一种生防用解淀粉芽孢杆菌菌株及其用途的制作方法

本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌对多种水果采后病害进行防治的生物技术领域，具体施用的是一种生防用解淀粉芽孢杆菌菌株及其在果品贮藏中的应用。

背景技术：

水果采后病害导致的巨大损耗已成为国内外关注的问题，在发达国家约有10％～30％的新鲜果品由于采后病害导致腐烂损失，在发展中国家果品的采后腐烂更为严重。目前，水果采后病害的防治方法主要有化学杀菌剂、气调贮藏、低温防病、热处理等，其中化学防腐效果最好。生物防治没有化学防腐保鲜带来的环境污染、农药残留及连续使用产生抗药性的问题，因此其成为果蔬采后病害防治的主要手段。水果采后腐败主要由霉菌等微生物污染引起，引起梨、樱桃番茄、枇杷腐败的真菌主要有青霉、链格孢菌、灰葡萄孢菌、炭疽真菌等。

芽孢杆菌是目前生防用细菌中研究较多的一类，因其能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的内生孢子，所以是理想的生防用筛选对象。其主要防治对象为丝状真菌所引起的植物病害，如番茄叶霉病(腐败菌：黄枝孢菌cladosporiumfulvum)、苹果霉心病(腐败菌：链格孢菌alternariaalternate)等。芽孢杆菌的生防用作用机制主要有营养和空间位点竞争、分泌抗菌物质(如脂肽类抗生素伊枯草菌素、生物表面活性素、丰原素和蛋白类抗菌物质)、溶菌作用、诱导抗性。

解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)为芽孢杆菌属，是一种与枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)亲缘性很高的细菌，其在生长过程中可以产生一系列能够抑制真菌和细菌活性的代谢物。2007年公布的解淀粉芽孢杆菌fzb42的全基因组测序使得人们对这种具有多种次生代谢物生产能力的芽孢杆菌有了更深层次的认识，促进了解淀粉芽孢杆菌的生物利用。然而将解淀粉芽孢杆菌菌体运用到多种水果采后的防腐保鲜的研究却鲜有报道，本发明主要是将解淀粉芽孢杆菌的不同活性成分作为保鲜剂，喷洒到多种易腐水果表面，如枇杷、梨、苹果、樱桃番茄，来观察其保鲜效果。

参考文献：

1.李红晓,张殿朋,卢彩鸽,等.2016.生防用解淀粉芽孢杆菌最新研究进展.微生物学杂志,36(2):87-92.

2.o.n.reva,c.dixelius,etal.2004.taxonomiccharacterizationandplantcolonizingabilitiesofsomebacteriarelatedtobacillusamyloliquefaciensandbacillussubtilis.femsmicrobialecology,48:249-259.

3.范青,田世平,等.2001.采摘后果实病害生物防治拮抗菌的筛选和分离.中国环境科学,21(4):313-316.

4.x.h.chen,a.koumoutsi,r.scholz,etal.2007.comparativeanalysisofthecompletegenomesequenceoftheplantgrowth-promotingbacteriumbacillusamyloliquefaciensfzb42.naturebiotechnology,25(9):1007-1014.

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种生防用解淀粉芽孢杆菌菌剂及其制备方法和具体应用。

本发明公开了一种生防用解淀粉芽孢杆菌菌株，保藏名称为解淀粉芽孢杆菌b4(bacillusamyloliquefaciensb4)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,邮编100101，保藏号为cgmccno:13466，保藏日期为2016年12月19日。

生防用解淀粉芽孢杆菌菌株经16srdna鉴定，为bacillusamyloliquefaciensb4。

所述菌株的单菌落为圆形、白色、边缘粗糙、不透明、表面略褶皱。菌株在需氧性试验结果为沿培养基表面生长，为好氧菌。

根据所绘的生防用解淀粉芽孢杆菌菌株生长曲线，解淀粉芽孢杆菌在培养4h后进入对数期，12h后逐渐进入稳定期。

所述的生防用解淀粉芽孢杆菌菌株可以用于制备防治水果(如梨、苹果、枇杷、樱桃番茄)采后腐败的芽孢杆菌菌剂。

针对不同水果，水晶梨、樱桃番茄、枇杷、苹果的采后保鲜，优选的采用含有活性成分的芽孢杆菌菌剂，活性成分分别是解淀粉芽孢杆菌的发酵液、上清液、菌悬液。

含有解淀粉芽孢杆菌的发酵液和菌悬液的生物保鲜剂的成分为，每毫升生物保鲜剂中含有解淀粉芽孢杆菌10⁷-10¹⁰个，其余分别是培养基和生理盐水。含有解淀粉芽孢杆菌的上清液的生物保鲜剂的成分为在发酵液的基础上膜过滤除菌即可。

更加优选的，解淀粉芽孢杆菌的发酵液对苹果、水晶梨、樱桃番茄、枇杷的采后腐败均有防治效果。解淀粉芽孢杆菌的菌悬液对水晶梨、苹果、枇杷的采后腐败有防治效果。解淀粉芽孢杆菌的上清液对樱桃番茄、水晶梨的采后腐败有防治效果。

各活性成分的制备过程如下：

1)解淀粉芽孢杆菌菌种在lb培养基上生长，其培养基配方为胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、氯化钠10g/l、琼脂20g/l，用0.1mol/l的naoh调节ph7.4，在121℃下灭菌20min。

2)挑取1)中适量的解淀粉芽孢杆菌加入到含有50mllb液体培养基的锥形瓶中，放置在37℃，转速为150rpm的摇床中振荡培养12-16h，然后在超净台稀释6-7倍，每个浓度取200μl菌液涂布到lb固体培养基中。

3)根据2)中测得的菌落数，将解淀粉芽孢杆菌的浓度稀释到1×10⁷-1×10¹⁰cfu/ml，即得到芽孢杆菌发酵液。

4)根据(3)中所得的发酵液，在4000g的条件下离心5min，过0.22μm无机滤膜，将上清液和沉淀分离。上清液即是芽孢杆菌上清液保鲜剂。在装有沉淀中离心管中加入等体积的无菌生理盐水，振荡均匀，再次离心洗脱，所得的菌悬液即是解淀粉芽孢杆菌的菌悬液保鲜剂。

本发明的解淀粉芽孢杆菌菌悬液和发酵液保鲜剂因含解淀粉芽孢杆菌，需在常温或者低温下储藏。

本发明施用的保鲜剂有效利用了解淀粉芽孢杆菌的不同活性成分，从而使不同水果(如枇杷、水晶梨、樱桃番茄、苹果)的采后病害的发生得到了有效抑制。

本发明的生物保鲜剂具有安全高效的特点，对环境友好，生防用效果突出，能大大降低化学杀菌剂的使用，对发展绿色农业，维护食品安全，保证社会可持续发展都有重要的意义。

附图说明

图1解淀粉芽孢杆菌的生长曲线；

图2生防用解淀粉芽孢杆菌b4与相似菌株16srdna序列的nj系统发育树；

图3枇杷、水晶梨、苹果的病斑直径和樱桃番茄的发病率。

具体实施方式

下面具体介绍含不同活性成分的解淀粉芽孢杆菌制剂防治常见水果采后腐败的方法。

(一)解淀粉芽孢杆菌对扩展青霉在pda平板上的抑制效应：

1.生防用解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensb4，其鉴定结果如图1，具有较好的体外抗青霉活性。

2.一株生防用解淀粉芽孢杆菌发酵液、菌悬液、上清液的制备

1)活化：将生防用解淀粉芽孢杆菌在lb培养基中37℃培养10h。然后重复传代培养2次，待用。

2)发酵液制备和浓度确定：用接种环挑取适量菌于盛有50mllb液体培养基的250ml锥形瓶，在150rpm，37℃的摇床中振荡培养12-16h，其生长曲线如图2所示，12h后进入了稳定期，适量稀释发酵液使得菌浓度为10⁷-10¹⁰cfu/ml，待用。

3)菌悬液和发酵液的制备：将2)中的液体在4000g的条件下离心5min，所得的上清液过0.22μm无机滤膜，所得的液体是所需的实验用上清液；在沉淀中加入等体积的无菌生理盐水，振荡均匀，再次离心清洗，所得的液体为所需的菌悬液。

3.病原菌：扩展青霉(penicilliumexpansum)，实验室保存菌株，分离于自然腐烂的柑橘，用接种环挑一环致病霉菌，接入pda试管斜面的培养基上，置于28℃培养箱中培养7d置于4℃冰箱中待用。

4.病原菌和孢子悬浮液制备：

1)活化：将扩展青霉孢子接入到pda试管斜面的培养基上，在28℃培养7d，重复传代培养2次。

2)确定浓度：分别取扩展青霉斜面一支，用接种针勾取少量菌，溶于含2ml无菌生理盐水的离心管中，将其混合均匀后，在显微镜下用血球计数板对其进行计数，扩展青霉菌悬液通过计算及稀释使其最终孢子浓度为10⁴cfu/ml。

5.生防用解淀粉芽孢杆菌和病原菌共同生长的营养培养基成分：

胰蛋白胨10g、葡萄糖10g、氯化钠5g，加无菌水定容至1l，ph自然，121℃下灭菌20min。

6.病原菌对生防用芽孢杆菌及其活性成分的体外敏感性

用1ml移液枪移取200μl上述10⁴cfu/ml的扩展青霉孢子悬液到制备好的pda培养基上，用灭菌后的涂布棒涂布均匀，待其表面干燥。将灭菌后的滤纸片分别浸泡到含解淀粉芽孢杆菌的发酵液、菌悬液、上清液中，静置2h。用灭菌后的镊子将上述滤纸片置于平板中心，将平板置于37℃下培养2～4h，待滤纸片干燥后转到25℃培养。上述解淀粉生防用芽孢杆菌的菌悬液、上清液、发酵液各做3组平行，用无菌生理盐水做对照，72h后测量抑菌圈直径，来定量分析生防用解淀粉芽孢杆菌的活性成分分别对扩展青霉的平板抑制作用。

7.结果：

实验结果如表1所示：

表1生防用解淀粉芽孢杆菌对扩展青霉的抑制作用

以上数据均是平均值±标准差(sd)，数据来源于3组重复试验。

从上述表中可以看出，在体外实验中，生防用解淀粉芽孢杆菌对扩展青霉有明显的抑制作用。

(二)上述体外效果好的生防用解淀粉芽孢杆菌的枇杷体内试验：

1.枇杷的预处理：选取无机械损伤、未感染、大小和成熟度基本一致的同一批次的枇杷12个，用0.2％次氯酸钠浸泡消毒1-2min，用自来水冲洗干净。用灭菌后的打孔器在其表面分别打3个大小相同(直径为5mm，深3mm)的伤口，分别编号为1、2、3号孔，待用。

2.向枇杷的1、2、3号伤口内分别加入20μl生理盐水、解淀粉芽孢杆菌菌悬液、罗伦隐球酵母菌悬液，其中无菌生理盐水为阴性对照，罗伦隐球酵母菌悬液为阳性对照。

3.以上处理过的枇杷伤口处干燥，取10⁴cfu/ml的扩展青霉20μl，接种在每个枇杷伤口处，将这些处理过的枇杷放在塑料筐中，用pe保鲜膜进行覆盖密封，以保持湿度，并将其置于25℃下保藏，每天定时对枇杷伤口病害发生率和病斑直径进行观察和统计，连续观察5d，结果以平均病斑直径(mm)或抑制率(％)表示。每种处理重复12个果实，整个实验重复2次以上。

4.在步骤(二)3中的2号伤口内分别加入解淀粉芽孢杆菌发酵液、解淀粉芽孢杆菌上清液，来替代之前的解淀粉芽孢杆菌的菌悬液，重复步骤(二)3、4。

5.将(二)中所用的枇杷用水晶梨、苹果、樱桃番茄来替代，重复实验(二)步骤1-4，其中樱桃番茄在步骤3中采用的是孢子浓度为10⁶个/ml的链格孢菌。

实验结果如图3所示，解淀粉芽孢杆菌b4的发酵液、菌悬液、上清液均对水晶梨采后腐败有防治效果，且b4发酵液的效果与阳性对照酵母菌悬液的生防用效果相当；解淀粉芽孢杆菌b4的发酵液、菌悬液对苹果采后腐败有防治效果，b4发酵液的防治效果与酵母菌悬液相当，而b4上清液则无防治效果；解淀粉芽孢杆菌b4的发酵液、菌悬液对枇杷采后腐败有防治效果，且b4发酵液的防治效果要优于酵母菌悬液，而b4上清液无防治效果；解淀粉芽孢杆菌b4的发酵液、上清液均对樱桃番茄采后腐败有防治效果，且上清液的防治效果要优于b4发酵液，且b4发酵液的防治效果与酵母相当，而b4菌悬液无防治效果。