技术领域：
:本发明涉及一种真菌拟盘多毛孢提取物及其应用，属于应用微生物学领域。
背景技术：
：:阿尔茨海默氏病(alzheimer’sdisease,ad)，又称老年性痴呆症，是中枢神经系统，起病隐袭的神经变异性疾病，表现为一种慢性进行性过程，是常见的与年龄相关的疾病之一。继心血管疾病，癌症和中风之后，ad成为威胁老年人健康的又一大杀手锏，给病患带来极大的痛苦，也给患者家庭和社会带来非常沉重的负担。而在老年性痴呆症发病机制研究中，胆碱能缺失学说认为老年性痴呆症患者大脑内神经递质—乙酰胆碱的缺失是导致ad疾病的关键原因。缺乏乙酰胆碱导致ad患者认知功能下降，记忆力减退。乙酰胆碱酯酶是一个关键的生物神经传导酶，执行神经传导的重要功能。同时它是治疗ad的一个目标靶点，乙酰胆碱酯酶抑制剂可以明显改善和缓解ad病人的症状，也是临床上治疗阿尔茨海默症最有效的药物之一。因此寻找乙酰胆碱酯酶抑制剂是治疗该病的重要来源之一。经文献检索，未发现与本技术实现要素：相同文献的公开报道。
发明内容本发明的目的在于提供一种真菌拟盘多毛孢提取物及其应用。本发明是这样实现的：1.本发明使用的真菌菌株是拟盘多毛孢(pestalotiopsissp.)glgs-5,菌株glgs-5已于2017年1月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏号：cgmccno.13577。2.拟盘多毛孢(pestalotiopsissp.)glgs-5提取物的制备培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)为常规培养基。培养基的组成和配制方法如下:马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)：马铃薯200g切成小块加水煮沸半小时后，过滤取滤液用自来水定容至1l，加入葡萄糖20g和琼脂20g，121℃灭菌20分钟。用pda培养基，在25℃对真菌拟盘多毛孢(pestalotiopsissp.)glgs-5进行固体培养20天后，将平板上的培养基连同菌体一起切成均匀小块放入锥形瓶中，用乙酸乙酯:甲醇:乙酸＝80:15:5(v/v/v)混合溶剂浸泡提取，浸泡3d后过滤，重复提取3次，合并过滤后的上清液，采用旋转蒸发仪蒸干后得粗提物，4℃保存备用。3.乙酰胆碱酯酶抑制活性测定方法a.乙酰胆碱酯酶(ache)溶液的配制:500u的乙酰胆碱酯酶被溶解于5ml无菌水中，即得100u/ml的酶溶液。100u/ml的酶液用ph＝8.0的pbs稀释成0.1u/ml的酶液供ellman法使用。0.1m的na2hpo4溶液：称取na2hpo4·12h2o共3.58g加水溶解至100ml。0.1m的nah2po4溶液：称取nah2po4·2h2o共1.56g加水溶解至100ml。0.1m的ph＝8.0的pbs:取5.3ml0.1mnah2po4溶液和94.7ml0.1mna2hpo4溶液，充分混合即为0.1mph＝8.0的pbs。b.活性测定：6.25mmdtnb的配制：24.77mgdtnb先用500μl的无水乙醇溶解，再加1.5mgnahco3，然后用pbs定容到10ml。6.25mmatci的配制：18.07mgatci加蒸馏水溶解并定容至10ml，4℃冰箱保存10-15d。他克林溶液的配置：1.56mg的他克林用pbs稀释成6.66μm的待用溶液。待测样液的配置：取准确称重浸膏20mg，用1mldmso溶解，然后用pbs稀释至2.67mg/ml，混匀，得待测样品溶液，临用前配置。ache能够催化使其底物类似物碘化硫代乙酰胆碱(atci)发生降解，从而能生成硫代胆碱和乙酸，反应生成的硫代胆碱与显色剂dtnb反应能生成黄色物质，在波长为405nm处有特异光吸收。待测物与乙酰胆碱酯酶的混合液在37℃反应，如果待测物对ache有抑制作用，那么ache就能催化底物类似物atci从而使降解的量减少，相应的与dtnb反应生成的黄色物质就会减少，即在405nm处的光吸收值就会变小，以此来筛选具有抑制ache活性的化合物。c.实验过程：用准备好的备用溶液进行反应，反应在96孔板中进行，向96孔板中依次加入下列试剂(加入试剂的体积为一个反应的体积)，每个样品做3个重复；铺板：200ul/体系，体系如表1所示，每孔内化合物的终浓度为2.67mg/ml，他克林的终浓度为0.333μm。表1反应体系加入显色剂和底物后1小时内，每30秒钟检测一次405nm吸光值。选择nc组吸光值平均值约为1时的样品吸光值，计算化合物吸光值平均值(化合物测定值-背景值)，并按照(nc-化合物吸光值平均值)/nc*100％来计算化合物ache抑制率。本发明的优点在于：拟盘多毛孢(pestalotiopsissp.)glgs-5固体发酵提取物活性很好，对ache抑制率达61.8％。能够作为制备乙酰胆碱酯酶抑制剂应用。具体实施方式：以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。实施例的拟盘多毛孢(pestalotiopsissp.)glgs-5发酵提取物的制备过程及乙酰胆碱酯酶抑制活性测定方法同
发明内容部分的描述。实施例1：将拟盘多毛孢(pestalotiopsissp.)glgs-5菌块接种到pda固体培养基上，在25℃培养20天后，将培养基连同菌体一起切成均匀小块放入锥形瓶中，用乙酸乙酯:甲醇:乙酸＝80:15:5(v/v/v)混合溶剂浸泡提取，浸泡3d后过滤，重复提取3次，合并过滤后的上清液，采用旋转蒸发仪蒸干后得粗提物，4℃保存备用。应用ellman法测定了拟盘多毛孢(pestalotiopsissp.)glgs-5固体发酵提取物对ache的抑制作用，结果用百分率表示，样品终浓度为2.67mg/ml。表1ache抑制率样本ta提取物浓度(mg/ml)0.0662.67抑制率(％)60.5861.8抑制活性++++测定结果表明，拟盘多毛孢(pestalotiopsissp.)glgs-5固体发酵提取物活性很好，对ache抑制率达61.8％。能够作为制备乙酰胆碱酯酶抑制剂应用。当前第1页12