一种盐适应性改良的内切木聚糖酶改组突变体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及基因工程及蛋白质改造技术领域，具体来说是一种盐适应性改良的内切木聚糖酶突变体及其应用。

背景技术：

木聚糖主链是由木糖聚合而成的多聚糖，侧链含有l-阿拉伯糖等残基。木聚糖是半纤维素中最丰富的一种多糖，广泛存在于玉米芯、甘蔗渣、麦麸、秸秆等作物资源中，最高可占植物细胞干重的三分之一。内切木聚糖酶可降解木聚糖主链结构，产生木寡糖和/或木糖，可应用于食品、酿酒、饲料、纺织及造纸等领域(collinsetal.femsmicrobiolrev,2005,29:3–23.)。

耐盐酶可应用于高盐食品和海产品加工及其它高盐环境生物技术领域，如腌制食品加工、高盐稀态酱油发酵、洗涤等；在高盐环境下加工食品还可以防止微生物的污染、节省灭菌等所消耗的能源(margesin和schinner,extremophiles,2001,5:73–83.)。但由于高盐浓度下的盐析作用，大部分的酶在高盐浓度下不具有良好的催化活性。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种盐适应性改良的内切木聚糖酶突变体s35h04，所述突变体s35h04的氨基酸序列如seqidno.1所示。

进一步的，所述突变体s35h04的最适ph为5.0，最适温度为65℃，50℃时的半衰期为30min，在20.0-25.0％(v/v)的nacl中具有62-69％的活性，在10.0-30.0％(w/v)的kcl中具有103-112％的酶活。

本发明的第二目的是提供一种盐适应性改良的内切木聚糖酶突变体s35h04的编码基因s35h04，其核苷酸序列如seqidno.2所示。

本发明的第三目的是提供一种包含内切木聚糖酶突变体s35h04编码基因s35h04的重组载体。

本发明的第四目的是提供一种包含内切木聚糖酶突变体s35h04编码基因s35h04的重组菌。

本发明的第五目的是提供一种盐适应性改良的内切木聚糖酶突变体s35h04在食品领域中的应用。

本发明还提供一种盐适应性改良的内切木聚糖酶突变体s35h04的制备方法，按以下步骤进行：

1)将s35h04和表达载体peasy-e2相连接，并将连接产物转化大肠杆菌bl21-gold(de3)，获得包含s35h04的重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组突变内切木聚糖酶表达；

3)回收并纯化所表达的突变内切木聚糖酶s35h04。

4)活性测定。

本发明的有益技术效果是：与野生酶相比，突变内切木聚糖酶s35h04的盐适应性发生了改变。纯化的突变酶s35h04、野生酶rxynagn16l和rxynahj3的最适ph分别为5.0、5.5和6.0，最适温度分别为65℃、50℃和75℃；内切木聚糖酶rxynahj3在50℃时稳定，rxynagn16l在50℃时极不稳定，s35h04在50℃时的半衰期约为30min。在10.0mm的β-mercaptoethanol、cocl2和feso4中，突变体s35h04的酶活比野生酶rxynahj3的酶活分别高24％、25％和37％；在20.0–25.0％(w/v)的nacl中，突变体s35h04的酶活比野生酶rxynahj3和rxynagn16l的酶活高18-33％；在10.0–30.0％(w/v)的kcl中，突变体s35h04的酶活比野生酶rxynahj3的酶活高15–30％，比野生酶rxynagn16l的酶活高25–55％。本发明的突变内切木聚糖酶s35h04可应用于食品行业、海产品加工和高盐环境生物技术领域。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1：在大肠杆菌中表达的重组内切木聚糖酶rxynagn16l、rxynahj3及其突变体s35h04的sds-page分析，其中，ck：蛋白质marker；

图2：重组内切木聚糖酶rxynagn16l、rxynahj3及其突变体s35h04的ph活性；

图3：重组内切木聚糖酶rxynagn16l、rxynahj3及其突变体s35h04的ph稳定性；

图4：重组内切木聚糖酶rxynagn16l、rxynahj3及其突变体s35h04的热活性；

图5：重组内切木聚糖酶rxynagn16l、rxynahj3及其突变体s35h04的热稳定性；

图6：重组内切木聚糖酶rxynagn16l、rxynahj3及其突变体s35h04在nacl中的活性；

图7：重组内切木聚糖酶rxynagn16l、rxynahj3及其突变体s35h04在kcl中的活性。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

试验材料和试剂

1、菌株及载体：大肠杆菌escherichiacolibl21-gold(de3)和表达载体peasy-e2购自北京全式金生物技术有限公司；节杆菌(arthrobactersp.)和列舍瓦里尔菌(lechevalieriasp.)由云南师范大学提供。

2、酶类及其它生化试剂：dna聚合酶及dntp购自北京全式金生物技术有限公司，山毛榉木聚糖购自sigma公司，玉米芯木聚糖购自上海源叶生物科技有限公司，易错pcr试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司，细菌基因组提取试剂盒购自genestar公司，popculture^tm细胞裂解液购自德国默克集团有限公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

lb培养基：peptone10g，yeastextract5g，nacl10g，加蒸馏水至1000ml，ph自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1：突变文库的构建

①按照genestar公司细菌基因组提取试剂盒说明书提取节杆菌(arthrobactersp.)和列舍瓦里尔菌(lechevalieriasp.)基因组。

②根据genbank记录的节杆菌(arthrobactersp.)内切木聚糖酶核苷酸序列jq863105(seqidno.3)，设计引物5'gtgcagccggaggaaaaacg3'和5'gatgaaggcaggatccggggt3'，以节杆菌(arthrobactersp.)基因组为模板进行pcr扩增，获得内切木聚糖酶基因xynagn16l；另根据genbank记录的列舍瓦里尔菌(lechevalieriasp.)内切木聚糖酶核苷酸序列jf745868(seqidno.4)，设计引物5'gtctcggccccgccggacgt3'和5'ggctcgcttcgccagcgtgg3'，以列舍瓦里尔菌(lechevalieriasp.)基因组为模板进行pcr扩增，获得内切木聚糖酶基因xynahj3。

③pcr反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min30sec，30个循环后72℃保温10min。

④以上述pcr产物为模板，利用易错pcr试剂盒，按照试剂盒说明书进行基因突变。

⑤用超声打断仪biorupter对易错pcr产物进行超声随机打断，打断产物经2％琼脂糖凝胶电泳后切胶纯化。

⑥纯化后的小片段dna自身互为引物和模板进行dna家族改组(dnafamilyshuffling)pcr，pcr反应参数为：96℃变性1min30sec；然后94℃变性30sec，依次65℃退火90sec、62℃退火90sec、59℃退火90sec、56℃退火90sec、53℃退火90sec、50℃退火90sec、47℃退火90sec、44℃退火90sec、41℃退火90sec，72℃延伸1min30sec，35个循环后72℃保温7min。

⑧以纯化的dna家族改组pcr产物为模板，用内切木聚糖酶基因xynahj3和xynagn16l扩增引物和反应条件进行序列全长扩增，扩增产物含突变序列和未突变序列。

⑨将序列全长扩增产物和表达载体peasy-e2相连接，并将连接产物转化大肠杆菌bl21-gold(de3)，经过夜培养，从转化平板中挑取单菌落于含有150μl液体lb培养液(含100μgml^-1amp)的96孔细胞培养板中，于37℃，快速振荡培养约16h后，每孔加入40％(w/w)的甘油50μl，混匀后于-70℃保存。

实施例2：突变体的筛选

1)从保存突变文库的96孔细胞培养板中取2μl菌液，接种于含200μl/孔液体lb培养液(含100μgml^-1amp)的96深孔板中，于37℃，200rpm振荡培养至od600>1.0(约20h)，加入含2mmiptg和100μgml^-1amp的200μl液体lb培养液，于20℃，160rpm过夜诱导。

2)诱导结束后加入40μl/孔的popculture^tm细胞裂解液，在25℃下，震荡裂解细胞30min。

3)取50μl含1.0％(w/v)山毛榉木聚糖的mcilvaine缓冲液(ph＝7.0)及50μl细胞裂解产物，在96深孔板中于70℃恒温箱中反应2h。反应结束后加入150μldns试剂终止反应，于140℃恒温箱中保温20min以上并冷却至室温，使用酶标仪读取od540nm的值，以只含有peasy-e2空载体的e.colibl21-gold(de3)菌株裂解液反应组作为对照。

4)取有内切木聚糖酶活性的突变体细胞裂解产物10μl，另取90μl含0.5％(w/v)山毛榉木聚糖的mcilvaine缓冲液(ph＝7.0)，加入10％(w/v)和25％(w/v)的nacl，在96深孔板中于70℃恒温箱中反应10min。

5)反应结束后加入150μldns试剂终止反应，于140℃恒温箱中保温20min以上并冷却至室温，使用酶标仪读取od540nm的值，以不含nacl的对应突变体裂解液反应组作为对照。

6)比较突变体与野生重组酶rxynagn16l和rxynahj3的酶活大小，获得在10％(w/v)和25％(w/v)nacl中酶活提高的1个突变体，编号为s35h04，该突变体氨基酸序列如seqidno.1所示，其是两个野生酶的改组杂合体，该突变体核苷酸序列如seqidno.2所示。

实施例3：突变体s35h04及野生酶rxynagn16l和rxynahj3的酶制备

将含突变体s35h04、野生酶rxynagn16l和rxynahj3的重组菌株以0.1％的接种量分别接种于lb(含100μgml^-1amp)培养液中，37℃快速振荡16h。

然后将此活化的菌液以1％接种量接种到新鲜的lb(含100μgml^-1amp)培养液中，快速振荡培养约2–3h(od600达到0.6-1.0)后，加入终浓度0.1mm的iptg进行诱导，于20℃继续振荡培养约20h。12000rpm离心5min，收集菌体。用适量的ph＝7.0tris–hcl缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经13,000rpm离心10min后，吸取上清并用nickel-ntaagarose和0–500mm的咪唑分别亲和和纯化目的蛋白。

sds-page结果(图1)表明，突变酶s35h04、野生酶rxynagn16l和rxynahj3都获得了纯化，产物为单一条带。

实施例4：突变体s35h04及野生酶rxynagn16l和rxynahj3的纯化酶的性质测定

1)突变体s35h04及野生酶rxynagn16l和rxynahj3的纯化酶的活性分析

活性测定方法采用3,5－二硝基水杨酸(dns)法：将底物溶于缓冲液中，使其终浓度为0.5％(w/v)；反应体系含100μl适量酶液，900μl底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应10min，然后加1.5mldns终止反应，沸水煮5min，冷却至室温后在540nm波长下测定od值；1个酶活单位(u)定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生1μmol还原糖(以木糖计)所需的酶量。

2)突变体s35h04及野生酶rxynagn16l和rxynahj3的纯化酶的ph活性和ph稳定性测定：

酶的最适ph测定：将酶液置于37℃下和ph＝4.0–12.0的缓冲液中进行酶促反应。酶的ph稳定性测定：将酶液置于ph＝3.0–12.0的缓冲液中，在37℃下处理1h，然后在ph＝7.0及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。缓冲液为：mcilvainebuffer(ph＝3.0–8.0)和0.1mglycine–naoh(ph＝9.0–12.0)。以山毛榉木聚糖或玉米芯木聚糖为底物，反应10min，测定纯化的内切木聚糖酶的酶学性质。结果表明：突变酶s35h04、野生纯化酶rxynagn16l和rxynahj3的最适ph分别为5.0、5.5和6.0(图2)；在ph＝5.0时，s35h04和rxynahj3稳定而rxynagn16l不稳定，但在ph＝11.0时，s35h04不稳定而rxynagn16l和rxynahj3稳定(图3)。

3)突变体s35h04及野生酶rxynagn16l和rxynahj3的纯化酶的热活性及热稳定性测定：

酶的热活性测定：在ph＝7.0的缓冲液中，于0–90℃下进行酶促反应。酶的热稳定性测定：将同样酶量的酶液置于37℃处理0–60min后，在ph＝7.0及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以山毛榉木聚糖或玉米芯木聚糖为底物，反应10min，测定纯化的内切木聚糖酶的酶学性质。结果表明：s35h04、rxynagn16l和rxynahj3的最适温度分别为65℃、50℃和75℃，在70℃分别具有81.1％、17.7％和97.7％的酶活(图4)；rxynahj3在50℃时稳定，rxynagn16l在50℃时极不稳定，s35h04在50℃时的半衰期约为30min(图5)。

4)不同金属离子及化学试剂对突变体s35h04及野生酶rxynagn16l和rxynahj3的纯化酶活力的影响：

在酶促反应体系中加入10.0mm的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。在37℃及ph＝7.0条件下，以山毛榉木聚糖或玉米芯木聚糖为底物测定酶活性。结果(表1)表明：10.0mm的hgcl2可完全抑制s35h04、rxynagn16l和rxynahj3；在10.0mm的β-mercaptoethanol、cocl2和feso4中，突变体s35h04的酶活比野生酶rxynahj3的酶活分别高24％、25％和37％。

表1.金属离子及化学试剂对突变体s35h04及野生酶rxynagn16l和rxynahj3活力的影响

5)突变体s35h04及野生酶rxynagn16l和rxynahj3的纯化酶在nacl和kcl中的活性：

酶在nacl中的活性测定：在酶促反应体系中加入3.0–30.0％(w/v)nacl，于ph7.0及37℃下进行酶促反应。以山毛榉木聚糖或玉米芯木聚糖为底物，反应10min，测定纯化的内切木聚糖酶的酶学性质。结果表明：在20.0–25.0％(w/v)的nacl中，突变体s35h04的酶活比野生酶rxynahj3和rxynagn16l的酶活高18-33％(图6)。

酶在kcl中的活性测定：在酶促反应体系中加入3.0–30.0％(w/v)kcl，于ph7.0及37℃下进行酶促反应。以山毛榉木聚糖或玉米芯木聚糖为底物，反应10min，测定纯化的内切木聚糖酶的酶学性质。结果表明：在10.0–30.0％(w/v)的kcl中，突变体s35h04的酶活比野生酶rxynahj3的酶活高15–30％，比野生酶rxynagn16l的酶活高25–55％(图7)。

6)蛋白酶抗性测定：

酶的蛋白酶抗性：用相当于重组酶10倍(w/w)的胰蛋白酶(ph＝7.5)和蛋白酶k(ph＝7.5)在37℃对重组酶处理1h，然后在ph＝7.0及37℃下进行酶促反应，以置于蛋白酶对应ph缓冲液中但未加蛋白酶的酶液作为对照。结果表明：经胰蛋白酶和蛋白酶k在37℃下处理1h，s35h04、rxynagn16l和rxynahj3的酶活几乎无损失。

本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。

最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

sequencelisting

<110>云南师范大学

<120>一种盐适应性改良的内切木聚糖酶改组突变体及其制备方法和应用

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>344

<212>prt

<213>杂合序列

<400>1

valseralaproproaspvalserglyhislysglnthrleuargser

151015

alaalaprolysglyphehisileglythralavalalaglyglygly

202530

hishisgluasnglnprotyrproaspprophethrseraspserglu

354045

tyrarglysvalleualaalaglupheasnservalserprogluasn

505560

glnmetlystrpglutyrilehisprogluargglyargtyrasnphe

65707580

glymetalaaspalailevalargphealalysglnasnargglnval

859095

valargglyhisthrleumettrphisserglnasnproglntrpleu

100105110

gluglnglyasnpheserlysglugluleuargglyileleulysasp

115120125

hisvalglnthrvalvalglyargtyralaglylysileglnglntrp

130135140

aspvalalaasngluilepheasnaspaspglythrleuargalathr

145150155160

gluasniletrpleuarggluleuglyproaspileilealaaspval

165170175

pheargtrpalahisglualaaspprolysalalysleuphepheasn

180185190

asppheglyvalgluaspileasnalalysseraspalatyrleuglu

195200205

leuileproargleuglnalaglnglyvalglnvalaspglypheala

210215220

ileglnglyhisleuserthrargtyrglypheproserglyleugln

225230235240

alaasnleuglnargpheaspaspleuglyleugluthralailethr

245250255

gluileaspvalargmetaspilealaalaglythrgluprothrala

260265270

gluglnleugluglnglnalaasptyrtyrglnargalaleugluala

275280285

cysleuservalalaaspcysasnserphethriletrpglyphethr

290295300

asplystyrsertrpvalprovalphepheglnglyglnglyalaala

305310315320

thrvalmettrpasnasppheglyarglysglnalatyrtyrthrleu

325330335

argserthrleualalysargala

340

<210>2

<211>1032

<212>dna

<213>杂合序列

<400>2

gtctcggccccgccggacgtgagcggccacaaacagacgttgcgctcggcagcgcccaag60

ggtttccacatcggcacggccgtcgcgggcggcggccaccacgagaaccagccgtacccg120

gaccccttcacctcggacagcgagtaccggaaggtgctggccgcggagttcaactcggtc180

tcgcccgagaaccagatgaagtgggagtacatccacccggagcgcggccggtacaacttc240

ggcatggccgacgccatcgtccggttcgccaagcagaaccggcaggtggtccgcgggcac300

accctgatgtggcacagccagaatcctcagtggctggagcagggaaacttctccaaagaa360

gaactgcgcggaatcctcaaagaccacgtccagactgtagtgggcaggtacgccggcaaa420

atccagcagtgggacgtcgccaacgaaatcttcaatgatgacggaaccctgcgcgccacc480

gagaacatttggcttcgtgaactgggcccggacatcattgccgacgttttccgctgggcg540

cacgaggccgaccccaaggccaagctgttcttcaatgatttcggcgttgaggacattaat600

gccaagagtgatgcctacctcgaactcatcccccggcttcaggcacagggcgtgcaggtt660

gacgggtttgccatccagggccatctgagcacccgctacggtttcccttcagggctgcag720

gccaacctgcagcgctttgacgacctggggctggaaaccgccattacggaaatagacgtc780

cgcatggatattgcagccggcacggagccgacggccgagcagcttgagcagcaggcggac840

tactaccagcgcgcccttgaggcctgcctgtccgttgcagactgcaattcgttcaccatt900

tggggcttcaccgacaagtactcgtgggtgccggtcttcttccaggggcagggtgcggcc960

acggtgatgtggaacgacttcggtcgcaagcaggcgtactacacgctgcggtccacgctg1020

gcgaagcgagcc1032

<210>3

<211>3639

<212>dna

<213>节杆菌（arthrobactersp.）

<400>3

atgaaggttccgcgtttattaaccgctctggctgtaacctcggcgctgctgctgccggcg60

gttccggcgcttgccgtgcagccggaggaaaaacgtcctccgggccagtccaaacaggac120

acgctgcgccgtgcagcccccaaagacttcaagattggttccgccgttgcgggcggaggc180

catcatgaggcccaggactaccccgatccttttacgttcgataaggaataccgccggcaa240

ctggccgccgagttcaattcggtgtcaccggagaaccagtcgaagtgggaattcatccac300

ccggaaaaggatgtctaccgcttcacggaaatggacgccattgtccgctccgcccaaaaa360

aacaagcaggtggtgcgcggccacaccctcttttggcacagccagaatcctcagtggctg420

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gtagtgggcaggtacgccggcaaaatccagcagtgggacgtcgccaacgaaatcttcaat540

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attgccgacgttttccgctgggcgcacgaggccgaccccaaggccaagctgttcttcaat660

gatttcggcgttgaggacattaatgccaagagtgatgcctacctcgaactcatcccccgg720

cttcaggcacagggcgtgcaggttgacgggtttgccatccagggccatctgagcacccgc780

tacggtttcccttcagggctgcaggccaacctgcagcgctttgacgacctggggctggaa840

actgccattacggaaatagacgtccgcatggatattgcagccggcacggagccgacggcc900

gagcagcttgagcagcaggcggactactaccagcgcgcccttgaggcctgcctgtccgtt960

gcagactgcaattcgttcaccatttggggcttcacggacaagtactcgtgggttccggtc1020

ttctttgccggcgagggcgaggcgacagtcatggaggaagacttcacgcgcaagcctgcc1080

tactttgccctgcgggaaacactgaagcgtccggtgccgaagcccgacgacggcggcccg1140

tcccagccaaccccggatcctgccttcatccccggcggcgccgccaacccgacagcgacg1200

ccgatcgcagcatcccgcggcaccggcaactccgtggcgctcaccttcgatgacgggccc1260

gagcccggcgaaaccacagctgtcctcgatttcctcaaggacaagggcatcactgccacc1320

ttctgcgtcatcggagcgaacatccaggcccccggcggagccgagctggtgaagcgcatg1380

gtcgaggagggccacacgctgtgcaaccacggcaccacgtatgcggacatgggttcgtgg1440

acccaggaacagattaaggccgacctggtggaaaacctccgcatcatccgtgaagccgcc1500

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ggcgaagtagccgcagcgcttggtatgcagccgctgggcctgggcaatgtcatctttgac1620

tgggacggcaatgacctcagcgaagccaccctcacggcaaacctccgtgccgcgttcacc1680

cccggcgcggtggtgctggcgcacgtcggcggcggtgaccggaccaacacagtgaaggca1740

gttacgacggtcgtgaccgaaaagctcgcccaggggtggacgttcgcccttccgcagggc1800

ggtgccccggaggaaccttccggcggtgtgccctcggacttcgagaccggaaccgacggc1860

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ggaagcctgctggtcacgaaccggacccaggactggcacggtgccgcactcgacgtcacg1980

ggcgccctaccggtcggctcggccgtaaagatgtccgtctgggccaagctcgcccccggg2040

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