一种酶法水解定向制备褐藻胶寡糖的方法与流程

本发明属于褐藻胶寡糖制备技术领域，具体涉及一种酶法水解定向制备褐藻胶寡糖的方法。

背景技术：

褐藻胶寡糖(alginate oligosaccharides)是褐藻胶经水解而得到的聚合度小且水溶性好的低分子量片段。由于褐藻胶寡糖具有降血脂、抗病毒、抗肿瘤以及抗氧化等多种生理活性，可广泛应用在食品、医药及化妆品等领域，具有巨大的应用和开发价值。最新研究表明：用褐藻胶制备的聚M段寡糖药物“971”能抑制β淀粉样细胞的聚集和细胞毒性，正用于抗阿尔兹海默症的二期临床研究；聚G寡糖可与抗生素协同抑制临床多耐药致病菌。因此，组成特殊、聚合度特定的褐藻胶寡糖具有重要应用价值和经济价值，实现这类寡糖的高效制备具有重要意义。

褐藻胶寡糖的制备方法主要有酸法水解和酶法水解。酸法水解会不同程度破坏褐藻胶寡糖的结构，而酶法水解具有反应条件温和等优点，因此，酶法水解制备褐藻胶寡糖受到广泛关注。海洋微生物是褐藻胶裂解酶的重要来源，一些褐藻胶裂解酶相继从弧菌、交替单胞菌、假交替单胞菌中分离出来。但由于海洋环境的特殊性，导致海洋微生物产生的褐藻胶裂解酶活性有限、不能定向制备褐藻胶寡糖。因此，寻找专一性强、活力高的褐藻胶裂解酶仍是研究者关注的重点。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种酶法水解定向制备褐藻胶寡糖的方法，通过改造后的酶能够高效、定向地制备目标褐藻胶寡糖，解决现有技术存在的效率低、不能定向制备褐藻胶寡糖的缺点。

本发明首先提供一种酶法水解定向制备褐藻胶寡糖的方法，包括如下的步骤：

1)底物配制：将褐藻胶原料与水混合，配制成浓度为5％-8％的pH值为中性的酶解底物溶液；

2)分步酶解：加入褐藻胶裂解酶，于40-50℃下搅拌酶解1-2h，再次加入0.3％-0.8％的褐藻胶裂解酶，搅拌酶解，总酶解时间为2-4h；

3)低聚糖制备：酶解结束后，过滤或离心除去渣子，上清液浓缩、冷冻干燥得到海藻低聚糖。

上述的方法中，其中褐藻胶裂解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；

为了获得聚合度更为集中的褐藻胶寡糖，本发明对褐藻胶裂解酶进行了优化，优化后的褐藻胶裂解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3；

本发明所提供的优化的，能定向制备褐藻胶寡糖的褐藻胶裂解酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3：

MKVSCAVVLSACIASANATDNNGDGKADSIKENDLNAGYADGTYFYTAADGGMVFRCPIDGYKTSTNTSYTRTELREMLRRGDTSIATQGVNGNNWVFGSAPASAREAAGGVDGVLRATLAVNHVTTTGDSGQVGRVIVGQIHANNDEPLRLYYRKLPGHSKGSVYIAHEPNGGSDSWYDMIGSRSSSASDPSDGIALDEVWSYEVKVVGNTLTVTIFRAGKDDVVQVVDMGNSGYDVADQYQYFKAGVYNQNNTGNASDYVQVTFYALEQSHD；

编码上述褐藻胶裂解酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:4:

ATGAAAGTAAGTTGCGCTGTCGTACTGTCTGCTTGTATTGCCAGTGCCAACGCAGACAACAATGGCGATGGCAAGGCCGACTCCATCAAGGAAAATGACCTGAATGCAGGCTATGCAGATGGCACCTACTTCTATACTGCTGCCGATGGCGGCATGGTGTTCCGCTGCCCGATCGATGGCTATAAAACATCGACCAACACGTCCTATACCCGCACCGAGCTGCGCGAGATGCTACGTCGTGGCGACACCAGCATTGCCACCCAGGGGGTCAATGGAAACAACTGGGTATTCGGCTCCGCACCCGCTTCGGCACGTGAAGCAGCCGGCGGTGTCGACGGTGTTTTACGCGCAACCCTCGCGGTAAACCATGTCACCACTACCGGAGATAGCGGCCAGGTTGGACGGGTGATTGTTGGACAGATTCACGCCAACAACGACGAACCGCTGCGTCTTTACTACCGCAAGTTACCGGGCCACAGCAAAGGTTCTGTGTATATCGCCCATGAGCCAAACGGCGGCAGCGACAGCTGGTACGACATGATTGGCAGCCGTTCCAGCAGCGCCTCGGACCCGTCCGACGGTATCGCACTGGATGAAGTCTGGAGCTACGAGGTCAAGGTTGTCGGTAACACCCTCACCGTGACCATCTTCCGTGCTGGTAAAGACGATGTGGTACAGGTTGTGGATATGGGCAACAGCGGTTACGACGTCGCCGACCAGTACCAGTACTTCAAGGCCGGGGTGTACAACCAGAACAACACCGGCAATGCCAGTGACTATGTCCAGGTGACCTTCTACGCCCTGGAGCAGTCGCACGATTAA。

本发明利用基因改造的重组褐藻胶裂解酶，定向制备褐藻胶寡糖，与现有酸法水解制备褐藻胶寡糖的方法相比，克服了破坏性大、效率低的缺点，与现有的酶法水解制备褐藻胶寡糖的方法相比，运用改造的重组褐藻胶裂解酶，克服了酶解时间长、成本高、不能定向制备特定聚合度的褐藻胶寡糖的缺点。本发明过程简单、成本低且适用于工业化生产，能够在短时间内降低褐藻胶粘度，所制寡糖的总得率在90％以上。所制备的褐藻胶寡糖有抗肿瘤、抗炎、降血脂和提高免疫力等功效，可用于食品及保健品领域，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1：改造前褐藻胶裂解酶酶解产物ESI-MS图谱

图2：改造前后的基因序列比对结果图；

图3：改造后褐藻胶裂解酶酶解产物ESI-MS图谱；

图4：改造后褐藻胶裂解酶酶解产物¹C-NMR图谱；

图5：不同浓度的褐藻胶底物粘度随酶解时间的变化(A：改造前褐藻胶裂解酶降解褐藻胶粘度随时间变化；B：改造后重组褐藻胶裂解酶降解褐藻胶粘度随时间变化)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：利用改造前的褐藻胶酶裂解酶制备褐藻胶寡糖

将褐藻胶溶于由NaOH调节的pH＝7的水中，配制200mL浓度为5％的褐藻胶溶液，加入2mL褐藻胶裂解酶(氨基酸序列如：SEQ ID NO：1，核苷酸序列为SEQ ID NO：2)，于45℃温浴搅拌酶解2h，再加入2mL褐藻胶裂解酶，继续于45℃温浴搅拌酶解2h。酶解液经8000rpm离心10min，去除渣子，上清液即酶解产物。酶解产物经4倍醇沉，得到产物，产物经旋转蒸发、冷冻干燥后得到褐藻胶寡糖粗品，得率为43.9％。产物经质谱检测，结果显示，产物包括聚合度为3-10的褐藻胶寡糖(图1)。

SEQ ID NO.1：

MKVSCAVVLSACIASANASILNPGFESSFDNWVDTDPSALSGVANSGSKSAKVSGSGGRVEQEVPVSSNTNYRLTAYVRGAGTVGAQVGGSTFDSSASHSDWQPVSVEFNSGSASSITIFGSYNGGEGRFDDFALESLGTGSSSSSSSSSSSSSSGGDSCTSGSSLTIIAATDDGTNDGNGPANVLDGSFAAQSRWSSQGIKWITLDLGVPQTVQAIDIAWYKGNQRASFFEVETSADNSNWTVVLSGGQSSGTTADFERYDLADTSARYVRVTGSGNTANNWNSILEMDVIGCTESGSGSSSGGSSSGSSSSSSSSGGSSSGGSGGSSSGGSLDPNLPPSSNFDLSAWYLSVPTDNNGDGKADSIKENDLNAGYADGTYFYTAADGGMVFRCPIDGYKTSTNTSYTRTELREMLRRGDTSIATQGVNGNNWVFGSAPASAREAAGGVDGVLRATLAVNHVTTTGDSGQVGRVIVGQIHANNDEPLRLYYRKLPGHSKGSVYIAHEPNGGSDSWYDMIGSRSSSASDPSDGIALDEVWSYEVKVVGNTLTVTIFRAGKDDVVQVVDMGNSGYDVADQYQYFKAGVYNQNNTGNASDYVQVTFYALEQSHD。

SEQ ID NO.2：

ATGAAAGTAAGTTGCGCTGTCGTACTGTCTGCTTGTATTGCCAGTGCCAACGCATCCATTCTTAACCCTGGCTTTGAAAGCAGCTTTGACAACTGGGTCGACACCGATCCTTCTGCCCTTTCCGGCGTTGCTAACAGTGGCAGCAAGTCCGCAAAAGTTTCCGGTAGCGGTGGTCGCGTCGAACAGGAAGTTCCCGTCAGTTCAAACACCAATTATCGTTTGACCGCTTACGTGCGTGGGGCCGGCACCGTCGGTGCACAGGTGGGCGGATCTACGTTCGATAGCAGCGCAAGTCATTCCGACTGGCAACCGGTGTCAGTGGAGTTCAATTCCGGTAGTGCCAGCAGCATTACCATCTTCGGTAGTTATAACGGTGGCGAAGGTCGCTTCGATGATTTCGCCCTGGAGAGCCTCGGTACCGGGTCCAGCTCATCCAGCAGTTCCTCCAGCAGCTCCTCCAGTTCCGGCGGCGACAGCTGCACTTCAGGTAGCAGCCTTACCATTATTGCCGCAACGGATGATGGCACTAACGACGGTAACGGCCCGGCAAATGTACTCGACGGCAGCTTCGCGGCACAATCTCGCTGGTCCTCTCAGGGCATCAAATGGATCACGCTAGATCTCGGTGTCCCCCAAACCGTGCAGGCCATTGATATCGCATGGTACAAGGGCAACCAGCGAGCCAGCTTCTTTGAGGTCGAGACTTCGGCCGACAATAGCAACTGGACCGTGGTCCTATCTGGCGGGCAGTCGAGCGGTACCACAGCGGATTTTGAACGCTATGATCTCGCGGACACCAGCGCTCGCTATGTTCGCGTCACCGGCAGTGGCAACACCGCCAACAACTGGAACAGCATTCTGGAAATGGATGTAATCGGCTGCACGGAGAGCGGCAGCGGTTCCAGCTCTGGCGGATCCTCTTCCGGTTCCAGTAGTTCCAGCAGCAGTTCAGGTGGCAGCTCCAGCGGTGGCTCTGGCGGTTCCAGCTCGGGCGGAAGCCTCGATCCGAACCTGCCCCCGTCCAGCAACTTCGACCTGAGCGCCTGGTACCTGAGCGTGCCTACCGACAACAATGGCGATGGCAAGGCCGACTCCATCAAGGAAAATGACCTGAATGCAGGCTATGCAGATGGCACCTACTTCTATACTGCTGCCGATGGCGGCATGGTGTTCCGCTGCCCGATCGATGGCTATAAAACATCGACCAACACGTCCTATACCCGCACCGAGCTGCGCGAGATGCTACGTCGTGGCGACACCAGCATTGCCACCCAGGGGGTCAATGGAAACAACTGGGTATTCGGCTCCGCACCCGCTTCGGCACGTGAAGCAGCCGGCGGTGTCGACGGTGTTTTACGCGCAACCCTCGCGGTAAACCATGTCACCACTACCGGAGATAGCGGCCAGGTTGGACGGGTGATTGTTGGACAGATTCACGCCAACAACGACGAACCGCTGCGTCTTTACTACCGCAAGTTACCGGGCCACAGCAAAGGTTCTGTGTATATCGCCCATGAGCCAAACGGCGGCAGCGACAGCTGGTACGACATGATTGGCAGCCGTTCCAGCAGCGCCTCGGACCCGTCCGACGGTATCGCACTGGATGAAGTCTGGAGCTACGAGGTCAAGGTTGTCGGTAACACCCTCACCGTGACCATCTTCCGTGCTGGTAAAGACGATGTGGTACAGGTTGTGGATATGGGCAACAGCGGTTACGACGTCGCCGACCAGTACCAGTACTTCAAGGCCGGGGTGTACAACCAGAACAACACCGGCAATGCCAGTGACTATGTCCAGGTGACCTTCTACGCCCTGGAGCAGTCGCACGATTAA。

实施例2褐藻胶裂解酶基因的改造及重组载体的构建

针对改造前褐藻胶裂解酶酶解效率低、酶解产物分布范围广、不能定向制备目标产物，申请人再分析了褐藻胶裂解酶酶的基础上，根据褐藻胶裂解酶基因全序列设计上游引物F1和下游引物R1，用PCR扩增得到基因全序列。PCR条件为：94℃预变性3min，随后以94℃30s、55℃30s、72℃2min进行30个循环，最后在72℃延伸5min。以引物F1、R2和F2、R1分别扩增基因全序列的前54个碱基和后768个碱基，两段PCR产物用AvrⅡ酶切，用T4连接酶连接组成基因改造序列。基因改造序列和大肠杆菌表达载体pProEXHTa用EcorⅠ和HindⅢ酶切，用T4连接酶连接，热激转入大肠杆菌BL21中。筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子进行测序分析，结果表明褐藻胶裂解酶基因的全核苷酸序列全长822bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；编码274个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。改造前后的基因序列比对结果如图2。

实施例3利用大肠杆菌重组菌株生产重组褐藻胶裂解酶

挑取大肠杆菌重组菌株，接种至5mL含100ug/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃170r/min振荡培养12-16h。按2％接种量接种于50mL含100ug/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃170r/min振荡培养至OD600为0.5-0.8，加入终浓度为0.9mM的IPTG，23℃150r/min继续培养至24h。1000rpm离心10min，得到上清液胞外酶。

采用DNS法测酶活，结果显示，经基因改造后的重组褐藻胶裂解酶酶活力为29.7U/mL，是基因改造前酶活力的5.2倍。

实施例4用重组褐藻胶裂解酶生产褐藻胶寡糖

将褐藻胶溶于由NaOH调节的pH＝7的水中，配制200mL浓度为5％的褐藻胶溶液，加入0.8mL重组褐藻胶裂解酶，于45℃温浴搅拌酶解1.5h，再加入0.4mL重组褐藻胶裂解酶，继续于45℃温浴搅拌酶解1h。酶解液经8000rpm离心10min，去除渣子，上清液即酶解产物。酶解产物经4倍醇沉，得到目标产物，目标产物经旋转蒸发、冷冻干燥后得到褐藻胶寡糖粗品，得率为73.7％。

用ESI-MS测定低聚糖聚合度，ESI-MS图谱显示，酶解终产物主要为三糖、四糖和五糖(图3)。与改造前的褐藻胶裂解酶相比，改造后的重组酶能有效的降解褐藻胶，得到聚合度为3-5的目标产物。用核磁分析褐藻胶裂解酶作用方式，¹C-NMR图谱表明褐藻胶酶专一作用于聚甘露糖醛酸片段(图4)。

实施例5用褐藻胶裂解酶降低褐藻胶粘度

将褐藻胶溶于pH＝7的水中，配制成浓度为5％-8％的褐藻胶溶液，分别加入改造前和改造后的褐藻胶裂解酶，于45℃温浴搅拌酶解6h，于不同时间段观察粘度变化。结果显示，在10min内，改造后的褐藻胶裂解酶可将褐藻胶粘度即可降为原来的1/10，而改造前的褐藻胶裂解酶需1h才能将褐藻胶粘度即可降为原来的1/10(图5)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国海洋大学

<120> 一种酶法水解定向制备褐藻胶寡糖的方法

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 610

<212> PRT

<213> 1

<400> 1

Met Lys Val Ser Cys Ala Val Val Leu Ser Ala Cys Ile Ala Ser Ala

1 5 10 15

Asn Ala Ser Ile Leu Asn Pro Gly Phe Glu Ser Ser Phe Asp Asn Trp

20 25 30

Val Asp Thr Asp Pro Ser Ala Leu Ser Gly Val Ala Asn Ser Gly Ser

35 40 45

Lys Ser Ala Lys Val Ser Gly Ser Gly Gly Arg Val Glu Gln Glu Val

50 55 60

Pro Val Ser Ser Asn Thr Asn Tyr Arg Leu Thr Ala Tyr Val Arg Gly

65 70 75 80

Ala Gly Thr Val Gly Ala Gln Val Gly Gly Ser Thr Phe Asp Ser Ser

85 90 95

Ala Ser His Ser Asp Trp Gln Pro Val Ser Val Glu Phe Asn Ser Gly

100 105 110

Ser Ala Ser Ser Ile Thr Ile Phe Gly Ser Tyr Asn Gly Gly Glu Gly

115 120 125

Arg Phe Asp Asp Phe Ala Leu Glu Ser Leu Gly Thr Gly Ser Ser Ser

130 135 140

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Gly Asp Ser Cys

145 150 155 160

Thr Ser Gly Ser Ser Leu Thr Ile Ile Ala Ala Thr Asp Asp Gly Thr

165 170 175

Asn Asp Gly Asn Gly Pro Ala Asn Val Leu Asp Gly Ser Phe Ala Ala

180 185 190

Gln Ser Arg Trp Ser Ser Gln Gly Ile Lys Trp Ile Thr Leu Asp Leu

195 200 205

Gly Val Pro Gln Thr Val Gln Ala Ile Asp Ile Ala Trp Tyr Lys Gly

210 215 220

Asn Gln Arg Ala Ser Phe Phe Glu Val Glu Thr Ser Ala Asp Asn Ser

225 230 235 240

Asn Trp Thr Val Val Leu Ser Gly Gly Gln Ser Ser Gly Thr Thr Ala

245 250 255

Asp Phe Glu Arg Tyr Asp Leu Ala Asp Thr Ser Ala Arg Tyr Val Arg

260 265 270

Val Thr Gly Ser Gly Asn Thr Ala Asn Asn Trp Asn Ser Ile Leu Glu

275 280 285

Met Asp Val Ile Gly Cys Thr Glu Ser Gly Ser Gly Ser Ser Ser Gly

290 295 300

Gly Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Gly Ser

305 310 315 320

Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Ser Gly Gly Ser Leu Asp Pro

325 330 335

Asn Leu Pro Pro Ser Ser Asn Phe Asp Leu Ser Ala Trp Tyr Leu Ser

340 345 350

Val Pro Thr Asp Asn Asn Gly Asp Gly Lys Ala Asp Ser Ile Lys Glu

355 360 365

Asn Asp Leu Asn Ala Gly Tyr Ala Asp Gly Thr Tyr Phe Tyr Thr Ala

370 375 380

Ala Asp Gly Gly Met Val Phe Arg Cys Pro Ile Asp Gly Tyr Lys Thr

385 390 395 400

Ser Thr Asn Thr Ser Tyr Thr Arg Thr Glu Leu Arg Glu Met Leu Arg

405 410 415

Arg Gly Asp Thr Ser Ile Ala Thr Gln Gly Val Asn Gly Asn Asn Trp

420 425 430

Val Phe Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ala Arg Glu Ala Ala Gly Gly Val

435 440 445

Asp Gly Val Leu Arg Ala Thr Leu Ala Val Asn His Val Thr Thr Thr

450 455 460

Gly Asp Ser Gly Gln Val Gly Arg Val Ile Val Gly Gln Ile His Ala

465 470 475 480

Asn Asn Asp Glu Pro Leu Arg Leu Tyr Tyr Arg Lys Leu Pro Gly His

485 490 495

Ser Lys Gly Ser Val Tyr Ile Ala His Glu Pro Asn Gly Gly Ser Asp

500 505 510

Ser Trp Tyr Asp Met Ile Gly Ser Arg Ser Ser Ser Ala Ser Asp Pro

515 520 525

Ser Asp Gly Ile Ala Leu Asp Glu Val Trp Ser Tyr Glu Val Lys Val

530 535 540

Val Gly Asn Thr Leu Thr Val Thr Ile Phe Arg Ala Gly Lys Asp Asp

545 550 555 560

Val Val Gln Val Val Asp Met Gly Asn Ser Gly Tyr Asp Val Ala Asp

565 570 575

Gln Tyr Gln Tyr Phe Lys Ala Gly Val Tyr Asn Gln Asn Asn Thr Gly

580 585 590

Asn Ala Ser Asp Tyr Val Gln Val Thr Phe Tyr Ala Leu Glu Gln Ser

595 600 605

His Asp

610

<210> 2

<211> 1833

<212> DNA

<213> 2

<400> 2

atgaaagtaa gttgcgctgt cgtactgtct gcttgtattg ccagtgccaa cgcatccatt 60

cttaaccctg gctttgaaag cagctttgac aactgggtcg acaccgatcc ttctgccctt 120

tccggcgttg ctaacagtgg cagcaagtcc gcaaaagttt ccggtagcgg tggtcgcgtc 180

gaacaggaag ttcccgtcag ttcaaacacc aattatcgtt tgaccgctta cgtgcgtggg 240

gccggcaccg tcggtgcaca ggtgggcgga tctacgttcg atagcagcgc aagtcattcc 300

gactggcaac cggtgtcagt ggagttcaat tccggtagtg ccagcagcat taccatcttc 360

ggtagttata acggtggcga aggtcgcttc gatgatttcg ccctggagag cctcggtacc 420

gggtccagct catccagcag ttcctccagc agctcctcca gttccggcgg cgacagctgc 480

acttcaggta gcagccttac cattattgcc gcaacggatg atggcactaa cgacggtaac 540

ggcccggcaa atgtactcga cggcagcttc gcggcacaat ctcgctggtc ctctcagggc 600

atcaaatgga tcacgctaga tctcggtgtc ccccaaaccg tgcaggccat tgatatcgca 660

tggtacaagg gcaaccagcg agccagcttc tttgaggtcg agacttcggc cgacaatagc 720

aactggaccg tggtcctatc tggcgggcag tcgagcggta ccacagcgga ttttgaacgc 780

tatgatctcg cggacaccag cgctcgctat gttcgcgtca ccggcagtgg caacaccgcc 840

aacaactgga acagcattct ggaaatggat gtaatcggct gcacggagag cggcagcggt 900

tccagctctg gcggatcctc ttccggttcc agtagttcca gcagcagttc aggtggcagc 960

tccagcggtg gctctggcgg ttccagctcg ggcggaagcc tcgatccgaa cctgcccccg 1020

tccagcaact tcgacctgag cgcctggtac ctgagcgtgc ctaccgacaa caatggcgat 1080

ggcaaggccg actccatcaa ggaaaatgac ctgaatgcag gctatgcaga tggcacctac 1140

ttctatactg ctgccgatgg cggcatggtg ttccgctgcc cgatcgatgg ctataaaaca 1200

tcgaccaaca cgtcctatac ccgcaccgag ctgcgcgaga tgctacgtcg tggcgacacc 1260

agcattgcca cccagggggt caatggaaac aactgggtat tcggctccgc acccgcttcg 1320

gcacgtgaag cagccggcgg tgtcgacggt gttttacgcg caaccctcgc ggtaaaccat 1380

gtcaccacta ccggagatag cggccaggtt ggacgggtga ttgttggaca gattcacgcc 1440

aacaacgacg aaccgctgcg tctttactac cgcaagttac cgggccacag caaaggttct 1500

gtgtatatcg cccatgagcc aaacggcggc agcgacagct ggtacgacat gattggcagc 1560

cgttccagca gcgcctcgga cccgtccgac ggtatcgcac tggatgaagt ctggagctac 1620

gaggtcaagg ttgtcggtaa caccctcacc gtgaccatct tccgtgctgg taaagacgat 1680

gtggtacagg ttgtggatat gggcaacagc ggttacgacg tcgccgacca gtaccagtac 1740

ttcaaggccg gggtgtacaa ccagaacaac accggcaatg ccagtgacta tgtccaggtg 1800

accttctacg ccctggagca gtcgcacgat taa 1833

<210> 3

<211> 274

<212> PRT

<213> 3

<400> 3

Met Lys Val Ser Cys Ala Val Val Leu Ser Ala Cys Ile Ala Ser Ala

1 5 10 15

Asn Ala Thr Asp Asn Asn Gly Asp Gly Lys Ala Asp Ser Ile Lys Glu

20 25 30

Asn Asp Leu Asn Ala Gly Tyr Ala Asp Gly Thr Tyr Phe Tyr Thr Ala

35 40 45

Ala Asp Gly Gly Met Val Phe Arg Cys Pro Ile Asp Gly Tyr Lys Thr

50 55 60

Ser Thr Asn Thr Ser Tyr Thr Arg Thr Glu Leu Arg Glu Met Leu Arg

65 70 75 80

Arg Gly Asp Thr Ser Ile Ala Thr Gln Gly Val Asn Gly Asn Asn Trp

85 90 95

Val Phe Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ala Arg Glu Ala Ala Gly Gly Val

100 105 110

Asp Gly Val Leu Arg Ala Thr Leu Ala Val Asn His Val Thr Thr Thr

115 120 125

Gly Asp Ser Gly Gln Val Gly Arg Val Ile Val Gly Gln Ile His Ala

130 135 140

Asn Asn Asp Glu Pro Leu Arg Leu Tyr Tyr Arg Lys Leu Pro Gly His

145 150 155 160

Ser Lys Gly Ser Val Tyr Ile Ala His Glu Pro Asn Gly Gly Ser Asp

165 170 175

Ser Trp Tyr Asp Met Ile Gly Ser Arg Ser Ser Ser Ala Ser Asp Pro

180 185 190

Ser Asp Gly Ile Ala Leu Asp Glu Val Trp Ser Tyr Glu Val Lys Val

195 200 205

Val Gly Asn Thr Leu Thr Val Thr Ile Phe Arg Ala Gly Lys Asp Asp

210 215 220

Val Val Gln Val Val Asp Met Gly Asn Ser Gly Tyr Asp Val Ala Asp

225 230 235 240

Gln Tyr Gln Tyr Phe Lys Ala Gly Val Tyr Asn Gln Asn Asn Thr Gly

245 250 255

Asn Ala Ser Asp Tyr Val Gln Val Thr Phe Tyr Ala Leu Glu Gln Ser

260 265 270

His Asp

<210> 4

<211> 822

<212> DNA

<213> 4

<400> 4

atgaaagtaa gttgcgctgt cgtactgtct gcttgtattg ccagtgccaa cgcagacaac 60

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tataaaacat cgaccaacac gtcctatacc cgcaccgagc tgcgcgagat gctacgtcgt 240

ggcgacacca gcattgccac ccagggggtc aatggaaaca actgggtatt cggctccgca 300

cccgcttcgg cacgtgaagc agccggcggt gtcgacggtg ttttacgcgc aaccctcgcg 360

gtaaaccatg tcaccactac cggagatagc ggccaggttg gacgggtgat tgttggacag 420

attcacgcca acaacgacga accgctgcgt ctttactacc gcaagttacc gggccacagc 480

aaaggttctg tgtatatcgc ccatgagcca aacggcggca gcgacagctg gtacgacatg 540

attggcagcc gttccagcag cgcctcggac ccgtccgacg gtatcgcact ggatgaagtc 600

tggagctacg aggtcaaggt tgtcggtaac accctcaccg tgaccatctt ccgtgctggt 660

aaagacgatg tggtacaggt tgtggatatg ggcaacagcg gttacgacgt cgccgaccag 720

taccagtact tcaaggccgg ggtgtacaac cagaacaaca ccggcaatgc cagtgactat 780

gtccaggtga ccttctacgc cctggagcag tcgcacgatt aa 822