一种提高微生物表面展示的有机磷水解酶的活性及稳定性的方法与流程

本发明涉及酶工程、材料科学领域，具体包括一种提高微生物表面展示的有机磷水解酶的活性及稳定性的方法。

背景技术：

微生物表面展示技术是指利用基因工程的手段将目的蛋白（外源蛋白或者蛋白结构域）与锚定蛋白融合，利用锚定蛋白与细胞表面特定区域的相互识别，使目的蛋白在微生物宿主体内表达并展示在宿主细胞表面，被展示的目的蛋白仍基本保留原有的空间结构和生物功能。该技术常用于将酶作为靶蛋白展示于细胞表面，有许多优势：外源酶锚定在细胞表面可以直接与反应液中的底物作用，从而消除了胞内酶全细胞催化过程中反应底物需越过细胞膜的过程，大幅提高反应效率；与纯酶的催化反应相比，利用微生物表面展示的酶可以简化酶分离纯化的复杂步骤，并简化酶与反应液的分离操作，大幅节省成本。目前，该技术已经被广泛应用于全细胞催化和生物传感等方面。然而，像传统的酶固定化技术一样，微生物表面展示技术会降低酶的原始活性（参考文献S. Y. Lee, J. H. Choi and Z. Xu, Microbial Cell-Surface Display. Trends in Biotechnology, 2003, 21 (1), 45−52）。

有机磷农药是全球范围内广泛使用的杀虫剂，对农业生产中的病虫害防治起着重要的作用，但是这些农药的大量长期使用对生态环境破坏相当严重。环境中残留的有机磷自然降解周期长，主要依靠生物降解作用，为了检测与治理这类污染，科研人员投入大量的精力研究具有有机磷降解作用的有机磷水解酶。有机磷水解酶（organophosphorus hydrolase，EC 3.1.8.1，简称OPH），也称磷酸三酯酶，该酶可以有效水解含有P～O、P～S等化学键的有机磷化合物，如对氧磷、对硫磷、甲基对硫磷等。目前，科研人员已实现了OPH的微生物表面展示。Tang等人在《Cell Surface Display of Organophosphorus Hydrolase for Sensitive Spectrophotometric Detection of p-Nitrophenol Substituted Organophosphates》（Enzyme and Microbial Technology，2014，55，107−112）一文中利用冰核蛋白作锚定蛋白将OPH展示在大肠杆菌（E. coli）表面。然而，有关改善表面展示的OPH的稳定性和活性的方法尚待开发。

随着材料科学的迅猛发展，生物无机杂化材料吸引了科研人员的广泛关注。经对现有文献的检索发现，通过以纯酶作模板合成生物无机杂化材料的方法，某些酶的活性和稳定性能够得到提高。Wang等人在《A New Nanobiocatalytic System Based on Allosteric Effect with Dramatically Enhanced Enzymatic Performance》（Journal of the American Chemical Society，2013，4，1272−1275）一文中以游离的漆酶作模板通过生物矿化步骤合成了漆酶-磷酸氢钙杂化材料，并阐述了当漆酶被嵌在特定的无机盐固体上时会发生变构效应，由活性较低的构型转变为活性较高的构型，从而提高了酶的活性，其稳定性也有所提高。Zare等人在《Protein-Inorganic Hybrid Nanoflowers》（Nature Nanotechnology，2012，7，428−432）一文中报道了碳酸酐酶在与三水合磷酸铜杂化后显示了高于纯酶的催化活性和稳定性。Sun等人在《Multi-Enzyme Co-Embedded Organic-Inorganic Hybrid Nanoflowers: Synthesis and Application as a Colorimetric Sensor》（Nanoscale，2014，6，255−262）一文中报道了葡萄糖氧化酶嵌在三水合磷酸铜上可增强其活性。然而，基于OPH的类似研究尚未报道。Grimsley等人在《Structural and Mutational Studies of Organophosphorus Hydrolase Reveal a Cryptic and Functional Allosteric-Binding Site》（Archives of Biochemistry and Biophysics，2005，442，169−179）一文中阐明了在离子态的二价钴离子的作用下，游离的OPH可以发生变构现象从而提高活性。然而，此研究未涉及OPH与固态的钴盐相互作用而提高其活性和稳定性的报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种提高微生物表面展示的有机磷水解酶的活性及稳定性的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种提高微生物表面展示的有机磷水解酶的活性及稳定性的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：(1) 将表面展示着有机磷水解酶的微生物加到磷酸缓冲液（pH 5.5−8.5）中并混匀；(2) 向上述混合溶液中加入含有二价钴离子的水溶液并混匀，放置一段时间后使生成的磷酸钴盐均匀分布在微生物表面，从而形成微生物-磷酸钴盐杂化材料；(3) 将上述反应液离心，去除含有未反应成分的上清液，收集沉淀，4 °C保存备用。

优选是，所述的微生物为大肠杆菌，所述的含有二价钴离子的水溶液为氯化钴，所述的磷酸钴盐为八水合磷酸钴。

本发明的效果是：

1. 本发明通过生物矿化技术和变构效应，使微生物表面展示的有机磷水解酶的活性和稳定性得到大幅提高，有利于该材料在分析化学和有机物降解等领域的应用。

2. 本发明结合了表面展示技术和生物矿化技术，制备了表面展示着有机磷水解酶的微生物-磷酸钴盐杂化材料，制备方法简单、温和、环保，无需有机稳定剂，解决了酶固定化过程繁琐的缺点，有利于该材料的大规模生产。

3. 本发明具有通用性，不仅可以用于提高其他微生物表面展示的酶的活性或稳定性，而且也可以用于制备其他无机盐（如磷酸钙，碳酸钙，磷酸铜，磷酸锌，磷酸铁）与表面展示微生物的杂化材料。

附图说明

图1为本发明实施例提供的表面展示着有机磷水解酶的微生物-八水合磷酸钴杂化材料的扫描电子显微镜照片（图A）、透射电子显微镜照片（图B、图C）和X射线能谱图（图D）。

图2为本发明实施例提供的表面展示着有机磷水解酶的微生物-八水合磷酸钴杂化材料（曲线a）和纯的八水合磷酸钴粉末（曲线b）的X射线衍射谱图。

图3为本发明实施例提供的表面展示着有机磷水解酶的微生物-八水合磷酸钴杂化材料的活性效果图。曲线a、b、c分别为以表面展示着有机磷水解酶的微生物-八水合磷酸钴杂化材料、表面展示着有机磷水解酶的微生物、无展示的微生物-八水合磷酸钴杂化材料作催化剂的反应液的的紫外-可见光谱图，曲线d为无催化剂的反应液的的紫外-可见光谱图。

图4为本发明实施例提供的表面展示着有机磷水解酶的微生物-八水合磷酸钴杂化材料（曲线a）与表面展示着有机磷水解酶的微生物（曲线b）的温度稳定性对比图。

具体实施方式

为了深入地说明本发明的内容，下面将进一步列举一些实施例，但本发明不局限于所列举的实施例。下列实施例中具体实验条件或方法如未注明，均按本领域的常规条件或方法进行。

实施例 1

表面展示着有机磷水解酶的微生物的制备：

制备方法参考文献：X. Tang, B. Liang, T. Yi, G. Manco, I. Palchetti, A. Liu, Cell Surface Display of Organophosphorus Hydrolase for Sensitive Spectrophotometric Detection of p-Nitrophenol Substituted Organophosphates. Enzyme and Microbial Technology, 2014, 55, 107−112。具体地，将锚定蛋白和OPH的基因插入到质粒中并以此转化大肠杆菌感受态细胞（E. coli BL21），将该工程菌在含有卡那霉素抗性的LB培养基中37 °C振荡培养；当培养液在600 nm的吸光度（简称OD_{600 nm}）约为0.6时，加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷诱导锚定蛋白和OPH的表达并展示于细胞表面；37 °C振荡培养10小时后，离心（转速6000 rpm，5分钟）收菌。

实施例2

表面展示着有机磷水解酶的微生物-八水合磷酸钴杂化材料的制备：

(1) 将表面展示着有机磷水解酶的E. coli（终OD_{600 nm} = 6）加到磷酸缓冲液（pH 7.4）中并混匀；(2) 向上述混合溶液中加入氯化钴水溶液（0.5 mM）并混匀，室温下放置一天后，生成的磷酸钴盐均匀分布在微生物表面，从而形成表面展示着有机磷水解酶的微生物-八水合磷酸钴杂化材料；(3) 将上述反应液离心，去除含有未反应成分的上清液，收集沉淀，4 °C保存备用，材料的数量以相应的E. coli的OD_{600 nm}记。

另做一对照实验：以无展示的E. coli替换表面展示着有机磷水解酶的E. coli，其他实验条件及步骤与上述实验相同，从而制得无展示的微生物-八水合磷酸钴杂化材料。

实施例3

表面展示着有机磷水解酶的微生物-八水合磷酸钴杂化材料的形貌和元素分析：

将上述杂化材料的悬浮液在室温下晾干后利用扫描电子显微镜、透射电子显微镜分析其形貌。图1A为杂化材料的扫描电子显微镜照片，从图中可以看出，所制备的杂化材料呈纺锤形结构，长约1 µm，直径450 nm左右，基本保持了生物矿化前的微生物细胞的尺寸。图1B、C为杂化材料的透射电子显微镜照片，该照片进一步证实了杂化材料的纺锤形结构，并且从图中可以看出，杂化材料的表面呈层状结构。

将上述杂化材料进行X射线能谱分析。如图1D所示，该材料含有Co、P、N等元素。

将上述杂化材料进行X射线衍射谱分析。如图2所示，该材料与纯的八水合磷酸钴的特征峰一致，验证了微生物表面附着的无机盐是八水合磷酸钴。

实施例4

表面展示着有机磷水解酶的微生物-八水合磷酸钴杂化材料的催化活性分析：

实验体系a：将展示着有机磷水解酶的微生物-八水合磷酸钴杂化材料、对氧磷（0.5 mM）混合于含有Co²⁺（50 μM）的磷酸缓冲液（pH 7.4）中；在37 °C下反应10分钟后，离心去除杂化材料，利用酶标仪记录其在波长为300−800 nm范围内的光谱图（见图3曲线a）。结果表明，在410 nm处出现了明显的吸收峰，这是催化反应产物对硝基苯酚的特征峰。

对照实验b：以等数量（以OD_600nm记）的展示着有机磷水解酶的微生物代替展示着有机磷水解酶的微生物-八水合磷酸钴杂化材料，在与上述实验体系同样条件下反应10分钟后记录光谱图（见图3曲线b）。结果表明，在410 nm处的最大吸光值即为实验体系a的三分之一倍左右，说明展示着有机磷水解酶的微生物在与磷酸钴杂化之后具有更强的催化活性。

对照实验c，以等数量（以OD_600nm记）的无展示的微生物代替展示着有机磷水解酶的微生物-八水合磷酸钴杂化材料，在与上述实验体系同样条件下反应10分钟后记录光谱图（见图3曲线c）。

对照实验d，无任何催化剂或材料的参与，在与上述实验体系同样条件下静置10分钟后记录光谱图（见图3曲线d）。对照实验c与对照实验d的响应曲线相似，说明八水合磷酸钴和无展示的微生物均无催化活性，从而确证了磷酸钴对微生物表面展示的有机磷水解酶活性的加强。

实施例5

温度稳定性的分析：

将展示着有机磷水解酶的微生物-八水合磷酸钴杂化材料和展示着有机磷水解酶的微生物的悬浮液分别在不同温度（4−100 °C）下孵育两周。随后，将该材料加到催化反应体系中，检测其在410 nm处的吸光值。如图4所示，微生物表面展示的有机磷水解酶在60 °C下孵育后只保留了原有活力的50%左右，而在70 °C下孵育后只保留了原有活力的10%左右；微生物表面展示的有机磷水解酶在与磷酸钴杂化之后具有更强的稳定性，在60 °C下孵育后能够保留原有活力的90%以上，而在70 °C下孵育后仍保留了原有活力的50%以上。