本发明属于生物制剂领域，涉及一种促生长、增强免疫作用的促生长复合多肽及其应用。
背景技术：
：生长激素（growthhormone，gh）是动物自身垂体合成分泌的具有种属特异性的单链多肽类激素，广泛存在于脊椎动物中，通过促进蛋白质合成，加速脂肪代谢，间接刺激骨的生长等促进机体生长发育。gh的分泌受其他生长因子以自分泌或旁分泌方式相互作用，共同调节。在这些生长因子中gh释放激素（ghrh）、gh释放抑制激素（ghrih）和生长激素释放肽（ghrelin）起主要调节作用，其中ghrelin和ghrh对促进下丘脑相关区域活动有协同作用，都能够刺激机体释放生长激素。ghrelin的发现是一个逆向的过程。首先报道的化学合成，是1982年由bowers等合成的生长激素释放肽-6（ghrps-6）。1993年smith等在ghrps-6的基础上合成出生长激素促分泌激素（ghss）。随着生物技术的发展，1996年howard等克隆生长激素促分泌激素相应受体（growthhormonesecretagogues，ghs-r）cdna，证明ghs-r在人、猪、牛、大鼠中高度保守。1999年kojima等通过对大鼠不同内脏器官提取物检测，从胃组织中得到最高活性的促生长激素分泌激素并纯化出由28个氨基酸残基组成具有相同活性的多肽，命名为ghrelin（ghre为原欧语，是生长的意思）。研究发现人和大鼠的ghrelin前体蛋白共117个氨基酸残基，n端的前23肽为分泌信号肽；ghrelin最小活性中心由n端前4个氨基酸片段组成，c末端的p-r（脯氨酸-精氨酸）结构为其识别部位。ghrelin具有内源性活性位点的是第三个氨基酸残基，因该氨基酸羧基被辛酰酯化，最初的研究表明辛酰酯化是ghrelin相关活性必需结构，但并非是唯一的，其他类型的酰酯化也有相应的功能。人和大鼠ghrelin第11和第12位氨基酸不同，具有89%的同源性。随着研究深入，有报道表明人类血液中非辛酰酯化的ghrelin量远大于辛酰酯化的ghrelin量，非辛酰酯化的ghrelin同样具有内分泌功能，可以促进细胞增殖。在ghrps-6氨基酸序列中第二个氨基酸trp和第五个氨基酸phe均为d型氨基酸，即d-trp和d-phe，具有生物活性。现在应用的类似ghrps-6合成肽还有六肽生长激素释放肽-2（ghrps-2），七肽生长激素释放肽-1（ghrps-1）和d-2-methyltrp取代了d-trp的衍生物hexa。已知四种ghrps氨基酸序列如下：ghrps-1:ala-his-d-betanal-ala-trp-d-phe-lys-nh2ghrps-2:d-ala-d-betanal-ala-trp-d-phe-lys-nh2ghrps-6:his-d-trp-ala-trp-d-phe-lys-nh2hexa:his-d-2-methyltrp-ala-trp-d-phe-lys-nh2smith等认为这类肽中芳香族氨基酸如trp，d-phe和末端ala，his是肽活性重要组成部分。walker等通过ghrps-6po非肠道给药和十二指肠内给药方式，通过比较对猴子、狗和大鼠体内生长激素（gh）释放活性的影响，表明ghrps-6进入肠道可促进gh释放，即ghrps-6有望作为一种代替非肠道给药的药物使用。比较这四种肽，发现都有ala-trp-d-phe-lys-nh2结构。将合成肽共有部分（awfk）整合到ghrelin序列中，取代ghrelin序列第10位到第13位的氨基酸，得到一种新的具有促生长作用的多肽。酿酒酵母（saccharomycesserevisiae），是一种单细胞真核生物，长期应用在食品工业，最早的应用可追溯到几千年前的酿酒业和面包业中，含有丰富的蛋白质、脂肪、糖类、维生素和其他代谢产物的生理性物质，是认定的gras生物（generallyrecognizedassafe）。因其在发酵过程中不产生毒素，安全可靠，成为最先使用的酵母表达系统。酿酒酵母表达外源蛋白优点在于：（1）菌体繁殖快，生长周期短，工艺简单，培养条件普通，生产成本低。（2）遗传背景清晰，基因组全序列测序早在1996年完成。（3）对表达的蛋白进行修饰，使重组蛋白结构接近天然构象，使之保持相应功能。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术中的不足而发明的一种促生长复合多肽及其应用。本发明是这样实现的：一种促生长复合多肽，其特征在于：包含ghrelin和ghrps多肽序列。所述的促生长复合多肽的氨基酸序列如sqeidno.1所示。一种促生长复合多肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1）、促生长复合多肽的设计ghrelin一级结构为：gssflspehqrvqqrkeskkppaklqpr，ghrps的共有部分一级结构为：awfk；将ghrps共有氨基酸序列置换出ghrelin序列中第10个至第13个氨基酸序列；步骤2）、重组表达载体的构建1)引物设计根据多肽序列，参照酿酒酵母偏爱密码子得到核苷酸序列，利用ncbiprimer-blast设计引物，得到引物序列如下：f:cgcgcatccggttcttctttcttgcatcc标记为酶切位点bamhir:tgcagatcatcttggttgcaactagatca标记为酶切位点xbaim1-f:cttctttcttgtctccagaacacgcttggttm1-r:ttagattcctttctttgcttgaaccaagcgtm2-f:gaaaggaatctaagaagccaccagctaagtm2-r:ttgcaacttagctggtggcttcttagattc2）pcr反应根据设计的引物，试验中分4次pcr扩增得到目的基因；具体反应条件如下：m1基因片段扩增冰上操作混匀pcr反应体系：10×pcrbuffer5μl，dntp4μl，pfu酶0.25μl，m1-f1μl，m1-r1μl，补加灭菌水达到反应体积为50μl；放入预热好的pcr扩增仪，按照以下程序进行扩增：94℃5min，94℃45s，65℃30s，72℃45s，35个循环，最后72℃10min，4℃保存；pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，反应产物琼脂糖凝胶回收，目的基因记为m1；m2基因片段扩增冰上操作混匀pcr反应体系：10×pcrbuffer5μl，dntp4μl，pfu酶0.25μl，m2-f1μl，m2-r1μl，补加灭菌水达到反应体积为50μl；放入预热好的pcr扩增仪，按照以下程序进行扩增：94℃5min，94℃45s，66℃30s，72℃45s，35个循环，最后72℃10min，4℃保存；pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，反应产物琼脂糖凝胶回收，目的基因记为m2；g基因片段扩增冰上操作混匀pcr反应体系：10×pcrbuffer5μl，dntp4μl，pfu酶0.25μl，m11μl，m21μl，补加灭菌水达到反应体积为50μl；放入预热好的pcr扩增仪，按照以下程序进行扩增：94℃5min，94℃45s，65℃30s，72℃45s，10个循环，最后72℃10min，4℃保存；pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，反应产物琼脂糖凝胶回收，目的基因记为g；gm基因片段扩增冰上操作混匀pcr反应体系：10×pcrbuffer5μl，dntp4μl，pfu酶0.25μl，f1μl，r1μl，补加灭菌水达到反应体积为50μl；放入预热好的pcr扩增仪，按照以下程序进行扩增：94℃5min，94℃45s，65℃30s，72℃45s，30个循环，最后72℃10min，4℃保存；pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，反应产物琼脂糖凝胶回收，目的基因记为gm；将pcr扩增得到的gm基因连接pmd19-t载体，转入dh5α感受态细胞中进行蓝白斑筛选和单克隆扩增；同时将pyes2载体质粒转入dh5α感受态细胞中在氨苄青霉素培养基上进行单克隆扩增；3）表达载体的构建提取pmd19-t质粒和pyes2载体质粒；同时分别用bamhi和xbai双酶切37℃条件下作用5h；琼脂糖凝胶电泳后，凝胶回收试剂盒回收酶切后的目的基因gm＇和pyes2＇载体；两种酶切后的dna片段gm＇和pyes2＇，在t4连接酶作用下37℃条件下12h；将连接产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到大小约为5.9kb的条带，记为pyes2/gm＇；将pyes2/gm＇转入dh5α中，在氨苄青霉素培养基上筛选表达载体成功转入的菌体，并进行单克隆扩增；提取质粒，测序，测序结果和正确的碱基序列比对，序列一致的质粒标为pyes2/gm；步骤3）、工程菌的表达构建质粒提取试剂盒中提pyes2/gm质粒，电转法转化到感受态酿酒酵母中，涂布sd固体培养基培养72h后，挑取一个单克隆菌落，用yepd液体培养基培养72h后，按照1%的比例接种到yepd新鲜的液体培养基进行扩大培养；步骤4）、表达产物的鉴定工程菌发酵结束后，离心分离菌体和上清液；将诱导表达促生长复合多肽的菌体和同条件下诱导的原始菌体稀释到同样体积下同等菌体数，同条件破碎，离心后经hplc检测，确定复合蛋白的表达况；步骤5）、发酵产物粗制备发酵结束后，将培养基静置，使培养物静置沉淀，过滤后得到含有复合蛋白的菌体；干燥，得到促生长复合多肽和酵母活菌混合的多肽菌粉。作为饲料添加剂添加在饲料或饮水中。本发明具有以下优点：1、本发明在酵母细胞内重组促生长肽的融合基因并表达出具有活性的促生长复合多肽，这种促生长复合多肽可以增加畜禽的抵抗力，加快畜禽生长，提高饲料利用率；2、促生长复合多肽表达菌株酿酒酵母可以直接作为饲料添加剂，可以调节胃肠菌群平衡，补充菌体蛋白，提高畜禽免疫力等作用；3、可将纯化或未纯化的促生长复合多肽直接制备成饲料添加剂，简化生产过程，缩短生产周期，降低生产成本。附图说明图1为重组促生长复合多肽载体连接过程示意图。具体实施方式实施例1：一种促生长复合多肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1）、促生长复合多肽的设计ghrelin一级结构为：gssflspehqrvqqrkeskkppaklqpr，ghrps的共有部分一级结构为：awfk；将ghrps共有氨基酸序列置换出ghrelin序列中第10个至第13个氨基酸序列；形成一种具有ghrelin和ghrps活性位点复合氨基酸多肽链。其一级结构为：gssflspehawfkqrkeskkppaklqpr，等电点为5.46，分子的量为6815da；步骤2）、重组表达载体的构建1)引物设计根据多肽序列，参照酿酒酵母偏爱密码子得到核苷酸序列，利用ncbiprimer-blast设计引物，得到引物序列如下：f:cgcgcatccggttcttctttcttgcatcc标记为酶切位点bamhir:tgcagatcatcttggttgcaactagatca标记为酶切位点xbaim1-f:cttctttcttgtctccagaacacgcttggttm1-r:ttagattcctttctttgcttgaaccaagcgtm2-f:gaaaggaatctaagaagccaccagctaagtm2-r:ttgcaacttagctggtggcttcttagattc2）pcr反应根据设计的引物，试验中分4次pcr扩增得到目的基因；具体反应条件如下：m1基因片段扩增冰上操作混匀pcr反应体系：10×pcrbuffer5μl，dntp4μl，pfu酶0.25μl，m1-f1μl，m1-r1μl，补加灭菌水达到反应体积为50μl；放入预热好的pcr扩增仪，按照以下程序进行扩增：94℃5min，94℃45s，65℃30s，72℃45s，35个循环，最后72℃10min，4℃保存；pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，反应产物琼脂糖凝胶回收，目的基因记为m1；m2基因片段扩增冰上操作混匀pcr反应体系：10×pcrbuffer5μl，dntp4μl，pfu酶0.25μl，m2-f1μl，m2-r1μl，补加灭菌水达到反应体积为50μl；放入预热好的pcr扩增仪，按照以下程序进行扩增：94℃5min，94℃45s，66℃30s，72℃45s，35个循环，最后72℃10min，4℃保存；pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，反应产物琼脂糖凝胶回收，目的基因记为m2；g基因片段扩增冰上操作混匀pcr反应体系：10×pcrbuffer5μl，dntp4μl，pfu酶0.25μl，m11μl，m21μl，补加灭菌水达到反应体积为50μl；放入预热好的pcr扩增仪，按照以下程序进行扩增：94℃5min，94℃45s，65℃30s，72℃45s，10个循环，最后72℃10min，4℃保存；pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，反应产物琼脂糖凝胶回收，目的基因记为g；gm基因片段扩增冰上操作混匀pcr反应体系：10×pcrbuffer5μl，dntp4μl，pfu酶0.25μl，f1μl，r1μl，补加灭菌水达到反应体积为50μl；放入预热好的pcr扩增仪，按照以下程序进行扩增：94℃5min，94℃45s，65℃30s，72℃45s，30个循环，最后72℃10min，4℃保存；pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，反应产物琼脂糖凝胶回收，目的基因记为gm；将pcr扩增得到的gm基因连接pmd19-t载体，转入dh5α感受态细胞中进行蓝白斑筛选和单克隆扩增；同时将pyes2载体质粒转入dh5α感受态细胞中在氨苄青霉素培养基上进行单克隆扩增；3）表达载体的构建提取pmd19-t质粒和pyes2载体质粒；同时分别用bamhi和xbai双酶切37℃条件下作用5h；琼脂糖凝胶电泳后，凝胶回收试剂盒回收酶切后的目的基因gm＇和pyes2＇载体；两种酶切后的dna片段gm＇和pyes2＇，在t4连接酶作用下37℃条件下12h；将连接产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到大小约为5.9kb的条带，记为pyes2/gm＇；将pyes2/gm＇转入dh5α中，在氨苄青霉素培养基上筛选表达载体成功转入的菌体，并进行单克隆扩增；提取质粒，测序，测序结果和正确的碱基序列比对，序列一致的质粒标为pyes2/gm；步骤3）、工程菌的表达构建质粒提取试剂盒中提pyes2/gm质粒，电转法转化到感受态酿酒酵母中，涂布sd固体培养基培养72h后，挑取一个单克隆菌落，用yepd液体培养基培养72h后，按照1%的比例接种到yepd新鲜的液体培养基进行扩大培养；步骤4）、表达产物的鉴定工程菌发酵结束后，离心分离菌体和上清液；将诱导表达促生长复合多肽的菌体和同条件下诱导的原始菌体稀释到同样体积下同等菌体数，同条件破碎，离心后经hplc检测，确定复合蛋白的表达况；检测得出发酵罐发酵培养的最大表达量达到1.3g/l；步骤5）、发酵产物粗制备发酵结束后，将培养基静置，使培养物静置沉淀，过滤后得到含有复合蛋白的菌体；干燥，得到促生长复合多肽和酵母活菌混合的多肽菌粉。实施例2：促生长复合多肽效果实验1）对保育猪促生长效果的试验选用40头体重约为30kg的健康三元杂交猪，按照公母各半的原则随机分成实验组和对照组。对照组饲喂基础日粮，不添加任何添加剂；试验组在饲喂基础日粮同时，加入促生长复合多肽菌粉日粮，添加量为基础日粮总量的0.5‰。对比饲养试验期间保证实验猪自由采食和自由饮水，并按照猪场常规方法进行饲养管理。试验先进行7d预试期，观察试验猪对实验条件的适应情况，确定适应后进行42d正式试验期。试验开始前和结束后分别停止喂料12h，对试验猪进行空腹称重。表1基础日粮配方成分含量（质量分数）玉米60%豆饼25%鱼粉1%麸皮12.5%贝壳粉0.5%骨粉0.7%食盐0.3%表2促生长复合多肽对保育猪生长性能的影响组别日增重（g/头）日均耗料（g/头）料肉比对照组424.80±21.01250±1202.95±0.13实验组453.28±29.61230±1102.72±0.14结果表明：促生长复合多肽可以有效的改善保育猪生长性能。在试验期，添加促生长复合多肽的试验组平均日增重显著高于对照组平均日增重，两组差异显著（p<0.05）。实验组和对照组平均日耗料量较接近，差异不显著（p>0.05）；料肉比实验组比对照组降低了7.8%，两者差异显著（p<0.05）。试验结果表明，添加促生长复合多肽饲料可在不改变猪采食量情况下，提高饲料转化率，提高日增重，显著促进保育猪生长。序列表<110>河南金大众生物工程有限公司<120>促生长复合多肽及其应用<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>28<212>prt<213>人工序列<400>1glyserserpheleuserprogluhisalatrpphelysglnarglys151015gluserlyslysproproalalysleuglnproarg2025当前第1页12