子型和疏水型3种。当前阳离子型CPPs的代表TAT短肽是目前研究最热的穿膜肽之一。但TAT短肽包含2个Furin酶识别切割位点(即RKKR和RQRR)，因此TAT在穿膜过程中会被Furin水解而破坏TAT结构，从而减弱其穿膜能力。一种新型、安全高效的细胞穿膜肽有待被挖掘出来。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种新的安全高效的细胞穿膜肽。

本发明对鸡传染性贫血病毒VP1蛋白N端富含精氨酸序列区(aa 1-60)进行分析设计出具有潜在细胞穿膜功能的多肽(aa 1-19)，经FITC标记后，人工合成。将合成的多肽与不同细胞共孵育，采用激光共聚焦显微镜、流式细胞术和细胞毒性试验鉴定和验证其穿膜功能和穿膜特性，比较其穿膜效率，并评价其安全性。数据显示，其可携带FITC在30min内穿入不同的细胞，包括悬浮培养细胞。而且经比较研究发现，VP1-aa 1-19多肽的细胞穿膜效率明显高于TAT。

本发明公开了源于鸡传染性贫血病毒VP1-aa 1-19多肽作为高效细胞穿膜肽的应用，所述VP1-aa 1-19多肽序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述的应用，具体是VP1-aa 1-19多肽经FITC标记后，携带FITC在30min内穿入不同的细胞。所述细胞包括人结肠癌细胞(HCT-116)、小鼠胚胎成纤维细胞(3T3)、人肾上皮细胞(293T)、犬肾细胞(MDCK)、鸡马立克氏病淋巴瘤细胞(MSB1)。

(1)鸡传染性贫血病毒VP1-aa 1-19多肽的合成和穿膜功能的鉴定

结合UniProt数据库和在线服务器MultiAlin对不同参考株CAV VP1 N端富含精氨酸区域序列区(aa 1-60)进行比对和分析。根据细胞穿膜肽的特性(富含5-30个正电荷氨基酸)，进行设计与生成拟细胞穿膜肽序列(aa 1-19)。经FITC标记后，人工合成。同时以TAT穿膜肽作为阳性对照。将合成的不同短肽分别与293T细胞、HCT-116细胞、3T3细胞、MDCK细胞、MSB1细胞进行共孵育，利用激光共聚焦显微镜和荧光显微镜鉴定其穿膜功能。

(2)鸡传染性贫血病毒VP1-aa 1-19多肽的穿膜特性与穿膜效率的比较

分别设置鸡传染性贫血病毒VP1-aa 1-19多肽在不同的浓度条件下与HCT116细胞进行共孵育，采用激光共聚焦显微镜成像与流式细胞术检测与评价多肽的浓度依赖性。分别设置VP1-aa 1-19多肽在不同的浓度与HCT116细胞进行共孵育，以TAT为对照，采用流式细胞术检测与评价不同短肽的穿膜效率。

(3)鸡传染性贫血病毒VP1-aa 1-19多肽细胞安全性评价

设置鸡传染性贫血病毒VP1-aa 1-19多肽在不同的浓度与HCT116细胞进行共孵育，每个浓度设置3个复孔，共培养12h、24h、48h后，采用细胞毒性试验检测VP1-aa 1-19多肽对细胞的安全性。

本发明制备的一种源于鸡传染性贫血病毒VP1-aa 1-19多肽高效细胞穿膜肽可以携带FITC在30min内进入293T细胞、HCT-116细胞、3T3细胞、MDCK细胞、MSB1细胞，而且穿膜效率与穿膜肽浓度呈正相关性，关键特点其可高效进入悬浮培养细胞。结合激光共聚焦显微镜和流式细胞术结果显示，鸡传染性贫血病毒VP1-aa 1-19多肽的穿膜效率明显高于TAT短肽。

附图说明

图1鸡传染性贫血病毒VP1aa 1-60多重序列的比对

浅灰色背景字母标记带正电荷极性氨基酸。

图2激光共聚焦显微镜检测鸡传染性贫血病毒VP1-aa 1-19多肽携带FITC穿膜的功能。

图3荧光显微镜对鸡传染性贫血病毒VP1-aa 1-19多肽携带FITC进入MSB1细胞功能检测A:VP1-aa 1-19短肽；B:TAT短肽；C：MSB1细胞；D:VP1-M短肽。

图4激光共聚焦显微镜对鸡传染性贫血病毒VP1-aa 1-19多肽穿膜特性的检测。

图5流式细胞术对鸡传染性贫血病毒VP1-aa 1-19多肽穿膜特性的检测

A:HCT116细胞；B:VP1-M(20μM)；C:VP1-aa1-19(1μM)；D:VP1-aa1-19(2μM)；E:VP1-aa1-19(5μM)；F:VP1-aa1-19(10μM)；G：VP1-aa1-19(20μM)；X轴：FITC荧光强度；Y轴：阳性细胞数。

图6流式细胞术对鸡传染性贫血病毒VP1-aa 1-19多肽和TAT肽穿膜效率的比较

X轴：不同浓度的VP1-aa 1-19和TAT短肽；Y轴：阳性细胞FITC荧光强度。

图7MTT实验检测对鸡传染性贫血病毒VP1-aa 1-19多肽的细胞安全性

X轴：不同浓度的VP1-aa 1-19短肽；Y轴：细胞存活率(％)。

具体实施方式

为更好的理解本发明的内容，以下实施方式结合附图阐释一种源于鸡传染性贫血病毒VP1-aa 1-19多肽的高效细胞穿膜肽的制备与鉴定过程。

实施过程

(1)鸡传染性贫血病毒VP1-aa 1-19多肽的制备与合成

使用在线数据库UniProt(http://www.uniprot.org/uniprot/)，对来自不同CAV参考株的VP1序列的N端(aa 1-60)进行序列比对，分析以及标记出序列中所包含的带正电荷的极性氨基酸(如图1)。根据Family&Domains模块的注释信息，对CAV VP1序列的N端(aa 1-60)序列进行特性分析。结果发现，VP1N端具有高度保守性。根据UniProt数据库信息注释可知，VP1的N端(aa 1-47)是一段富含带正电荷的精氨酸区域，并且具有与DNA结合和核定位的特性。

CAV VP1 N端(aa 1-47)氨基酸序列为：MARRARRPRGRFYAFRRGRWHHLKRLRRRYKFRHRRRQRYRRRAFRK(SEQ ID NO.1)。我们根据精氨酸的富集区(aa 1-19)，将其命名为VP1-aa 1-19，经FITC修饰后进行人工合成。为了探讨精氨酸的存在对细胞穿膜肽功能的影响，我们将其中所含的精氨酸突变为不带电荷的甘氨酸(G)或非极性丙氨酸(A)(突变后的短肽命名为VP1-M)，另外以TAT短肽为阳性对照。因此，合成短肽的序列分别为：VP1-aa1-19：MARRARRPRGRFYAFRRGR(SEQ ID NO.2)；TAT：YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO.3)；VP1-M:MAAGAGAPAGAFYAFGAGA(SEQ ID NO.4)；短肽由金斯瑞生物科技有限公司合成。

(2)激光共聚焦显微镜对鸡传染性贫血病毒VP1-aa 1-19多肽穿膜功能和特性的检测

1)提前将灭菌后的细胞爬片置于24孔细胞培养板中，将2×10⁵的293T细胞、HCT-116细胞、3T3细胞和MDCK细胞接种到24孔细胞培养板中。

2)细胞接种12h后，将合成的不同短肽设置为不同的浓度(5μM,10μM,20μM，40μM)与500μL Opti-MEM混合加入到细胞中，37℃，5％CO₂，条件下，共孵育30min后，用PBS清洗3次，每次3min；洗去没有进入细胞的短肽。

3)Hoechst 33342(10μg/mL)染色20min后，弃掉上清，PBS清洗后，加入5μL 7-DDA和500μL蒸馏水，室温下避光孵育15min。

4)最后用甘油封片，透明指甲油进行固片，TCS SP8STED激光共聚焦扫描显微镜分别在不同的波长(561nm>488nm>405nm)，多通道条件下进行扫描拍照，结果如图2和图4。在彩色图片中FITC标记为绿色；Hoechst 33342标记为蓝色。

(3)荧光显微镜对鸡传染性贫血病毒VP1-aa 1-19多肽进入悬浮培养细胞功能的检测

1)将5×10⁵个MSB1细胞接种到12孔板中。

2)取20μM短肽与500μL Opti-MEM进行混合，加入到MSB1细胞中。

3)37℃，5％CO₂，条件下，共孵育30min后，经细胞混合物加入到1.5mL离心管中，1,000×g,离心3min，使用1mL PBS重悬细胞。PBS共清洗3次。

4)最后用500μL Opti-MEM重悬细胞，将细胞悬液加入到12孔板中，荧光显微镜下进行拍照分析，结果如图3。

(4)流式细胞术对鸡传染性贫血病毒VP1aa-1-19多肽的穿膜特性与穿膜效率的检测

1)将5×10⁵个HCT-116细胞接种到12孔板中,12h后待细胞达到90％的融合，用PBS清洗1次。

2)将不同浓度的短肽与500μL Opti-MEM混合加入到细胞中，以不加短肽作为空白对照，37℃，5％CO₂，或4℃条件下，共孵育30min。

3)PBS清洗3次，每次3min。加入200μL胰酶和100μL PBS混匀进行消化2min。加入新鲜细胞培养基终止消化，将细胞悬液收集于1.5mL离心管中，800×g离心2min。

4)弃掉上清。加入1mL PBS，清洗一次。重复一次。加入400μL含1％FBS的PBS重悬细胞，充分混匀，用细胞筛子分别过滤每管细胞于流式管中，采用CyAn ADP7流式细胞仪进行检测。每组样品重复平行3次，并统计其阳性百分率。数据采用FlowJo软件进行分析，结果如图5和图6。

(5)MTT实验

1)将4×10³个HCT116细胞接种到96孔板中，细胞贴壁12h后，分别加入不同浓度的短肽，每个浓度设3个复孔。

2)37℃，5％CO₂，继续培养12h、24h、48h后,向每孔加入20μL噻唑蓝溶液(MTT，5mg/mL),并继续培养3h。然后弃掉细胞悬液。

3)加入二甲基亚砜(DMSO,100μL/孔)。常温放置30min后,用酶标仪在波长490nm处检测其吸光值(OD490),以未加短肽处理的细胞作为阴性对照,并计算各实验组细胞存活率(Cell viability)。

4)细胞存活率(％)＝实验组细胞吸光度值/对照组细胞吸光度值×100％，结果如图7。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 一种源于鸡传染性贫血病毒VP1-aa 1-19多肽作为高效细胞穿膜肽的应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 47

<212> PRT

<213> 鸡传染性贫血病毒

<400> 1

Met Ala Arg Arg Ala Arg Arg Pro Arg Gly Arg Phe Tyr Ala Phe Arg

1 5 10 15

Arg Gly Arg Trp His His Leu Lys Arg Leu Arg Arg Arg Tyr Lys Phe

20 25 30

Arg His Arg Arg Arg Gln Arg Tyr Arg Arg Arg Ala Phe Arg Lys

35 40 45

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ala Arg Arg Ala Arg Arg Pro Arg Gly Arg Phe Tyr Ala Phe Arg

1 5 10 15

Arg Gly Arg

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 4

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Ala Ala Gly Ala Gly Ala Pro Ala Gly Ala Phe Tyr Ala Phe Gly

1 5 10 15

Ala Gly Ala