一种抑制MSCs成纤维分化的方法、MSCs和DNA片段与流程

本发明涉及干细胞领域，具体而言，涉及一种抑制mscs成纤维分化的方法、mscs和dna片段。

背景技术：

间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)，来源于发育早期的中胚层，属于多潜能成体干细胞，是干细胞家族的重要成员；其最先在骨髓中被发现，并广泛分布在人体里，比如骨髓、脐带、脂肪、脐带血、羊膜、(胎盘)绒毛膜、牙髓、胸腺、滑膜、胎儿血和肝脏中。

mscs具有干细胞的一般生物学特点：具有自我复制能力和多项分化潜能；属非终末分化细胞，终生保持未分化或低分化特征，缺乏分化标记；分化情况受所处微环境(干细胞壁龛)的影响；通过对称性和非对称性分裂两种方式生长；具有分裂的慢周期性，绝大多数干细胞处于g0期等。

实验研究已经证实，mscs在体内或体外特定的诱导条件下，可分化成为：骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱、神经样细胞、心肌细胞、支持造血干细胞的基质细胞等多种细胞。

目前，间充质干细胞治疗在临床上被用于治疗一些难治性疾病，如脊髓损伤、脑瘫、肌萎缩侧索硬化症、系统性红斑狼疮、系统性硬化症、克隆氏病、中风、糖尿病、糖尿病足、肝硬化、sars、流感、慢性阻塞性肺炎等。根据初步的临床报告，间充质干细胞对这些疾病的治疗都取得明显的疗效。

但同时mscs在疾病治疗上也存在副作用，其中最突出的副作用之一即为mscs被注入到人体内后存在被诱导分化为成纤维细胞的风险，可能导致组织或器官内纤维结缔组织增多，实质细胞减少，组织过度增长、变硬以及形成瘢痕组织，使得组织或器官的结构被破坏、功能出现减退，乃至衰竭。如果间充质干细胞转化为肿瘤相关成纤维细胞，甚至能够在体内明显促进肿瘤的生长和转移。

因此，mscs分化为成纤维细胞的风险极大地限制mscs在临床治疗中的应用。本领域亟待提供一种抑制mscs向成纤维细胞分化的方法，从而消除mscs在临床治疗方面的副作用。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种抑制mscs成纤维分化的方法，所述方法能够有效抑制mscs向成纤维细胞分化。

本发明的第二目的在于提供一种由上述方法获得的mscs，所述mscs没有分化为成纤维细胞的风险。

本发明的第三目的在于提供一种分离的dna片段，所述dna片段能够有效地抑制mscs中axin1基因的表达。

本发明的第四目的在于提供一种抑制mscs中基因β-catenin、gsk-3β和jnk的表达的方法，所述方法能够有效抑制上述基因的表达从而抑制mscs向成纤维细胞分化。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种抑制mscs成纤维分化的方法，所述方法包括沉默mscs中axin1基因的表达的步骤。

本发明首次发现在mscs中抑制axin1基因的表达能够抑制β-catenin、gsk-3β和jnk的表达，继而能够在诱导mscs向成纤维化方向分化的外界条件下，显著降低成纤维细胞表面分子标记vimentin、α-sma的表达，抑制mscs向成纤维化细胞分化。由此可见，本发明首次发现axin1基因的表达与β-catenin、gsk-3β和jnk的表达之间的调控关系，以及axin1基因的表达与间充质干细胞的成纤维分化能力之间的关系。基于上述发现，本发明首次提出一种抑制mscs成纤维分化的方法，该方法通过简单地沉默axin1基因的表达即可有效地阻断wnt/β-catenin信号通路，获得成纤维细胞分化能力受抑制的间充质干细胞，从而有效降低间充质干细胞在临床治疗上风险。

在一些实施方式中，所述方法通过rnai、基因敲除或甲基化寡核苷酸技术沉默mscs中axin1基因的表达；

优选地，通过rnai沉默mscs中axin1基因的表达。

在一些实施方式中，所述rnai通过将sirna表达载体、化学合成的dsrna或化学合成的sirna转染到mscs中的方式沉默axin1基因的表达；

优选地，所述rnai通过sirna表达载体沉默mscs中axin1基因的表达。

在一些实施方式中，所述sirna表达载体为慢病毒载体或腺病毒载体，所述sirna表达载体上连接干扰axin1基因表达的dna片段；

优选地，所述sirna表达载体为慢病毒载体；

更优选地，所述慢病毒载体为pgc-lv，所述dna片段的正义链如seqidno：1所示，所述dna片段的反义链如seqidno：2所示。

本发明所述方法对rnai干扰的dna片段做出进一步限定，所述dna片段是经过精心设计和大量筛选才从设计和合成的众多干扰axin1基因标的的dna片段中筛选获得的，其对axin1基因的抑制效率远远高于其他dna干扰片段。

在一些实施方式中，所述方法还包括沉默mscs中其他基因的表达的步骤，其中，所述其他基因为介导疾病的基因。

在一些实施方式中，所述疾病选自遗传疾病、病毒疾病和癌中的一种或几种；优选地，所述疾病选自亨廷顿氏病、帕金森氏病、阿尔兹海默氏病、急性心机梗塞、囊性纤维化、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、老化相关的黄斑变性、急性肺损伤、严重急性呼吸综合征、获得性免疫缺陷综合征、流感、慢性阻塞性肺病中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述mscs为哺乳动物来源的mscs；

优选地，所述哺乳动物来源为人源、小鼠源、大鼠源、猴源、猪源、羊源、牛源或犬源；

更优选地，所述哺乳动物来源为人源、小鼠源或大鼠源。

在一些实施方式中，所述mscs选自骨髓mscs、脂肪mscs、脐带来源mscs、脐带血来源mscs、肌肉mscs中的一种或多种；

优选地，所述mscs选自骨髓mscs、脂肪mscs和脐带来源的mscs中的一种或多种；

更优选地，所述mscs为骨髓mscs。

本发明还涉及根据上述方法获得的mscs。

本发明上述mscs，其分化为成纤维细胞的能力被抑制，能够安全地用于临床治疗。

本发明还涉及一种分离的dna片段，所述dna片段由正义链和反义链组成，其中正义链的核苷酸序列如seqidno：1所示，反义链的核苷酸序列如seqidno:2所示。。

rnai技术的关键在于sirna序列的设计，不同sirna作用的效果差别很大，sirna的沉默效率与靶位点的选择和具体的细胞内环境有关，因此，要想获得沉默效率高的sirna并非易事。本发明所述dna片段是经过精心设计和大量筛选才最终获得的dna片段，将该片段插入到sirna的表达载体中能够有效地抑制axin1基因的表达，其沉默基因axin1的效率远远高于其他干扰axin1表达的dna片段。

本发明还涉及一种抑制mscs中基因β-catenin、gsk-3β和jnk的表达的方法，所述方法包括沉默mscs中axin1基因的表达的步骤。

本发明上述方法首次利用沉默axin1基因的表达的方式抑制mscs中基因β-catenin、gsk-3β和jnk的表达，从而通过简单的方式有效地抑制mscs向成纤维细胞分化。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)、本发明首次发现抑制axin1基因的表达能够抑制β-catenin、gsk-3β和jnk的表达，继而能够在诱导mscs向成纤维化方向分化的外界条件下，显著降低成纤维细胞表面分子标记vimentin、α-sma的表达，抑制mscs向成纤维化细胞分化。基于上述发现，本发明首次提出一种抑制mscs成纤维分化的方法，该方法通过简单地沉默axin1基因的表达即可有效地阻断wnt/β-catenin信号通路，从而有效抑制mscs向成纤维细胞分化。

2)、本发明提供一种基因axin1表达被抑制的mscs，该mscs不具备分化为成纤维细胞的能力，降低mscs在临床治疗过程中分化为成纤维细胞的风险。

3)、本发明提供一种dna片段，该dna片段是经过精心设计和大量筛选才获得的，其对axin1基因的抑制效率远远高于其他干扰axin1基因表达的干扰序列。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为抑制小鼠mscs成纤维化的流程图；

图2为原代及传代培养的小鼠骨髓mscs细胞形态图(放大倍数×100)；a：原代培养mscs7天；b：原代培养mscs14天；c：p1代小鼠mscs；d：p3代小鼠mscs；

图3为转染慢病毒(病毒稀释度为10^-3)后，小鼠骨髓mscs在荧光显微镜下的成像图；

图4为小鼠骨髓mscs的mtt试验结果图；

图5为小鼠骨髓mscs的免疫印迹检测结果图；

图6为小鼠骨髓mscs的realtimert-pcr检测结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1小鼠mscs的原代培养

按以下方式培养培养小鼠骨髓mscs：

(1)选用约30～40g的c57bl/6雌性小鼠，无菌条件下分离小鼠的股骨和胫骨，剔除肌肉组织和结缔组织，pbs洗净骨髓腔，吹散骨髓，获得骨髓细胞悬液，随后经100目筛网过滤细胞，去除碎骨和其他杂质。

(2)收集细胞悬液，以1500rpm/min，离心5分钟，弃上清，用1：4的pbs和ack红细胞裂解液的混合液重悬细胞，以1500rpm/min，离心15分钟，弃尽上清。pbs清洗3次。

(3)用含10％fbs的dmem基础培养基(加入1％l-谷氨酰胺，1％青链霉素)重悬细胞，以1×10⁶个/ml的密度接种于100mm的细胞培养皿中，置于37℃、5％co2饱和湿度的细胞培养箱，恒温培养48小时后首次换液，去除悬浮的未贴壁细胞，之后每3天换液一次，直至细胞生长至80％融合。

(4)用0.25％胰酶-edta消化细胞，以1：2的比例传代并继续培养。

(5)在显微镜下观察原代以及传代培养的小鼠骨髓mscs(参见说明书附图图2)。

实施例2制备axin1-rnai慢病毒载体

按以下方式制备axin1-rnai慢病毒载体：

(1)经过多次筛选后最终确定合成两条单链dna寡核苷酸用于抑制axin1基因的表达，其核苷酸序列分别如下所示：

正义链(5’-3’)：tcccactttgaatgaggatgaactcgagttcatcctcattcaaagtgggttttttc(seqidno：1)；

反义链(5’-3’)：tcgagaaaaaacccactttgaatgaggatgaactcgagttcatcctcattcaaagtggga(seqidno：2)。

(2)通过退火使所述单链dna寡核苷酸配对产生双链，形成的双链两端含酶切位点的粘性末端，直接连接到酶切后的rnai慢病毒载体pgc-lv上。

(3)将连接产物转入制备好的dh5α细菌感受态细胞，pcr鉴定阳性重组子后，送测序验证，测序结果经比对确认正确的克隆即为构建成功的目的基因rnai慢病毒载体。

(4)扩增并包装axin1-rnai的慢病毒表达载体。

实施例3axin1-rnai慢病毒载体的滴度检测

按以下方法包装和检测axin1-rnai慢病毒载体的滴度：

(1)高质量病毒载体的制备：制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件phelper质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提。

(2)共转染293t细胞：按invitrogen公司lipofectamine2000使用说明进行共转染293t细胞，转染8h后，更换为完全培养基。

(3)病毒的收获和浓缩：培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液。

(4)采用tcid50(tissuecultureinfectiondose50)法测定病毒滴度：①将处于对数生长期、生长状态良好的293t细胞接种到96孔板中进行培养；②对病毒液进行10倍梯度稀释，稀释后的浓度为10^-1～10^-10；③将稀释后的病毒液接种至293t细胞，每个稀释度接种10孔；④4天后观察各稀释度是否出现cpe现象，以及出现cpe的孔数：10^-1到10^-10各个稀释度出现cpe的孔数分别为：10，10，10，10，10，10，9，5，1，0；⑤利用公式计算病毒滴度：t＝10^1+d(s-0.5)，其中d＝log10稀释度，s＝阳性比率之和，将数据带入上述公式，得到，d＝log1010＝1，s＝(0+1+5+9+10+10+10+10+10+10)/10＝7.5，t＝10^1+1(7.5-0.5)＝10⁸tcid50/ml。

实施例4axin1-rnai慢病毒载体转染小鼠骨髓mscs

按以下方法转染axin1-rnai慢病毒载体至骨髓mscs：

(1)慢病毒转染前24h,将贴壁细胞以50％/孔的密度铺到6孔板中，使细胞在慢病毒转染时的数量在70％/孔左右。

(2)取出分装存于-80℃的病毒，用无血清无抗生素培养基对病毒进行10倍梯度稀释，10倍梯度稀释的范围为10^-2～10^-6；在稀释后的病毒中加入聚凝胺(polybrene)，使其终浓度为6μg/ml；将稀释后的病毒接种到小鼠骨髓mscs中。

(3)培养48小时后在荧光显微镜下观察细胞的转染效率。

(4)在培养24、48、72、96和120小时后分别通过mtt试验检测转染后小鼠骨髓mscs的增殖能力。

试验结果证实：病毒在稀释至10^-3时转染效率最高，转染阳性率高于90％(参见说明书附图图3)且对细胞增殖能力无显著影响(参见说明书附图图4)，不影响mscs细胞的增殖能力。

实施例5axin1-rnai对小鼠骨髓mscs中wnt/β-catenin信号通路蛋白表达的影响

将体外培养的小鼠骨髓mscs随机分为两组：control组(正常培养的小鼠骨髓mscs)和mscs+axin1-rnai慢病毒组(培养转染axin1-rnai慢病毒的mscs，其中用于转染的慢病毒载体的稀释后浓度为10^-3)。

转染72小时后通过免疫印迹技术检测小鼠骨髓mscs的wnt/β-catenin信号通路蛋白的表达，其中，免疫印迹技术按如下方法实施：

(1)收集1×10⁷细胞/组，加入1ml裂解液(50mmtris-hclph7.4，150mmnacl，1％np-40，0.1％sds，1×蛋白酶抑制剂)，冰浴裂解20min。10000r/min离心20min，收集上清。取1μl用pbs稀释10倍，采用bradford法测定蛋白浓度，将各组样品调至等浓度。按样品：缓冲液＝4：1的比例加入5×缓冲液(50％甘油，250mmph6.8tris-hcl，10％巯基乙醇，0.25％溴酚蓝，10％sds)，稀释至工作浓度。95℃水浴10min，分装后-80℃保存。

(2)采用12％预制蛋白分离胶，按预定顺序添加样品和marker，其中样品和marker的加样量为10μl。80v恒压电泳，待溴酚蓝到达分离胶底部时停止电泳，取下胶块，进行半干法转膜，转膜结束后取出pvdf膜置于封闭液(含3％脱脂奶粉和0.3％bsa)，37℃封闭1h。封闭结束后，pvdf膜在pbst(含0.05％tween20的pbs)中漂洗1次。采用1:3000兔抗一抗包被，37℃孵育2h，pbst漂洗3次，每次6min。1：10000的带hrp山羊抗兔二抗包被，室温1h后用pbst漂洗6次。hrp-ecl化学发光法曝光，获得蛋白印迹图片，进行图像分析。

免疫印迹结果显示：mscs转染axin1-rnai三天后(第二代)，mscs中β-catenin、gsk-3β、axin1、jnk蛋白的表达即显著下调(参见说明书附图图5)。

实施例6axin1-rnai转染对小鼠骨髓mscs成纤维分化的影响

检测小鼠骨髓mscs中成纤维细胞表面相关mrna的表达：在control组和mscs+axin1-rnai慢病毒组中加入终浓度为0.5ng/ml的tgf-β进行培养，培养至第16天(第四代)，采用realtimert-pcr方法检测各组细胞中成纤维细胞表面分子标记vimentin以及α-sma的mrna表达水平。

其中，realtimepcr的具体检测方法如下：

(1)通过软件primerexpress3.0涉及检测vimentin、α-sma和gapdh的上、下游引物和探针，其具体序列如表1所示：

表1pcr引物表

(2)配制如下所示pcr反应体系：

(3)按如下程序进行pcr扩增：55℃逆转录30min，94℃预变性2min，紧随多个循环，每一循环94℃变15s，58℃退火、延伸45s，最后一个循环后，25℃保持。

(4)记录数据，spss13.0进行数据分析，origin7.5软件进行作图。

realtimert-pcr的检测结果表明：小鼠骨髓mscs培养体系中加入tgf-β后，成纤维细胞表面分子标记的mrna表达出现显著上调，并持续高表达；与之相比，转染axin1-rnai抑制了wnt/β-catenin信号通路的传导，mscs中成纤维细胞表面分子标记vimentin、α-sma的表达水平趋于正常(参见说明书附图图6)。由此可见，axin1-rnai抑制小鼠骨髓mscs向成纤维细胞分化。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

sequencelisting

<110>江苏省疾病预防控制中心

<120>一种抑制mscs成纤维分化的方法、mscs和dna片段

<130>2017.4.11

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