一种基于肝癌循环肿瘤细胞生物凝胶悬滴培养法建立肝癌异种移植瘤模型的方法与流程

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是一种基于肝癌循环肿瘤细胞生物凝胶悬滴培养法建立肝癌异种移植瘤模型的方法。

背景技术：

肿瘤细胞可以从病灶脱落入血形成肿瘤细胞在150年前就已经被揭示出来，但是该领域在过去的一百多年间几乎没有重大的发现，原因是ctc在血液中十分稀有，如何富集和鉴定外周血中的肿瘤细胞一度成为极大的技术瓶颈。在相当长的一段时间内，ctc的研究都停滞于通过pcr或流式手段检测全血中特异性的肿瘤分子表达，从而反应外周血循环肿瘤细胞数。但这种方法可靠性极低，仅以肝癌为例，在患者外周血中检测afpmrna表达量曾成为定义hcc-ctc丰度的指标，但在实际应用中，大量肝炎、肝硬化乃至肝移植围手术期的患者外周血中均检测到高峰度的afpmrna，其特异性令人难以满意。随着新型激光技术与纳米磁粒子技术的进步，这一问题近年来以得到解决。2004年美国食品和药品管理局(foodanddrugsadmistration,fda)批准了cellsearch系统用于检测转移性乳腺癌患者外周血ctc，成为第一个获准进入临床运用的ctc检测方法。这一系统通过epcam磁珠在外周血中捕获ctc并进行染色，通过细胞荧光对dapi+/ck+/cd45-的细胞进行计数。此后基于微流控芯片技术、免疫磁珠分选技术的ctc检测手段逐渐涌现，ctc与多种肿瘤复发转移以及预后的联系被逐步揭示。

目前现有的技术依然无法满足ctc研究和临床诊断的需要。从肿瘤患者体内可以富集的ctc数目极少，一般10ml血中只能捕获数十个ctc，必须通过培养扩增才可以进行功能研究。虽然目前有报道可以通过滤膜技术大量富集ctc移植到免疫缺陷鼠体内建立pdx模型(patient‐derivedxenograft)，并且通过这一模型研究人员在乳腺癌、前列腺癌与结肠癌中开展了大量功能实验，特别是耐药研究。但是从目前报道来看，这种方法需要患者大量的外周血用于ctc分离，同时建模成功率不高，同时价格昂贵。既然如此，能否给予特定的生产环境，让ctc在体外充分生长后，继而移植裸鼠体内建立患者的个体化pdx模型，从而减少建模所需血量，并提高pdx建模成功率，是本发明研究的重点。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于温敏型生物凝胶悬滴培养肝癌循环肿瘤体系的构建异种移植瘤的方法，具体是通过该培养体系，可以体外对肝癌患者的循环肿瘤细胞进行扩增，并形成多细胞克隆，挑取该克隆接种裸鼠可以在皮下、肝内和肺部形成肿瘤，建成异种移植瘤模型；本发明还提供温敏型生物凝胶培养上清的制备方案与配方。

本发明以温敏型凝胶以羟丁基壳聚糖和泊洛沙姆(poloxamer)为骨架，添加了肿瘤细胞所在的细胞外基质(ecm)所含有的iv型胶原、透明质酸与硫酸氨基葡糖多聚糖等组分，充分模拟肿瘤在体内的生长环境，使肝癌ctc可以在凝胶中生长，并通过分泌iv型胶原酶溶解部分机制，形成显微镜下可见的克隆环，方便镜下挑取克隆。为了促进该体系中的ctc能够进一步扩增，本发明分离了5例肝癌患者肿瘤相关成纤维细胞(taf)，以人包皮成纤维细胞(hff)为对照，进行表达谱芯片分析，筛选出肝癌taf中特异性高表达的20种生长因子或细胞因子(图1)。之后按照yamanaka筛选ips关键转录因子的策略，逐一剔除来观察ctc表型，最后筛选到5种细胞因子的组合，包括egf、fgf、kgf等，共同加入后会有部分ctc出现显著的表型变化，发生显著扩增。

本发明的第一方面，提供一种用于肝癌ctc温敏型生物凝胶悬滴培养法的试剂，包括温敏型生物凝胶和悬滴培养法培养上清，所述的温敏型生物凝胶，由体积比为8:1:1的a液、b液和c液组成(混合时是将a液、b液和c液三种液体按比例逐一混合，并用无菌铂金棒搅拌均匀，全过程在冰上操作)；

所述的a液，包括生物凝胶的骨架溶液和基质溶液，7ml骨架溶液与1ml基质溶液在冰上混合，并用无菌铂金棒搅拌均匀，4℃保存，即得a液；

所述的生物凝胶的骨架溶液：使用亲水链聚氧乙烯占60％以上的泊洛沙姆，配置体积分数为20-45％的泊洛沙姆溶液；配置体积分数为0.2-0.7％的羟丁基壳聚糖溶液；两种液体在冰上冰浴15min后，将两者按体积比1：1充分混合，获得所述的生物凝胶的骨架溶液；

所述的生物凝胶的基质溶液：将0.5-0.8mgiv型胶原、0.01-0.1mg分子量为10000-50000的透明质酸和0.01-0.1mg硫酸氨基葡糖多聚糖于1ml超纯水中4℃下过夜溶解，获得生物凝胶的基质溶液；

所述的b液组分为10倍浓度的dm/f12培养基，每1mlb液中加入1000-5000iu的rh-egf，作用为调节生物凝胶内的营养成分和离子浓度；

所述的c液组分为ph＝2.5-3.0的乳酸-乳酸钠缓冲液(0.025-0.05mol)，作用为调节生物凝胶内的ph值。

所述的悬滴培养法培养上清(原则上现配现用)，具体配置为：dm/f12培养基中加入8-10％的gibco10099-141胎牛血清，每100ml培养基加入l-谷氨酰胺200mm-500mm；每100ml培养基按如下配方加入细胞因子或生长因子：rh-egf100-2000iu、rh-fgf-1100-2000iu、rh-tgf-α0.1-5μg、rh-igf-10.1-1μg和rh-kgf0.1-1μg。

本发明的第二方面，提供上述的用于肝癌ctc温敏型生物凝胶悬滴培养法的试剂在建立肝癌异种移植瘤模型中的应用。

本发明的第三方面，提供一种肝癌ctc温敏型生物凝胶悬滴培养法，包括以下步骤：

(a)取肝癌患者10ml外周血，ficoll密度梯度离心法分离患者外周血有核细胞；

(b)使用stemcellcd45阴选试剂盒去除白细胞，20μl磷酸盐缓冲液(pbs)重悬；

(c)上述的温敏型生物凝胶的a液、b液和c液按比例逐一混合，并用无菌铂金棒搅拌均匀，加入细胞，全过程在冰上操作(具体为800μla液在冰上先与100μlb液混合，无菌铂金棒搅拌均匀后，加入100μlc液，再次搅拌均匀，加入20μl细胞悬液，全过程在冰上操作)；

(d)24孔培养板在37℃预热30min，细胞凝胶混合液50μl/滴加至预热培养板上，使凝胶迅速转化为果冻状；

(e)37℃、5％co2细胞培养箱中孵育2h，加入37℃预热的上述的悬滴培养法培养上清1ml；

(f)连续培养7天形成克隆环。

本发明的第四方面，提供一种基于温敏型生物凝胶悬滴培养肝癌循环肿瘤体系的构建异种移植瘤的方法，包括以下步骤：

(a)取肝癌患者10ml外周血，ficoll密度梯度离心法分离患者外周血有核细胞；

(b)使用stemcellcd45阴选试剂盒去除白细胞，20μl磷酸盐缓冲液(pbs)重悬；

(c)上述的温敏型生物凝胶的a液、b液和c液按比例逐一混合，并用无菌铂金棒搅拌均匀，加入细胞，全过程在冰上操作(具体为800μla液在冰上先与100μlb液混合，无菌铂金棒搅拌均匀后，加入100μlc液，再次搅拌均匀，加入20μl细胞悬液，全过程在冰上操作)；

(d)24孔培养板在37℃预热30min，细胞凝胶混合液50μl/滴加至预热培养板上，使凝胶迅速转化为果冻状；

(e)37℃、5％co2细胞培养箱中孵育2h，加入37℃预热的上述的悬滴培养法培养上清1ml；

(f)连续培养7天形成克隆环，4x物镜下挑取mc克隆，缓冲液稀释后接种裸鼠，继续饲养建成肝癌异种移植瘤模型；所述的mc克隆是在培养7天后可以形成50个以上细胞构成的细胞团的克隆。

优选的，所述的步骤f中将挑取的克隆悬浮于100μlhbss缓冲液中，注射于裸鼠皮下，建成ctc裸鼠皮下成瘤pdx模型。

优选的，所述的步骤f中将挑取的克隆悬浮于20μlhbss缓冲液中，直接注射于裸鼠肝包膜下(或开腹暴露小部分肝脏后注入肝包膜下)，建成ctc裸鼠肝包膜下成瘤pdx模型。

优选的，所述的步骤f中将挑取的克隆悬浮于100μlhbss缓冲液中，取细胞悬液于裸鼠的尾静脉回输，建成ctc裸鼠肝癌肺转移pdx模型。

本发明优点在于：

1、本发明经实验证明，肝癌循环肿瘤细胞在本发明的温敏型生物凝胶体系中，可以进行进一步扩增生长，并增强其在免疫缺陷鼠中的成瘤能力。

2、该体系培养出的mc型克隆，在裸鼠中具有良好的肝包膜下成瘤能力(＞90％)，裸鼠皮下成瘤能力(≈60％)，和一定能力的肺部成瘤能力(≈20％)。

3、本发明为建立肝癌异种移植瘤动物模型，对肝癌的个体化治疗提供模式动物。

4、本发明制备方法简单，工艺成熟，成本较低。

附图说明

图1是5例肝癌患者肿瘤相关成纤维细胞与3例人包皮成纤维细胞表达谱分析，数据分析调用r语言中的deseq函数包，参数设置为padj＜0.01，log2(foldchange)＞2。截取高表达基因top20生成热图。

图2是悬滴法培养肝癌ctc7天后，两种不同形态ctc克隆：mc与oc。mc型表现出很强的增殖能力，在培养7天后可以形成50个以上细胞构成的细胞团，部分增殖能力较强的克隆细胞数可达10⁴数量级(图2.a)；oc型增殖能力差，一般在培养的第3天就停止生长，细胞数通常在20个以内(图2.b)外周一圈折光度不同的圆环命名为“克隆环”(白色箭头所示)，是由肝癌ctc在生长过程中分解基质胶中的ecm成分所形成。

图3是6个mc型克隆分别接种裸鼠肝包膜下3周形成的肿瘤。

图4是6个oc型克隆分别接种裸鼠肝包膜下3周，无法形成肿瘤。

图5是一例mc型克隆接种肝包膜下后形成肿瘤的he染色检测。左边是正常的肝组织，右侧是肝癌组织。

图6是两例mc型克隆裸鼠尾静脉注射后成功形成肺部转移。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组dna和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述：例如，sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《dna克隆》第i和ii卷(d.n.glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(m.j.gait编辑，1984)；《核酸杂交》(b.d.hames和s.j.higgins编辑.1984)；《蛋白质纯化：原理和实践》第2版(springer-verlag，n.y.)，以及《实验免疫学手册》i-iv卷(d.c.weir和c.c.blackwell编辑1986)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1：一例肝癌患者术前ctc培养结果

1.实验方法：

(1)抽取该患者10ml术前外周血，与hbss缓冲液1:1混合，置于50ml离心管中。在另一50ml离心管中加入10mlficoll密度梯度液，将稀释后的外周血轻轻加至密度梯度液上，使其形成明显的分层。2000rpm室温离心20min，此时液体分为4层，用3ml巴氏滴管吸取有核细胞层，加入10mlhbss缓冲液中，1000rpm离心5min收集细胞并充分去除上清，加入1mlhbss(含有2％血清)重悬细胞，并转移至5ml无菌流式管中。

(2)加入stemcellcd45阴选磁珠20μl，轻柔混匀后室温孵育15min，将其放入磁场中，静置30min，轻柔吸取全部上清，转移至新的5ml无菌流式管中，重复上述步骤一次。1000rpm离心5min收集细胞，充分去除上清，20μl磷酸盐缓冲液(pbs)重悬。

(3)800μl生物凝胶a与100μlb液和100μlc液，按已经阐明的步骤混合后，加入20μl细胞悬液，全过程在冰上操作。

(4)24孔培养板在37℃预热30min，细胞凝胶混合液按50μl/滴加至预热培养板上，使凝胶迅速转化为果冻状。之后培养板在37℃、5％co2细胞培养箱中孵育2h，使凝胶充分凝固。

(5)2h后，沿培养板孔壁缓慢加入37℃预热的培养上清1ml。

(6)连续培养7天后，10x物镜下进行克隆环拍照。

2.实验结果：

实验过程中，我们发现有活性的循环肿瘤细胞在培养48h后，会开始出现显著增殖，并部分消化周围3d基质在镜下形成折射度不同的“克隆环”(图2.a，b中白色箭头所示)。进一步的形态观察发现，这些克隆分为典型的两种形态，我们分别将其命名为“multi-cellarclone(mc)”与“oligo-cellarclone(oc)”。mc型表现出很强的增殖能力，在培养7天后可以形成50个以上细胞构成的细胞团，部分增殖能力较强的克隆细胞数可达10⁴数量级(图2.a)；oc型增殖能力差，一般在培养的第3天就停止生长，细胞数通常在20个以内(图2.b)。

实施例2：7例肝癌患者外周血mc与oc型克隆裸鼠皮下成瘤能力检测

1.实验方法：

(1)抽取该患者10ml术前外周血，与hbss缓冲液1:1混合，置于50ml离心管中。在另一50ml离心管中加入10mlficoll密度梯度液，将稀释后的外周血轻轻加至密度梯度液上，使其形成明显的分层。2000rpm室温离心20min，此时液体分为4层，用3ml巴氏滴管吸取有核细胞层，加入10mlhbss缓冲液中，1000rpm离心5min收集细胞并充分去除上清，加入1mlhbss(含有2％血清)重悬细胞，并转移至5ml无菌流式管中。

(2)加入stemcellcd45阴选磁珠20μl，轻柔混匀后室温孵育15min，将其放入磁场中，静置30min，轻柔吸取全部上清，转移至新的5ml无菌流式管中，重复上述步骤一次。1000rpm离心5min收集细胞，充分去除上清，20μl磷酸盐缓冲液(pbs)重悬。

(3)800μl生物凝胶a与100μlb液和100μlc液，按已经阐明的步骤混合后，加入20μl细胞悬液，全过程在冰上操作。

(4)24孔培养板在37℃预热30min，细胞凝胶混合液按50μl/滴加至预热培养板上，使凝胶迅速转化为果冻状。之后培养板在37℃、5％co2细胞培养箱中孵育2h，使凝胶充分凝固。

(5)2h后，沿培养板孔壁缓慢加入37℃预热的培养上清1ml。

(6)连续培养7天后，4x物镜下分别挑取两种克隆，稀释于100μlhbss缓冲液，注射于6周龄裸鼠背部皮下。3周后麻醉处死裸鼠，检查肿瘤生长情况。

2.实验结果：

挑取的45个mc型克隆中有28个成功生长出肿瘤，成瘤率62.2％，挑取的70个oc型克隆中无一成瘤。结果如表1所示。

表1是来自7例肝癌患者外周血的mc与oc克隆裸鼠皮下种植结果

实施例3：ctc裸鼠肝包膜下成瘤pdx模型建立

1.实验方法：

(1)ctc培养体系中挑取细胞克隆后悬浮于20μlhbss缓冲液中备用；裸鼠异氟烷吸入式麻醉后上腹部剪开0.4～0.5cm切口，暴露小部分肝脏，胰岛素注射器将20μl细胞悬液注入肝包膜下，缝合。2周后开腹观察成瘤状况。

(2)将肿瘤组织包埋蜡块，he染色检测：二甲苯(ⅰ)5-10min，二甲苯(ⅱ)5-10min，95％乙醇(ⅰ)1-3min，95％乙醇(ⅱ)1-3min，80％乙醇1min，蒸馏水1min，苏木精液染色5-15min，流水稍洗去苏木精液1-3s，1％盐酸乙醇1-3s，稍水洗10-30s，促蓝液返蓝10-30s，流水冲洗10-15min，蒸馏水过洗1-2s，0.5％曙红液染色1-3min，蒸馏水稍洗1-2s，80％乙醇稍洗1-2s，95％乙醇(ⅰ)3-5min，95％乙醇(ⅱ)3-5min，无水乙醇5-10min，无水乙醇5-10min，二甲苯(ⅰ)3-5min，二甲苯(ⅱ)2-5min，二甲苯(ⅲ)3-5min，中性树胶封固，显微镜检测。

2.实验结果：

6例mc型克隆种植裸鼠肝包膜下，全部形成肿瘤(图3)；6例oc型克隆种植裸鼠肝包膜下，无一形成肿瘤(图4)。he检测mc形成的肝内肿瘤，可见典型的肝癌病理形态(图5)。

实施例4：ctc裸鼠肝癌肺转移pdx模型建立

1.实验方法：

ctc培养体系中挑取细胞克隆后悬浮于100μlhbss缓冲液中备用；小鼠固定后，将取细胞悬液尾静脉回输，3周后处死小鼠，观察肺部成瘤情况。

2.实验结果：

mc和oc进行裸鼠尾静脉回输肺转移(10对)。mc全部20％；oc无一成瘤。典型的mc克隆肺部成瘤结果如图6所示。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。